多囊卵巢綜合征與THADA基因多態(tài)性研究

帕孜力亞·牙生 姚 華 占 瓊 趙 靜

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種高度流行的內(nèi)分泌疾病和婦科疾病，伴有月經(jīng)不規(guī)律、不孕、肥胖、多毛、痤瘡和血生化水平異常等癥狀[1～3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球18～44歲的女性PCOS的發(fā)生率為5%～20%，且呈逐年上升趨勢[4，5]。許多研究表明遺傳因素與PCOS的病因有密切關(guān)系，經(jīng)過2期PCOS的全基因組相關(guān)性研究(genome-wide association studies，GWAS)發(fā)現(xiàn)了11個(gè)PCOS的易感位點(diǎn)與17個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)[6]，其中包括甲狀腺腺瘤相關(guān)蛋白THADA基因。

甲狀腺激素主要參與能量代謝，若甲狀腺功能障礙會(huì)干擾能量代謝[7]。THADA編碼在腎上腺髓質(zhì)、腎上腺皮質(zhì)、甲狀腺、胰腺、睪丸、胸腺、小腸和胃中表達(dá)的甲狀腺腺瘤相關(guān)蛋白，與能量代謝紊亂有關(guān)。研究表明，THADA基因可能通過減少能量產(chǎn)生并增加肥胖易感性影響PCOS的風(fēng)險(xiǎn)[7,8]。但是，確切病因仍未完全闡明。因此本研究旨在分析可能與PCOS發(fā)生相關(guān)的THADA基因多態(tài)性，為PCOS的診斷和病因?qū)W研究提供依據(jù)，為制定預(yù)防PCOS的措施奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1.研究對象：經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審核通過后，收集2018年4月～2019年10月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科門診做備孕檢查的健康備孕女性166例和同期同院生殖助孕中心的PCOS確診患者166例臨床資料及全血標(biāo)本，用iMLDR技術(shù)檢測THADA基因多態(tài)性。兩組女性年齡控制在20～35歲且均已簽署知情同意書，并排除合并糖尿病等內(nèi)分泌疾病、其他婦科疾病、合并感染者。

2.研究方法：主要包括以下兩方面：(1)通過病歷查閱的方式收集兩組女性實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)：抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estrodiol，E2)、空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)。(2)兩組女性在靜息空腹?fàn)顟B(tài)下自前臂肘正中靜脈取4ml血，用全血基因組DNA快速提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，離心柱型]提取DNA并用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行定量，檢測DNA濃度。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)以及利用國際HapMap數(shù)據(jù)庫中的中國人群基因組SNPs基因型信息(CHB)，挑選與PCOS相關(guān)的THADA基因3個(gè)位點(diǎn)，分別為rs12468394、rs13429458和rs7563201。根據(jù)目標(biāo)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(上海生工生物工程有限公司提供，表1)，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。采用改良多重高溫連接酶反應(yīng)(improve multiplex ligasedetection reaction，iMLDR)技術(shù)測定基因型。

表1 PCR引物序列

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件和SHEsis軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有研究對象進(jìn)行基因位點(diǎn)的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。PCOS組和對照組基因型和等位基因頻率的變量組間比較采用χ2檢驗(yàn)，通過Logistic回歸衡量兩組基因組分布及等位基因頻率的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。隨后用單因素方差分析去比較所研究的PCOS相關(guān)臨床指標(biāo)與相關(guān)基因位點(diǎn)的多種基因型。

結(jié) 果

1.THADA基因位點(diǎn)的Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗(yàn)：經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)顯示，THADA基因的基因型頻率分布均符合平衡定律 (P均>0.05)，而且，所選位點(diǎn)遺傳標(biāo)記在人群中的最小等位基因頻率(MAF)≥5%，由此提示，本次研究樣本來自一個(gè)穩(wěn)定的群體，收集的樣本具有較好的代表性，詳見表2。

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗(yàn)

2.THADA基因各基因型和等位基因頻率的分布比較：分析PCOS組和對照組各位點(diǎn)的基因型及基因頻率的分布，對等位基因進(jìn)行OR值和95%CI的計(jì)算，分析比較不同等位基因的分布與PCOS發(fā)生的關(guān)聯(lián)。THADA基因各位點(diǎn)的基因型和等位基因在兩組女性中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對各位點(diǎn)的等位基因納入單因素Logistic回歸分析中，發(fā)現(xiàn)各位點(diǎn)OR值的95%CI均包含1，尚不能認(rèn)為不同等位基因是PCOS的危險(xiǎn)因素，詳見表3。

表3 PCOS組和對照組各位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布的結(jié)果[n(%)]

3.THADA基因在不同遺傳模型中基因突變與PCOS易感性分析：進(jìn)一步構(gòu)建模型分析THADA基因多態(tài)性與PCOS易感性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，THADA基因3個(gè)位點(diǎn)在不同模型下兩組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表4。

4.3個(gè)基因位點(diǎn)多態(tài)性與臨床指標(biāo)之間的聯(lián)系：對兩組女性進(jìn)行THADA基因各位點(diǎn)與臨床指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)PCOS組中E2在rs12468394位點(diǎn)CC、AC、AA 3個(gè)基因型間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對照組中E2在THADA基因rs13429458位點(diǎn)AA、CA、CC 3個(gè)基因型間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表5～表7。

5.3個(gè)基因位點(diǎn)的連鎖不平衡分析：采用SHEsis軟件分析THADA基因3個(gè)位點(diǎn)的連鎖不平衡，按規(guī)定，當(dāng)D′>0.8和r2>0.33時(shí)代表所分析的兩位點(diǎn)連鎖不平衡，D′值和r2值越接近于1，說明其連鎖越明顯[9]。檢驗(yàn)結(jié)果如表8和圖1所示，THADA基因rs12468394位點(diǎn)與rs13429458位點(diǎn)、rs12468394位點(diǎn)與rs7563201位點(diǎn)、rs13429458位點(diǎn)與rs7563201位點(diǎn)間均具有較強(qiáng)的連鎖不平衡(D′≥0.85)?；谏鲜鰳?gòu)建單倍體型滿足單倍體型頻率>0.03的條件時(shí)THADA基因Block 可形成3種單倍型。經(jīng)分析，THADA基因的各單倍體型與PCOS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)未觀察到明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(P>0.05，95%CI包含1)，詳見表9。

討 論

PCOS是臨床上常見的婦科及內(nèi)分泌科疾病，近年來，雖然大量PCOS相關(guān)研究對于PCOS的診治工作做出了重大貢獻(xiàn)，但PCOS的發(fā)生率在世界范圍內(nèi)仍呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，其中各國報(bào)道的育齡期女性PCOS發(fā)生率為5%～20%[2]。我國育齡期女性PCOS發(fā)生率為5.6%[10]。因此，PCOS的研究依然是內(nèi)分泌及婦科學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn)。目前關(guān)于PCOS的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，大量研究資料顯示，PCOS的發(fā)生是多種因素綜合作用的結(jié)果，包括環(huán)境因素以及遺傳因素，遺傳因素是多因素變異累積的過程，涉及多種基因異常[11～13]。

THADA基因，也稱甲狀腺腺瘤相關(guān)蛋白，位于2號染色體短臂2p21，首次發(fā)現(xiàn)于甲狀腺瘤。THADA的遺傳變異可能改變能量消耗并導(dǎo)致體重增加，肥胖會(huì)增加胰島素抵抗。因此，THADA基因變異可能通過胰島素抵抗增加PCOS風(fēng)險(xiǎn)[6]。Ⅱ期GWAS研究結(jié)果顯示THADA基因rs12468394、rs13429458、rs12478601與漢族女性PCOS發(fā)病有關(guān)[14]。隨后一項(xiàng)家系研究進(jìn)一步證實(shí)了rs13429458與PCOS的關(guān)系[15]。國外一項(xiàng)針對歐美人的研究中rs12468394也得到了驗(yàn)證，但提示rs13429458、rs12478601并無關(guān)聯(lián)。Louwers等[16]進(jìn)行的Meta分析顯示，rs12468394、rs12478601位點(diǎn)與PCOS易感性有一定的關(guān)系，rs13429458與之無關(guān)。由于眾多研究結(jié)果不一致，因此本研究也分析THADA基因rs12468394、rs13429458及rs7563201位點(diǎn)，但以上3個(gè)位點(diǎn)在PCOS和對照組女性中比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對其進(jìn)行進(jìn)一步的分析，在3種模型下分析其與PCOS的關(guān)聯(lián)性，仍未發(fā)現(xiàn)SNP位點(diǎn)的顯著差異性，因此未得出THADA基因多態(tài)性是PCOS的危險(xiǎn)因素或保護(hù)因素的結(jié)論。得出上述結(jié)論的可能原因是這些位點(diǎn)與PCOS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)存在微效作用，而本次研究由于樣本數(shù)量不夠多，導(dǎo)致其檢驗(yàn)效能不夠強(qiáng)；但也有可能是這些位點(diǎn)的確與PCOS發(fā)生不相關(guān)。

表4 不同模型中PCOS組與對照組各基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性分析[n(%)]

表5 THADA基因rs12468394位點(diǎn)各基因型與PCOS相關(guān)因素分析[M(Q1，Q3)]

表6 THADA基因rs13429548位點(diǎn)各基因型與PCOS相關(guān)因素分析[M(Q1，Q3)]

表7 THADA基因rs7563201位點(diǎn)各基因型與PCOS相關(guān)因素分析[M(Q1，Q3)]

表8 PCOS組和對照組THADA基因多態(tài)性 位點(diǎn)連鎖不平衡檢驗(yàn)

圖1 THADA基因多態(tài)性各位點(diǎn)連鎖不平衡檢驗(yàn) 左側(cè)為D′檢驗(yàn)，右側(cè)為r2檢驗(yàn)

表9 THADA基因構(gòu)建的單倍體型在PCOS組和對照組中的分布[n(%)]

既往基因型-表型研究表明，THADA基因與脂代謝和LH、T分泌關(guān)系密切， 對PCOS臨床特點(diǎn)的改變有一定的影響，且與卵巢多囊改變的表型有關(guān)[17]。故本研究進(jìn)一步在THADA基因rs12468394、rs13429458、rs7563201這3個(gè)位點(diǎn)的不同基因型下分析兩組女性臨床檢測指標(biāo)的差異，在PCOS組中rs12468394位點(diǎn)雜合子突變CA型的E2水平低于野生型純合子CC型，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而對照組中剛好相反。分析其原因可能是該位點(diǎn)突變有可能會(huì)影響下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)功能，使E2水平降低，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步分析。

本研究也具有一定的局限性，本研究為單中心研究，且樣本例數(shù)偏少，可能出現(xiàn)患者的選擇偏倚，而且在分析相關(guān)基因型與疾病關(guān)聯(lián)時(shí)出現(xiàn)個(gè)別基因型未檢測的現(xiàn)象，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是樣本量不足所引起的偏倚。因此筆者將在后續(xù)入選病例中，完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，補(bǔ)充樣本量，對PCOS相關(guān)因素及機(jī)制進(jìn)行更全面、深入的研究。