芥菜自然發(fā)酵過程中主要化學成分的變化

田艷，趙玲艷，陳秋佳，廖安，賴燈妮，鄧放明

(湖南農業(yè)大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128)

芥菜(Brassica juncea (L.) Czern. et Coss.)屬于十字花科蕓薹屬1 年生草本植物[1]。華容大葉芥菜(HLLM)是湖南省華容縣的優(yōu)選芥菜品種，其主要特點為植株葉脈和葉片呈綠色，葉柄寬厚，質地脆嫩。高菜(Brassica juncea var. integlifolia，BJVI)屬于葉用芥菜寬柄芥變種，葉片寬大，葉脈呈紫色[2]。芥菜作為中國的特色蔬菜，分布在長江以南各省。目前，湖南省華容縣已是全國最大的葉用芥菜生產基地。2019 年，華容全縣芥菜種植面積達3 萬hm2，并形成了芥菜加工產業(yè)集群，其芥菜產品熱銷國內外[3-4]。

芥菜葉富含葉綠素、β-胡蘿卜素、抗壞血酸、鉀、鈣、膳食纖維、黃酮類和硫代葡萄糖苷(簡稱硫苷，GSL)等營養(yǎng)和生物活性物質[5-6]。近年來，芥菜的植物化學及其功能成分的研究引起了科學界的廣泛關注，但多數集中在發(fā)酵工藝優(yōu)化和揮發(fā)性物質分析[7-9]，發(fā)酵過程中的理化指標及其品質分析[10-12]，礦物質[13]、氨基酸[14-16]、總黃酮[17-18]含量分析等，尚無HLLM 和BJVI 的主要化學成分及其在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律的系統(tǒng)研究。本研究中，以新鮮及不同發(fā)酵時期的HLLM 和BJVI 為原料，測定和分析比較其水分、可溶性總糖、脂肪、蛋白質、維生素C、氨基酸態(tài)氮、膳食纖維、總酸、礦物質元素(鈣、鐵、磷)的質量分數及GSL 總量；采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(HS-SPME-GC-MS)對自然發(fā)酵過程中 HLLM 和BJVI 中的揮發(fā)性成分進行鑒定分析，旨在為探索新鮮和發(fā)酵芥菜的營養(yǎng)價值和合理利用芥菜資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試新鮮HLLM 和BJVI 來自湖南省華容縣芥菜基地。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

鮮樣處理。采摘后的HLLM 和BJVI 清洗去除表面污泥，擦去多余水分，用自封袋包裝好后，于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于測量水分、鈣、鐵、磷、總酸、維生素C 的質量分數。

干樣處理。將HLLM 和BJVI 洗凈后，分別選取整株、葉片(指不包含葉柄的葉子部位)、葉柄、莖皮和莖髓切成小段，分別真空冷凍干燥后用高速中藥粉碎機粉碎，過孔徑0.25 mm 篩，裝袋密封，于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于測量可溶性總糖、脂肪、蛋白質、氨基酸態(tài)氮、膳食纖維的質量分數和GSL 總量。

發(fā)酵樣品處理。采摘后的HLLM 和BJVI 清洗去除表面污泥，晾干，整棵放入發(fā)酵桶，每鋪1 層菜便撒1 層鹽(鹽的質量為鮮菜質量的15%)，菜和鹽鋪撒好后用重物壓住，進行自然發(fā)酵。發(fā)酵周期70 d。每隔10 d 取1 次樣。取樣后與新鮮芥菜同樣處理。

1.2.2 主要營養(yǎng)成分和GSL 總量的測定

參照文獻[19-24]的方法，測定芥菜樣品中的水分、可溶性總糖、脂肪、蛋白質、氨基酸態(tài)氮、維生素C、膳食纖維、總酸、鈣、鐵、磷的質量分數和GSL 總量。

1.2.3 揮發(fā)性成分的測定

參照文獻[7]的方法，利用 HS-SPME-GC-MS(7890B-5975C GC-MS 聯(lián)用儀為Agilent 的產品，SPME 裝置手柄、固定搭載裝置 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭為 Supelco 的產品)測定芥菜樣品中揮發(fā)性成分的相對含量。

1.3 數據處理

試驗數據運用Excel 2007 整理，利用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，采用LSD 進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 新鮮HLLM 與BJVI 中的主要營養(yǎng)成分和GSL

由表1 和表2 可知，新鮮HLLM 和BJVI 中都含有豐富的營養(yǎng)成分；BJVI 中的水分、脂肪、蛋白質、維生素 C、氨基酸態(tài)氮和磷的質量分數高于HLLM 的；HLLM 中的可溶性總糖、總酸、膳食纖維、鈣、鐵的質量分數及GSL 總量高于BJVI 的；莖皮、葉柄、莖髓、葉片中GSL 總量依次減少。

表1 新鮮HLLM 與BJVI 中的礦物質質量分數及GSL 總量Table 1 The mass fractions of mineral and total amount of GSL in fresh HLLM and BJVI

表2 發(fā)酵過程中HLLM 與BJVI 中的主要營養(yǎng)成分質量分數和GSL 總量Table 2 The mass fractions of main nutrients and total amount of GSL in HLLM and BJVI during fermentation

2.2 HLLM與BJVI發(fā)酵過程中主要營養(yǎng)成分和GSL的變化

HLLM與BJVI發(fā)酵過程中主要營養(yǎng)成分和GSL的變化情況列于表2。除含水量外，同一發(fā)酵時間，2 種芥菜發(fā)酵樣品中的營養(yǎng)成分高低與新鮮芥菜中的一致，BJVI 中的脂肪、蛋白質、維生素C、氨基酸態(tài)氮的質量分數高于HLLM 的；HLLM 中的可溶性總糖、總酸、膳食纖維的質量分數高于BJVI 的。

在發(fā)酵過程中，HLLM 和BJVI 中的含水量都呈現下降趨勢，發(fā)酵初期(0～20 d)下降速度較快，到后期下降較緩。其主要原因：在發(fā)酵初期，外界鹽濃度較高，導致細胞失水，含水量下降快；發(fā)酵后期，當芥菜細胞內外鹽濃度達到平衡，滲透壓下降，水分轉移少，含水量下降緩慢。兩者的可溶性總糖、膳食纖維、脂肪的質量分數在發(fā)酵期間都呈現下降趨勢。其主要原因：糖類在微生物發(fā)酵作用下轉化為有機酸或二氧化碳、乙醇、乳酸等，還有其他的生化反應過程也可能導致可溶性總糖的下降；發(fā)酵期間由于微生物的存在，一些膳食纖維可被微生物利用降解而產生短鏈脂肪酸及烷烴類物質，脂肪被分解產生一些脂肪酸等香味物質，從而導致了膳食纖維和脂肪質量分數的整體下降。兩者的蛋白質質量分數在發(fā)酵期間都呈現緩慢下降趨勢，這是由于在微生物的作用下，蛋白質降解為氨基酸態(tài)氮及其他香味成分，但由于高鹽條件對微生物及蛋白酶起到一定的抑制作用，蛋白質質量分數下降速度較緩。兩者的維生素C 質量分數在發(fā)酵期間都呈現下降趨勢，發(fā)酵70 d 后，2 種芥菜中維生素C 的損失率接近85%。發(fā)酵過程芥菜中水分的流失及光、熱、氧化反應等都是引起芥菜中的維生素C 損失的原因。

HLLM 和BJVI 中的總酸和氨基酸態(tài)氮質量分數在發(fā)酵期間都呈現上升趨勢。在自然發(fā)酵過程中，由于乳酸菌的作用，隨著其產酸能力的不斷增強，總酸量也不斷增加。氨基酸態(tài)氮的變化主要有2 個方面的影響：一是由于蛋白酶及微生物的作用，將蛋白質降解，從而導致氨基酸態(tài)氮量逐漸增加；二是氨基酸同時也作為微生物的營養(yǎng)成分被利用而逐漸減少。

發(fā)酵 10、20、30 d 時，BJVI 中 GSL 總量高于HLLM 的，其他發(fā)酵時間段的HLLM 中GSL 總量高于BJVI 的，兩者的GSL 總量在發(fā)酵期間都呈下降趨勢。發(fā)酵70 d 后，2 種芥菜中GSL 總量下降接近85%。發(fā)酵期間芥菜GSL 總量下降的可能原因：一是芥菜采摘及處理過程中受到的機械損傷，會導致芥菜中的 GSL 與黑芥子酶結合，GSL 降解為異硫氰酸酯、異硫氰酸鹽、腈類化合物等揮發(fā)性物質；二是加鹽腌制，芥菜中部分GSL 在鹽溶液中發(fā)生化學降解；三是發(fā)酵初期，芥菜溫度升高，造成部分GSL 的降解損失；四是微生物及其代謝產物可能引起部分GSL 降解損失。

2.3 HLLM 與BJVI 發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質的變化

HLLM 和BJVI 在發(fā)酵過程中共鑒定出93 種揮發(fā)性成分，分別為酯類、醇類、酮類、酸類、腈類、醛類、酚類、烴類、多硫化合物及其他化合物，共10 類(表3)，其中，除發(fā)酵70 d 的BJVI 外，酯類化合物異硫氰酸烯丙酯(AITC)的相對含量均最高；揮發(fā)性化合物的種類和相對含量因芥菜品種和發(fā)酵階段不同有很大差別。

表3 發(fā)酵過程中HLLM 與BJVI 中主要揮發(fā)性化合物的相對含量和種類Table 3 The relative contents and species of major volatile compounds in HLLM and BJVI during fermentation

新鮮 HLLM 中共鑒定出 7 種主要的揮發(fā)性成分，其中酯類化合物5 種，分別是AITC(92.83%)、2-苯基乙基異硫代氰酸酯(1.25%)、3-丁烯基異硫氰酸酯(1.19%)、甲基丁基異硫氰酸酯(0.49%)、異硫氰酸仲丁酯(0.34%)；醇類化合物1 種，即3-己烯-1-醇(1.44%)；腈類化合物 1 種，即丁烯腈(0.12%)。揮發(fā)性化合物的種類隨發(fā)酵時間延長不斷變化，至60 d 時，揮發(fā)性化合物種類增至最多，達31 種，增加的主要化合物為醇類、腈類、醛類化合物；但發(fā)酵到70 d 時，揮發(fā)性化合物的種類降至22 種，其相對含量也降至50.25%，尤其是AITC 大量減少。

新鮮 BJVI 中共鑒定出 11 種主要的揮發(fā)性成分，其中酯類化合物5 種，分別是AITC (85.98%)、3-丁烯基異硫氰酸酯(1.25%)、異硫氰酸-2-苯乙酯(1.30%)、甲基丁基異硫氰酸酯(0.48%)、異硫氰酸異丁酯(0.11%)；醇類化合物 2 種，分別是苯乙醇(0.05%)、葉醇(1.57%)；腈類化合物1 種，即3-苯基丙腈(0.07%)；醛類化合物1 種，即葵醛(0.04%)；多硫化合物2 種，分別是二甲基二硫(0.08%)和二甲基三硫(0.07%)。首先，揮發(fā)性化合物的種類隨發(fā)酵時間延長不斷增加，至40 d 時，化合物種類增至最多，達 40 種，增加的主要化合物為酯類、醇類、腈類、醛類、烴類化合物，之后揮發(fā)性化合物的種類隨發(fā)酵時間延長逐漸減少，70 d 時降至36 種，其相對含量也降至69.32%，尤其是AITC 大量減少。

發(fā)酵過程中，HLLM 和BJVI 中酯類物質的相對含量均隨發(fā)酵時間延長呈遞減的趨勢，發(fā)酵至70 d 時，其相對含量分別減少了65.95 和76.70 個百分點，兩者的酯類化合物種類差別不大，但HLLM 中酯類物質的相對含量均高于 BJVI 的。發(fā)酵初期以AITC 為主，其次是3-丁烯基異硫氰酸酯；發(fā)酵中后期，由于芥菜中GSL 的酶解及微生物產生生化反應等，AITC 相對含量減少，產生了異硫代氰酸丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯、2-甲基丁酸乙酯、十三烷酸甲酯、十六酸乙酯等酯類物質，賦予了發(fā)酵芥菜更豐富的酯類香味成分。

發(fā)酵過程中，由于微生物酵母菌的參與，醇類化合物的產生不可或缺，發(fā)酵50～70 d 時，2 種芥菜中醇類化合物的相對含量和種類均保持在較高水平。70 d 時，HLLM 中醇類化合物的總相對含量為 8.98%，主要為苯乙醇(4.35%)、3-己烯-1-醇(1.14%)和 3-甲基-1-丁醇(1.27%)等；而 BJVI 中醇類化合物的總相對含量高達20.31%，主要為苯乙醇(8.29%)、葉醇(2.07%)、異戊醇(2.12%)、順-2-戊烯醇(2.20%)、2-甲基-1-丁醇(1.46%)、正戊醇(3.73%)等。醇類化合物在發(fā)酵過程中占有比較重要的部分，尤其在發(fā)酵后期，醇類物質還與有機酸反應生成具有香味的酯類化合物。

HLLM 和BJVI 發(fā)酵過程中產生的酮類化合物相對較少，主要有反式β-紫羅蘭酮、4-哌啶酮、2-氮己環(huán)酮、1-乙酰基-4-哌啶酮、1-戊烯-3-酮。酮類化合物是具有甘草氣味的微生物代謝產物，但酮類化合物不穩(wěn)定，在發(fā)酵后熟過程中可能會形成相應的酸和醇，酮類化合物種類和相對含量都會減少，發(fā)酵到70 d 時，BJVI 中未檢出酮類化合物。

2 種芥菜發(fā)酵過程中檢測出的揮發(fā)性酸類化合物均較少。HLLM 發(fā)酵前期主要檢出3-羥基鄰氨基苯甲酸、乙酸、乙二酸，而在發(fā)酵后期未檢出酸類化合物；BJVI 發(fā)酵過程中產生的酸類化合物主要是2-甲基丁酸，雖相對含量較低，但整個發(fā)酵過程中呈現遞增趨勢，發(fā)酵至70 d 時，2-甲基丁酸相對含量為0.84%。酸類化合物是發(fā)酵芥菜中的一種重要滋味成分，但大部分都是以有機酸呈現，而揮發(fā)性酸含量通常較少。

HLLM 與BJVI 發(fā)酵過程中腈類化合物相對含量和種類總體呈現遞增趨勢，其中苯代丙腈是2 種發(fā)酵芥菜中都檢出的腈類化合物，發(fā)酵至70 d 時，BJVI 中苯代丙腈相對含量高達5.14%。除此之外，HLLM 發(fā)酵過程中還檢測出丁烯腈、3-丁腈、2-丁腈，BJVI 發(fā)酵過程中還檢測出4-(甲硫基)丁腈、3-苯基丙腈、4-甲基戊腈。

發(fā)酵過程中2 種芥菜的醛類化合物不斷變化，發(fā)酵至60 d 時，HLLM 和BJVI 中醛類化合物相對含量分別為5.70%和13.13%，都各自包含了11 種不同的化合物，其中壬醛相對含量較高，HLLM 和BJVI 中分別為1.80%和4.71%，還有癸醛、庚醛、苯甲醛、苯乙醛、2-己烯醛、丙烯醛等共同為芥菜貢獻甜香風味。

BJVI 發(fā)酵過程中酚類化合物的相對含量隨發(fā)酵時間延長而呈遞增趨勢。除發(fā)酵 10 d 外，BJVI中酚類相對含量均高于HLLM 的。BJVI 中主要有4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、對乙基苯酚，HLLM 中主要有2-甲氧基-4-乙烯基苯酚和2-乙基苯酚，這些酚類化合物主要是帶有苯環(huán)的芳香酚，具有香辛料和草藥的香氣。

HLLM 與BJVI 發(fā)酵過程中烴類化合物隨發(fā)酵時間延長呈不規(guī)則變化。發(fā)酵開始至50 d 時，BJVI中烴類化合物的相對含量較HLLM 中的高，主要以苯乙烯、2,2-二甲基丁烷為主。烴類物質具有特殊的香氣，但由于香氣閾值較高，對發(fā)酵芥菜風味的貢獻較小。

發(fā)酵過程中 2 種芥菜中的多硫化合物相對含量都較低，共有 4 種，主要有二甲基二硫、二甲基三硫，其中二甲基二硫具有蔬菜香，二甲基三硫具有大蒜味和焦香，對發(fā)酵芥菜的風味影響較大。

除發(fā)酵30、40 d 外，BJVI 中其他化合物的相對含量和種類均較HLLM 中高，主要以雜環(huán)化合物為主，包括5-甲基噻唑、2-甲基噻唑、1,3,5-三嗪、2-乙基-2-唑啉、2-正丙基呋喃、2,3-二氫苯并呋喃等，其中吡嗪、呋喃等具有堅果香味，對芥菜整體風味的形成具有協(xié)同作用。

3 結論與討論

HLLM 和BJVI 是湖南省華容縣腌制蔬菜加工的主要原料。本研究中，分析了HLLM 和BJVI 自然發(fā)酵過程中的主要化學成分，HLLM 與BJVI 中含有蛋白質、糖類、維生素C 和礦物質等營養(yǎng)成分，其含量基本與劉獨臣等[18]報道的四川葉用芥菜的主要營養(yǎng)成分一致。BJVI 中水分、脂肪、蛋白質、維生素C、氨基酸態(tài)氮和磷的質量分數高于HLLM的；HLLM 中可溶性總糖、總酸、膳食纖維、鈣、鐵的質量分數高于BJVI 的。

GSL 是植物的一種含硫次生代謝產物，可通過酶降解、熱降解和化學降解3 種降解途徑生成具有鮮、香、苦、辣風味的異硫氰酸酯等降解產物，是十字花科蔬菜風味和氣味形成的重要前體物質，也是十字花科蔬菜的重要生物活性成分。本研究中，HLLM 的 GSL 總量高于 BJVI 的，新鮮 HLLM、BJVI整葉中 GSL 總量分別為 50.23、46.38 μmol/g，均高于孫秀波等[25]報道的芥菜中 GSL 總量(32.17 μmol/g)，也高于大部分十字花科蔬菜的 GSL 總量(白菜類 32.26 μmol/g、蘿卜類 20.82 μmol/g)，但低于甘藍類的 GSL 總量(295.24 μmol/g)。HLLM 和BJVI 不同部位的GSL 總量存在差異，莖皮、葉柄、莖髓、葉片中GSL 總量依次減少。GSL 及其降解產物具有多種生物活性，如抗癌[26]、抗炎[27]等。基于 HLLM 和 BJVI 中含有較高的 GSL 及其降解產物，HLLM 和BJVI 不僅是風味獨特的蔬菜，還是具有一定保健功能的蔬菜，可作為制備GSL 及其降解產物的重要原料?？梢姡琀LLM 和BJVI 具有較高的食用和應用價值。

本研究中，HLLM 和BJVI 發(fā)酵過程中可溶性總糖、蛋白質、膳食纖維、脂肪、維生素C 質量分數和GSL 總量都隨發(fā)酵時間的延長而下降。HLLM和 BJVI 發(fā)酵70 d 后，維生素C 質量分數和 GSL總量下降接近85%，而總酸和氨基酸態(tài)氮質量分數則隨發(fā)酵時間的延長而增加。這是由于微生物的發(fā)酵作用和芥菜自身的生化反應，使部分物質在發(fā)酵過程中降解并轉化成其他成分，如：可溶性總糖被微生物利用轉化為有機酸；蛋白質分解后質量分數降低，而其降解產物氨基酸態(tài)氮質量分數增加[28]；烯丙基硫代葡萄糖苷等大分子硫苷降解后 GSL 總量降低。

本研究中，新鮮HLLM 中共鑒定出7 種揮發(fā)性成分，分別是異硫氰酸烯丙酯(92.83%)、2-苯基乙基異硫代氰酸酯(1.25%)、3-丁烯基異硫氰酸酯(1.19%)、甲基丁基異硫氰酸酯(0.49%)、異硫氰酸仲丁酯(0.34%)、3-己烯-1-醇(1.44%)及丁烯腈(0.12%)。這與陳艷等[29]檢測出新鮮 HLLM 中揮發(fā)性成分 5 種(異硫氰酸烯丙酯、3-丁烯基異硫氰酸酯、苯乙酸苯乙酯、異硫氰酸苯乙酯、壬醛)的報道略有差異，可能是樣品或樣品處理差異的原因。新鮮BJVI 中共鑒定出11 種揮發(fā)性成分，分別是異硫氰酸烯丙酯(85.98%)、3-丁烯基異硫氰酸酯(1.25%)、異硫氰酸-2-苯乙酯(1.30%)、甲基丁基異硫氰酸酯(0.48%)、異硫氰酸異丁酯(0.11%)、苯乙醇(0.05%)、葉醇(1.57%)、3-苯基丙腈(0.07%)、葵醛(0.04%)、二甲基二硫(0.08%)和二甲基三硫(0.07%)?？梢?，HLLM 和BJVI 由于品種不同，其揮發(fā)性成分存在差異，但異硫氰酸烯丙酯是新鮮HLLM 和BJVI 中的主要揮發(fā)性成分。這是由于未采收的芥菜中烯丙基硫代葡萄糖苷含量很高；采收后，在自身酶的作用下，烯丙基硫代葡萄糖苷就會立刻降解，產生大量異硫氰酸烯丙酯[30-32]。

HLLM 和BJVI 發(fā)酵后會產生大量揮發(fā)性成分。本研究中，從新鮮和發(fā)酵的HLLM 和BJVI 中共鑒定出10 類共93 種揮發(fā)性成分，比陳艷等[29]報道的多，但揮發(fā)性成分種類一致，包括酯類、醇類、醛類、酸類、酮類、烴類、腈類、酚類、多硫化合物和其他化合物，發(fā)酵豐富了芥菜的風味。HLLM 和BJVI 在自然發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分種類整體呈先增加后減少的趨勢，而揮發(fā)性成分的相對含量整體呈下降的趨勢。這是由于發(fā)酵前期微生物的發(fā)酵作用和芥菜自身的生化反應比較活躍，許多大分子物質降解或轉化為小分子物質，從而形成大量揮發(fā)性風味物質；發(fā)酵后期微生物的發(fā)酵作用和芥菜自身的生化反應減緩，而小分子揮發(fā)性風味物質又不斷揮發(fā)。具體的揮發(fā)性風味物質在發(fā)酵過程中種類和相對含量的變化不盡相同，HLLM 和BJVI 揮發(fā)性酯類物質相對含量整體分別減少了 65.95 和 76.70個百分點，其中異硫氰酸烯丙酯相對含量分別減少70.11 和74.66 個百分點。這是由于發(fā)酵過程中芥菜中烯丙基硫代葡萄糖苷總量減少，其降解產物異硫氰酸烯丙酯也大量減少，這也是芥菜發(fā)酵后辛辣味明顯下降的主要原因。HLLM 和BJVI 發(fā)酵過程中產生了腈類化合物苯代丙腈，這與文獻[7,10]中報道的一致。腈類化合物強烈的香氣對發(fā)酵芥菜的風味貢獻較大，主要通過異硫氰酸酯類化合物的降解反應生成[10]。揮發(fā)性醇類、酚類、酸類和腈類物質的相對含量整體呈增加的趨勢，它們是形成發(fā)酵芥菜獨特風味的重要物質。

新鮮HLLM 和BJVI 營養(yǎng)成分比較全面，GSL總量較高，是風味獨特、具有一定保健功能的蔬菜，也是加工發(fā)酵蔬菜和制備 GSL 及其降解產物的重要原料，具有較高的食用和應用價值。HLLM 和BJVI 經發(fā)酵后產生了酯類、醇類、醛類、酸類、酮類、烴類、腈類、酚類、多硫化合物和其他化合物10 類揮發(fā)性風味物質，辛辣味物質異硫氰酸烯丙酯明顯下降。發(fā)酵芥菜風味獨特、味道醇厚，其保健作用有待進一步研究。