心臟hERG 鉀通道結(jié)構(gòu)及其電壓門控調(diào)節(jié)分子機(jī)制

鄭澤群 廉姜芳

自從1994 年鑒別出了KCNH2（hERG）基因，眾多研究逐漸揭示了該基因編碼的快速激活延遲整流鉀電流（IKr）在構(gòu)成完整動(dòng)作電位中的重要地位。KCNH2 基因全長(zhǎng)包含1 159 個(gè)氨基酸，發(fā)生在不同位點(diǎn)的突變影響了通道的電壓門控特性，稱為Ⅲ類突變[1-2]。Ⅲ類突變發(fā)生在hERG 通道的不同結(jié)構(gòu)域改變了其門控動(dòng)力學(xué)，主要表現(xiàn)為通道的激活減慢或去激活加速[3-4]。因涉及復(fù)雜的通道結(jié)構(gòu)域間相互作用，理解hERG 通道在心肌復(fù)極化過程中正常的電壓門控機(jī)制，需要全面認(rèn)識(shí)不同結(jié)構(gòu)域在其構(gòu)象改變中發(fā)揮的作用。

同屬電壓門控鉀（Kv）通道的Shaker 通道為hERG 通道的結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)提供了研究基礎(chǔ)，加上定點(diǎn)突變鑒定出了調(diào)節(jié)hERG 通道構(gòu)象改變的重要結(jié)構(gòu)域以及藥物結(jié)合的高親和力位點(diǎn)，逐步奠定了hERG 鉀通道在心臟動(dòng)作電位的重要角色。近來(lái)，hERG 冷凍電鏡結(jié)構(gòu)顯示出的結(jié)構(gòu)細(xì)微差異，提示了門控機(jī)制可能涉及的新觀點(diǎn)以及藥物高敏感性的分子基礎(chǔ)[5]。由于hERG 通道各個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域都可能參與了其構(gòu)象改變的調(diào)節(jié)，無(wú)論是先天性基因突變還是藥物導(dǎo)致通道功能改變，結(jié)合定點(diǎn)突變后的功能研究與新的結(jié)構(gòu)差異性認(rèn)識(shí)，以及分子動(dòng)力學(xué)模擬等可以更好地理解潛在的復(fù)雜機(jī)制[6]，為糾正hERG 通道功能喪失帶來(lái)希望。本文就近年來(lái)心臟hERG 鉀通道結(jié)構(gòu)及其電壓門控調(diào)節(jié)分子機(jī)制的研究新進(jìn)展作一綜述。

1 動(dòng)作電位中的hERG 鉀通道

Ether-a-go-go（EAG）鉀通道家族包含ether-ago-go（eag）、eag-like（elk）和eag-related（erg）亞 家族。心臟hERG 通道也稱為Kv11.1 通道或ERG1 鉀通道，隸屬于erg 亞家族，是EAG 鉀通道家族成員之一[7-8]。hERG 基因編碼了IKr的成孔α 亞基，與KCNE2 編碼的輔助β 亞基MiRP1 共同形成完整鉀通道發(fā)揮作用。hERG 通道蛋白的生物合成順序依次是：翻譯和插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，天冬酰胺連接（N-連接）聚糖的添加，α- 亞基的四聚化以及電壓傳感器、孔域、NH2和COOH 末端的正確或自然折疊[9]。hERG 通道主要在動(dòng)作電位的平臺(tái)期及復(fù)極化階段起作用，構(gòu)成心臟復(fù)極化儲(chǔ)備的重要成分，是除復(fù)極化的鈉或鈣內(nèi)向電流外，負(fù)責(zé)心肌復(fù)極化時(shí)程最重要的外向離子流[10]。

除了先天性突變導(dǎo)致功能改變外，眾多藥物的脫靶效應(yīng)靶向hERG 通道，引起IKr電流減少，由此引發(fā)的心臟毒性有時(shí)是致命的。hERG 基因的失功能突變使其蛋白表達(dá)呈現(xiàn)單倍型不足或顯性負(fù)效應(yīng)，使IKr電流部分或完全減少，延長(zhǎng)復(fù)極化時(shí)程；同樣地，心臟毒性藥物直接結(jié)合在hERG 鉀通道高敏感芳香族氨基酸殘基位點(diǎn)（Y652、F656 等）上產(chǎn)生了直接的通道阻滯效應(yīng)[11]，或者阻礙了通道蛋白的成熟表達(dá)使電流減少，這些可表現(xiàn)為心電圖的QT 間期延長(zhǎng)，如果延長(zhǎng)超出正常范圍（男性為440 ms，女性為460 ms），臨床上稱為長(zhǎng)QT 綜合征（LQTS）[12]。專家共識(shí)表明：在先天性LQTS 中，QT 間期的長(zhǎng)度為心臟事件（包括心源性猝死）風(fēng)險(xiǎn)的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)，并且當(dāng)使用延長(zhǎng)QT 間期的藥物（如索他洛爾或多非利特）時(shí)，QT 間期≥500 ms 時(shí)應(yīng)減少或終止藥物使用[13]。QT 間期的過度延長(zhǎng)促使早后除極的發(fā)生，并可能觸發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速甚至心室顫動(dòng)[14]。

2 hERG 鉀通道結(jié)構(gòu)

hERG 通道與其他Kv 通道具有結(jié)構(gòu)同源性[15]。不同的是，4 個(gè)hERG 亞基在膜上呈環(huán)狀而非線性排列[16]。IKr通道四聚體的每個(gè)亞基包含6 個(gè)跨膜片段（S1-S6），N 端Per-Arnt-Sim（PAS）域和C 端環(huán)狀核苷酸結(jié)合域（cNBD）[7，17]。S1-S4 作為電壓感應(yīng)域（VSD），有多個(gè)帶正電的殘基，感受跨膜電壓變化，其中尤以S4 最重要。而S1-S3 含一些帶負(fù)電荷的氨基酸，被認(rèn)為是整個(gè)VSD 的抵消電荷。4 個(gè)以正方形排列的跨膜螺旋S5-S6 是構(gòu)成通道孔區(qū)（PD）的重要結(jié)構(gòu)，通過與4 個(gè)亞基的中間孔環(huán)耦聯(lián)形成圍繞中心傳導(dǎo)途徑的四聚體結(jié)構(gòu)，并構(gòu)成離子滲透孔結(jié)構(gòu)域[7，18]。S4 和S5 之間的連接部分稱為S4-S5接頭，將VSD 感受到的電壓變化信息傳遞到PD，起到重要的橋梁作用（圖1）。N 端PAS 域和PAS-Cap一起被稱為“Eag 域”。據(jù)報(bào)道，Eag 域在穩(wěn)定hERG亞基組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)中至關(guān)重要[19]。此外，該結(jié)構(gòu)域還參與了hERG 通道門控動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)[20-21]。

近來(lái)，電壓門控鉀通道的冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結(jié)構(gòu)引起了極大的關(guān)注。先是hERG 同源家族Eag1（Kv10.1）結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)去除了C 端非結(jié)構(gòu)化的114 個(gè)殘基（773～886）。這種高達(dá)3.78 A分辨率的結(jié)構(gòu)被稱為rEag1Δ，它保持了與全長(zhǎng)通道相似的所有特性[15]。之后的hERG cryo-EM 結(jié)構(gòu)（hERGT）刪除了兩個(gè)片段（N 端141-350 和C 端871-1005），剩下的814 個(gè)氨基酸殘基同樣與通道擁有類似的主要門控特性（圖1）。hERGT結(jié)構(gòu)的分辨率高達(dá)3.8 A，顯示出了與先前結(jié)構(gòu)的細(xì)微差異，它的S4-S5 接頭與rEag1Δ 結(jié)構(gòu)一樣，是一個(gè)含有5 個(gè)殘基的短環(huán)[5]。不同于Shaker Kv 通道，該結(jié)構(gòu)S4 螺旋僅有5 個(gè)正電荷的氨基酸，且前3 個(gè)K1、R2和R3 位于胞外，而R4 和R5 在下方，提示以S4 為主的VSD 處于去極化的激活狀態(tài)[22]。此外，hERGT中的孔區(qū)處于開放狀態(tài)，并且通道中央腔的體積非常小，中央腔周圍有4 個(gè)深的細(xì)長(zhǎng)的疏水性口袋，藥物敏感性的氨基酸正好排列在這些口袋表面上，經(jīng)典的hERG 通道阻滯劑阿司咪唑和多非利特在進(jìn)入狹小的中央腔后嵌入到口袋中，這對(duì)于解釋藥物對(duì)hERG 通道的異常敏感性可能有用[5，23]。

cryo-EM 結(jié)構(gòu)提供了完整的通道結(jié)構(gòu)的開創(chuàng)性見解，但其對(duì)于通道在胞內(nèi)的固有結(jié)構(gòu)域的原子分辨率細(xì)節(jié)的推導(dǎo)是有限的。分辨率為1.5 A 的第1 個(gè)hERG 通道高分辨率晶體結(jié)構(gòu)鑒別出了新的鹽橋（E807-R863），這并未在cryo-EM 結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)，電生理學(xué)分析表明該鹽橋可能既支持了內(nèi)在配體的空間組織，又維持了細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜界面[24]。

圖1 心臟hERG 鉀通道在細(xì)胞膜上的單個(gè)α 亞基（A），冷凍電鏡結(jié)構(gòu)刪除了N 端（Δ141-350）和C 端（Δ871-1005）部分氨基酸序列（B）

3 hERG 通道電壓門控及其分子機(jī)制

3.1 hERG 通道電壓門控 同其他Kv 通道一樣，hERG 通道具有3 種不同的構(gòu)象，分別是閉合、開放和失活[11，16-17]。但hERG 也有其獨(dú)特的門控動(dòng)力學(xué)，即快速的失活及從失活中恢復(fù)，而激活和去激活則相對(duì)緩慢[11，17]。也就是說(shuō)，hERG 通道的滅活性質(zhì)比活化更活躍，這導(dǎo)致了其向內(nèi)整流特性[25]。

在動(dòng)作電位的早期，hERG 通道緩慢打開，但迅速失活。隨著去極化電壓的持續(xù)降低，通道逐漸從失活中恢復(fù)。當(dāng)膜電位為-40 mV 時(shí)，跨膜電流達(dá)到峰值。IKr電流在復(fù)極化過程中逐步升高，隨后是通道緩慢的去激活過程（圖2）?？梢姡ǖ涝谡麄€(gè)動(dòng)作電位時(shí)程中經(jīng)歷了激活、失活、再激活及去激活狀態(tài)，且通道在靜息電位以下仍保持很長(zhǎng)一段時(shí)間的打開狀態(tài)（200～300 ms），產(chǎn)生了典型的尾電流[11，26]。尾電流的分析和繪制激活曲線對(duì)于研究通道打開、關(guān)閉和失活的動(dòng)力學(xué)非常有幫助。通道性質(zhì)的改變會(huì)導(dǎo)致激活曲線向左或向右移動(dòng)，尾電流衰減過程變得更快或更慢。

圖2 心臟hERG 鉀通道電壓門控（動(dòng)作電位早期，hERG 激活后然后快速失活，隨后在復(fù)極化時(shí)再次快速激活，之后是緩慢的去激活過程產(chǎn)生了經(jīng)典的尾電流）

3.2 hERG 通道門控的分子機(jī)制 hERG 通道不同構(gòu)象變化的調(diào)節(jié)十分復(fù)雜，因?yàn)閹缀跛薪Y(jié)構(gòu)域都參與了這種調(diào)節(jié)。因此，很難闡明門控動(dòng)力學(xué)的確切機(jī)制。研究證實(shí)：包括C 端和N 端的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域在hERG 通道門控調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，它們可能通過PAS 域與不同亞基中cNBD 域之間的相互作用而產(chǎn)生效應(yīng)，稱為PAS/cNBD 復(fù)合物[17，26-27]。這種不同亞基的不同結(jié)構(gòu)域之間的物理作用，通過進(jìn)一步的耦聯(lián)能夠產(chǎn)生電活動(dòng)，是電壓門控鉀通道的不同構(gòu)象變化的經(jīng)典解釋。但是，在近來(lái)的研究中這種機(jī)-電耦聯(lián)模式遭到了質(zhì)疑。

3.2.1 激活 hERG 通道的激活過程很慢，其電壓閾值為-40 mV 至-30 mV，在+20 mV 至+40 mV 達(dá)到平臺(tái)。緩慢激活的生理學(xué)意義是使通道的使用最小化以促進(jìn)去極化的完成[17]。一般認(rèn)為，VSD 中的結(jié)構(gòu)重排通過S4-S5 接頭與S6 螺旋的胞質(zhì)末端之間的物理作用轉(zhuǎn)移至PD，從而打開和關(guān)閉激活門，稱為VSD/PD 耦合機(jī)制[7，17-18，28-29]。這種模式的基礎(chǔ)是S4 帶正電的殘基感應(yīng)了跨膜電場(chǎng)施加的力而發(fā)生移動(dòng)，成為導(dǎo)致孔區(qū)構(gòu)象變化的驅(qū)動(dòng)力[30]。此外，S4的緩慢移動(dòng)也可能解釋了緩慢的激活。然而，切斷了S4-S5 接頭從而打斷了VSD 與PD 的聯(lián)系并沒有改變通道的激活動(dòng)力學(xué)[31]。通過在VSD 與PD 間的S4-S5 接頭的不同位點(diǎn)插入熒光非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸標(biāo)記的研究表明：S4-S5 接頭運(yùn)動(dòng)與S6 運(yùn)動(dòng)沒有關(guān)聯(lián)，但通道仍正常打開[29]。

hERGT結(jié)構(gòu)同樣對(duì)VSD/PD 模式提出了質(zhì)疑。如前所述，S4-S5 接頭是一個(gè)含有5 個(gè)殘基的短環(huán)，無(wú)法充當(dāng)機(jī)械杠桿因而并未進(jìn)行域交換，它與S6段C 末端之間的相互作用發(fā)生在同一亞基中，并不涉及另一個(gè)相鄰的亞基[5]。但是，即使是在包含有2個(gè)α 螺旋的相當(dāng)長(zhǎng)的S4-S5 的小電導(dǎo)鈣激活的鉀通道中，非域交換的架構(gòu)仍然存在[32]；并且即使沒有明顯的S4-S5 接頭或只有一個(gè)短的S4-S5 接頭，域交換也可以發(fā)生[33]。與經(jīng)典的Kv 通道相比，這種非域交換結(jié)構(gòu)表明VSD 的運(yùn)動(dòng)作為通道開口的機(jī)制有所不同。此外，S4 螺旋中的電荷重排表明VSD 處于去極化狀態(tài)下也可能進(jìn)一步改變了其對(duì)門控特性的影響?；谛碌慕Y(jié)構(gòu)差異，研究人員提出了VSD/PD 的另一種模式，表明S4 直接與C 端接頭相互作用造成S6 的彎曲和松弛，而并不需要S4-S5接頭的作用。S6 的彎曲和松弛是由S4 的不同狀態(tài)引起的，在VSD 處于去極化狀態(tài)時(shí)，S4-S5 接頭與S6 的細(xì)胞內(nèi)部分相互作用從而將S4 的C 端引向C端接頭，引起S6 松弛打開通道，相反，超極化狀態(tài)下的VSD 造成S6 彎曲關(guān)閉了孔門[5，15，23]。

綜上，VSD/PD 耦合機(jī)制并不能簡(jiǎn)單地解釋通道緩慢的激活，雖然新的模式提供了可能的解釋，但確切的VSD 的構(gòu)象狀態(tài)與激活門控間的關(guān)系仍有待證實(shí)。并且，如前所述，cryo-EM 對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)外圍的分辨率通常較低，這阻礙了對(duì)側(cè)鏈構(gòu)象的明確鑒定和對(duì)通道功能特征的精確建模[9，34]。因此，進(jìn)一步的分子動(dòng)力學(xué)模擬可能是一種有效的工具來(lái)支持上述假說(shuō)。

3.2.2 失活 hERG 通道緩慢激活后，在復(fù)極化階段出現(xiàn)異?？焖俚氖Щ钸^程，在+60 mV 處通道能夠在1～2 ms 內(nèi)失活[17]。hERG 通道的失活本質(zhì)上是P/C 型的，因?yàn)樗⒉皇躈 端缺失的影響。與其他K+通道一樣，hERG 失活涉及選擇性過濾器（SF）中一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的K+占位丟失[35]。這種類型的失活對(duì)SF 中的離子占有率很敏感，表明失活可能涉及SF 的結(jié)構(gòu)重排。不同于其他Kv 通道，hERG通道位于PD 上的SF 部分殘基并不保守，且具有一些輕微的序列差異，這些殘基使SF 更容易發(fā)生構(gòu)象變化進(jìn)而導(dǎo)致失活[36]。功能研究也證實(shí)位于SF殘基的特定突變可能會(huì)改變hERG 通道的失活特性[37]。結(jié)合cryo-EM 獲得的通道結(jié)構(gòu)現(xiàn)實(shí)模型和計(jì)算機(jī)模擬，將KCNH2 基因組信息與功能結(jié)果聯(lián)系起來(lái)，新的研究為位于SF 的功能獲得突變N629D（影響失活及離子轉(zhuǎn)運(yùn)）如何影響K+的選擇性滲透提供了新的見解[38]。最近，對(duì)S5 螺旋上的滅活減弱I560T突變的研究表明：S5 螺旋的構(gòu)象干擾很可能通過與孔螺旋的相互作用而與SF 相關(guān)聯(lián)[39]。在分子動(dòng)力學(xué)模擬中，SF 中的幾個(gè)殘基在孔軸中發(fā)生了位移，尤其是GFG 基序中的F627[40]。

F627 的位置特殊性在cryo-EM 結(jié)構(gòu)下得到證實(shí)，hERGT中F627 的方向是偏移的。Wang 等[5]還構(gòu)建了非滅活的S631A 突變體的結(jié)構(gòu)hERGTs S631A 來(lái)模擬其他Kv 通道的非瞬時(shí)失活，結(jié)果顯示其SF 中F627 的位置同其他Kv 通道相似。F627的獨(dú)特位置代表了SF 構(gòu)象的細(xì)微差別，提示可能通過調(diào)節(jié)單個(gè)殘基引起hERG 快速失活。同時(shí)，他們強(qiáng)調(diào)SF 的構(gòu)象變化十分細(xì)微，當(dāng)觀察到K+從SF中流出時(shí)，它不同于KcsA K+通道那樣發(fā)生較大的構(gòu)象變化[5，22]。

3.2.3 去激活 快速的從失活中恢復(fù)之后，hERG通道經(jīng)歷了緩慢去激活。去激活代表了hERG 通道的關(guān)閉過程，是其重要的標(biāo)志性特征。去激活的調(diào)控非常復(fù)雜，并無(wú)法用VSD 的緩慢移動(dòng)來(lái)解釋。N端Cap 結(jié)構(gòu)域（N-Cap）、PAS 和cNBD 間的相互作用對(duì)于調(diào)節(jié)緩慢去激活十分重要[41-42]。N-Cap 的突變加速了通道的去激活[42]，而PAS 和cNBD 之間的直接相互作用決定了緩慢的去激活，特別是在PAS的R56 和cNBD 的D803 之間以及N-Cap 的N12和cNBD 的E788 之間的作用[20]。這些結(jié)果表明在去激活的調(diào)節(jié)過程中，PAS/cNBD 復(fù)合物占據(jù)著中心地位，而包含N-Cap 和PAS 的Eag 域尤為突出。

hERGT結(jié)構(gòu)也進(jìn)一步證明N 端確實(shí)整合在VSD/PD 界面上，表明N 端PAS 域在緩慢的去激活過程中可能會(huì)向質(zhì)膜移動(dòng)以改變VSD/PD 的相互作用[43]。最近，研究表明VSD 的弛豫是導(dǎo)致hERG 通道緩慢去激活門控的原因之一[17，44]。弛豫現(xiàn)象是VSD 的固有屬性，它是在hERG 通道激活后將激活的VSD 穩(wěn)定在松弛的構(gòu)象中。這種弛豫會(huì)導(dǎo)致通道激活和去激活路徑的能量分離，從而產(chǎn)生磁滯現(xiàn)象進(jìn)而調(diào)節(jié)去激活門控[44]。hERG 通道VSD 弛豫的動(dòng)力學(xué)模型也表明VSD 弛豫狀態(tài)的不穩(wěn)定可能會(huì)加速去激活過程。

調(diào)控hERG 通道的去激活門控動(dòng)力學(xué)似乎更加重要，因?yàn)闊o(wú)論是通道的阻滯劑還是激活劑，通過作用于相應(yīng)的結(jié)構(gòu)域改變了這一過程均可能產(chǎn)生致病或治療效應(yīng)。而基于更加詳細(xì)的關(guān)于Eag 域、VSD 以及VSD/PD 之間的作用可能有益于開發(fā)更加有效的通道激活劑。

4 結(jié)語(yǔ)

參與調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的鉀通道種類繁多，hERG 鉀通道因其在心肌復(fù)極化過程中的重要角色而備受重視。隨著研究不斷深入，新的hERG 通道結(jié)構(gòu)顯示出與既往經(jīng)典結(jié)構(gòu)的細(xì)微差異，結(jié)合精確的動(dòng)力學(xué)模型為解釋通道的門控動(dòng)力學(xué)機(jī)制提供了新的觀點(diǎn)。這些成果提供了進(jìn)一步的證據(jù)說(shuō)明hERG 鉀通道在心肌細(xì)胞電活動(dòng)中的重要地位以及藥物對(duì)該通道的高度親和力的原因，并且將在開發(fā)針對(duì)通道阻滯的糾正劑中有所裨益。