多變魚腥藻ATCC 29413基因的一步插入失活

雷棋琴 戢水玲 黃任衡 高 宏 徐旭東 孔任秋

(1.中國科學院水生生物研究所中國科學院藻類生物學重點實驗室,武漢 430072;2.中國科學院大學,北京 100049)

多變魚腥藻(Anabaena variabilis)ATCC 29413是一種淡水絲狀藍藻,在缺氮條件下藻絲中一些間隔分布的營養(yǎng)細胞分化為異形胞進行固氮;在干旱等極端環(huán)境下還可以分化形成厚壁孢子。該藻株不僅可以利用光合作用進行自養(yǎng)生長,也能利用果糖作為碳源和能源在完全黑暗條件下異養(yǎng)生長;其最適生長溫度為30℃,但在40℃高溫條件下生長狀態(tài)良好,屬于中等嗜熱型藻[1]。利用絲狀藍藻的接合轉移系統(tǒng),多變魚腥藻ATCC 29413高溫衍生株可以進行遺傳操作,利用同源重組得到特定基因的突變株[2—6]。

具有異養(yǎng)生長能力的藍藻依靠單糖或雙糖作為碳源[7—10],在光合作用、光合膜的發(fā)生等有關基因被失活時仍然能夠生長,為研究這些基因的功能提供了便利;作為光合細胞工廠,用于生產(chǎn)各種高價值化學品和生物燃料,也具有一定優(yōu)勢[11]。然而,多變魚腥藻ATCC 29413的接合轉移效率很低,影響了研究工作的開展。我們對該藻株已發(fā)表的基因組序列進行分析發(fā)現(xiàn),其含有兩套Ⅱ型限制修飾系統(tǒng),包括AvaⅠ/M.AvaⅠ和AvrⅡ/M.AvrⅡ。這兩種限制酶的存在可切斷進入細胞的外源DNA,妨礙接合子的形成。過去所用的絲狀藍藻接合轉移系統(tǒng)中的輔助質粒pRL623上缺少甲基化酶M.AvrⅡ基因,可能與難以構建多變魚腥藻突變株有關[12,13]。為了克服藻株的限制酶對外源DNA的破壞,本研究克隆了該藻株自身的兩個甲基化酶基因,構建了新的輔助質粒。利用該質粒對多變魚腥藻ATCC 29413兩個基因進行了插入失活,均實現(xiàn)了一步獲得同源雙交換子,比通常在絲狀藍藻敲除基因節(jié)省一半時間。

1 材料與方法

1.1 藻種、菌種及培養(yǎng)方法

多變魚腥藻ATCC 29413高溫衍生株由美國南達科塔州州立大學周阮寶教授惠贈。藻株接種在稀釋8倍的AA液體培養(yǎng)基(AA/8)[14]或BG-11固體培養(yǎng)基[15]生長,接合轉移時固體培養(yǎng)基中添加5 mmol/L的果糖,突變藻株的培養(yǎng)基中補加10 μg/mL的紅霉素(Em)。在(30±1)℃、30 μE/(m2·s)持續(xù)光照條件下靜置培養(yǎng),通過測定A730來監(jiān)測其生長,待藻細胞到達對數(shù)期時用于實驗。大腸桿菌(Escherichia coli)在37℃的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),含有質粒的大腸桿菌根據(jù)所帶抗性基因補加50 μg/mL壯觀霉素(Sp)、氨芐青霉素(Ap)、卡那霉素(Km)、10 μg/mL的氯霉素(Cm)或10 μg/mL四環(huán)素(Tc)。

1.2 藍藻基因組提取和PCR反應

藍藻基因組提取和PCR反應參照文獻[16],引物合成和序列分析在武漢天一輝遠生物科技有限公司進行。

1.3 質粒的構建

DNA重組按Molecular Cloning[18]描述的方法進行。限制性內切酶、連接酶、質粒pMD18-T購自大連寶生物工程有限公司。質粒pHB518(GenBank登錄號EF688562.1)和pHB576(GenBank 登錄號EF688561.1)是本實驗室前期構建的載體。pDS4101[2]、pRL443[2]、pRL623[13]、pRL277(GenBank 登錄號L05082.1)和pACYC184(GenBank 登錄號X06403.1)由美國密歇根州立大學Peter Wolk教授惠贈。

輔助質粒的構建根據(jù)多變魚腥藻ATCC 29413限制酶的甲基化酶基因M.AvaI和M.AvrII(ava_3181和ava_4359)的DNA序列設計兩對引物(表1),兩個基因的上游引物序列在ATG前7個堿基設計典型核糖體結合位點AGGAGG,M.AvrII基因的上游引物設計上終止密碼子用于終止插入載體pACYC184上四環(huán)素抗性基因的翻譯。以野生型多變魚腥藻ATCC 29413基因組為模板,以引物M.AvaI p-1/p-2和M.AvrII p-1/p-2分別進行PCR擴增,得到大小為1.45 kb的M.AvaI基因和1.28 kb的M.AvrII基因,經(jīng)過純化連接到pMD18-T載體上,轉化E.coliDH10B,得到質粒pHB6065和pHB6067,感受態(tài)菌制作方法參照文獻[19]。將質粒pHB6065用BamHⅠ酶切補平后再用SphⅠ酶切,瓊脂糖電泳回收1.45 kb的M.AvaI片段,同時將質粒pHB6067用SalⅠ酶切補平后再用SphⅠ酶切,回收線性化4 kb大小帶M.AvrII的載體片段。將目的片段與載體連接后轉化感受態(tài)E. coliDH10B,得質粒pHB6087;將pHB6087質粒上2.7 kb的BamHⅠ(補平)和SalⅠ雙酶切片段(含有M.AvaI和M.AvrII)克隆到質粒pACYC184的EcoRV和SalⅠ雙酶切位點,得到輔助質粒pHB6088。所有構建的質粒經(jīng)PCR檢測和測序驗證無誤。

用于基因插入失活的運載質粒的構建根據(jù)已公布的基因ava_1237和ava_4412序列發(fā)現(xiàn)兩基因大小分別為1.42和0.48 kb。為了便于同源交換,在每個基因兩側分別設計了兩對引物(表1),以多變魚腥藻基因組DNA為模板,利用引物ava_1237 p-1/p-2擴增出基因ava_1237上游0.71 kb的片段,以引物ava_1237 p-3/p-4擴增出基因ava_1237下游0.70 kb的片段,將兩片段分別克隆到質粒pHB518和pHB576的Eam1105Ⅰ位點,同時刪除了以上兩個質粒上的氯霉素抗性基因(Cmr)得到質粒pHB5225和pHB5235,用NotⅠ酶切pHB5235,插入從pHB5225中用NotⅠ酶切回收的約2.7 kb片段(含有ava_1237上游片段+Emr);通過PCR鑒定,選擇上下游片段方向一致的克隆,得到質粒pHB5245;用PvuⅡ酶切pHB5245,回收約3.7 kb片段(含有ava_1237上游片段+Emr+ava_1237下游片段),將其插入到pRL277質粒PstⅠ位點(PstⅠ酶切并補平)得到運載質粒pHB5255。

表1 本文所使用的引物Tab.1 Primers used in this study

同樣的以多變魚腥藻基因組DNA為模板,利用引物ava_4412 p-1/p-2擴增出基因ava_4412上游0.69 kb的片段,以引物ava_4412 p-3/p-4擴增出基因ava_4412下游0.86 kb的片段,將兩片段分別克隆到質粒pHB518和pHB576的Eam1105Ⅰ位點,同時刪除了以上兩個質粒上的氯霉素抗性基因得到質粒pHB5231和pHB5241;用Sse8387Ⅰ酶切pHB5241,插入從pHB5231中用Sse8387Ⅰ酶切并回收的約2.6 kb片段(含有ava_4412上游片段+Emr);通過PCR鑒定,選擇上下游片段方向一致的克隆,得到質粒pHB5251;用PvuⅡ酶切pHB5251,回收約3.7 kb片段(含有ava_4412上游片段+Emr+ava_4412下游片段),將其插入到pRL277質粒PstⅠ位點(PstⅠ酶切并補平),得到運載質粒pHB5261。

1.4 接合轉移菌株的構建

在接合轉移前需要把幾種質粒轉入同一個菌株,其中包括輔助質粒、運載質粒和接合質粒。首先通過轉化將輔助質粒和運載質粒轉入同一個大腸桿菌細胞E. coliDH10B,然后將含有接合質粒的大腸桿菌細胞與含有輔助質粒和運載質粒的大腸桿菌細胞在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基上交叉劃線,長出的細胞即是含有輔助質粒、運載質粒和接合質粒的菌株。

輔助質粒pHB6088轉化到E. coliDH10B(pDS4101)細胞中,得到菌株E. coliDH10B(pDS4101+pHB6088)。再將兩個運載質粒pHB5255和pHB5261分別轉化到感受態(tài)細胞E. coliDH10B(pDS4101+ pHB6088)中,得到含3種質粒的菌株E. coliDH10B(pDS4101+pHB6088+運載質粒)。用接種環(huán)將上述含3個質粒的菌株與E. coliHB101(pRL443)在含有Ap、Cm、Sp、和Tc四種抗性的固體LB平板上交叉劃線,質粒pRL443自主轉移到含3質粒的菌株中,得到含4種質粒的菌株E. coliDH10B(pDS4101+pHB6088+運載質粒+pRL443)。另外將輔助質粒pRL623轉化到含有運載質粒的細胞中,然后再與含有pRL443的菌株細胞交叉劃線,在三抗培養(yǎng)基(Cm、Sp和Tc)上篩選含有pRL623、運載質粒和pRL443的大腸桿菌細胞,得到E. coliDH10B(pRL623 +運載質粒+pRL443)。

1.5 接合轉移和突變株的篩選

接合轉移方法參照文獻[2]采用兩個途徑進行,分別用菌株E.coliDH10B(pDS4101+pHB6088+運載質粒+pRL443)和菌株E.coliDH10B(pRL623+運載質粒+pRL443)與多變魚腥藻ATCC 29413進行接合轉移,按比例取50 mL對數(shù)生長期藻細胞(A730為0.4)和25 mL大腸桿菌接合轉移細胞(A600為0.6),先將藻和菌分別用無抗的培養(yǎng)基洗3遍,再將藻和菌分別濃縮為1 mL,藻菌混合液涂于帶硝酸纖維素濾膜的無抗BG11平板(添加5% LB),每個BG11平板涂100—200 μL的藻菌混合液,恢復一天后再從濾膜上洗下藻菌混合物,1800 r/min離心收集藻細胞后,將其涂于添加紅霉素和5 mmol/L果糖的固體BG11平板上等待接合子長出。長出的接合子在含紅霉素的BG11平板上劃線培養(yǎng),待長出來之后轉入紅霉素抗性的30 mL AA/8液體培養(yǎng)基,根據(jù)不同的基因設計檢測引物,傳代分離純化后提取野生型和接合子基因組DNA做PCR檢測。

2 結果

2.1 用于甲基化保護的輔助質粒

圖1 輔助質粒構建流程圖Fig.1 Schematic diagram of construction of the helper plasmid

輔助質粒的構建流程如下(圖1):將多變魚腥藻ATCC 29413中限制酶(AvaⅠ和AvrⅡ)的甲基化酶基因ava_3181(M. AvaⅠ)和ava_4359(M. AvrⅡ)分別克隆到pMD18-T載體上,得到質粒pHB6065和pHB6067。然后將質粒pHB6065上的M. AvaⅠ基因以相同方向克隆到pHB6067質粒M. AvrⅡ基因下游得到pHB6087。最后將串聯(lián)的M. AvaⅠ和M.AvrⅡ插入到質粒pACYC184四環(huán)素抗性基因中間,得到輔助質粒pHB6088。pHB6088利用四環(huán)素抗性基因的啟動子來驅動M. AvrⅡ和M. AvaⅠ的轉錄(圖1),基因M. AvrⅡ上游設計帶有終止密碼子(Stop codon)和核糖體結合位點(RBS),Stop codon用于終止Tcr上游序列的翻譯,RBS為大腸桿菌典型核糖體結合位點(AGGAGG)。

2.2 用于基因敲除的運載質粒

基因ava_1237的側翼同源序列0.71和0.7 kb分別克隆到質粒pHB518和pHB576得到質粒pHB 5225和pHB5235,再將pHB5225的上游側翼同源序列連同Emr切下連接到pHB5235上得到質粒pHB5245,質粒pHB5245上的兩個側翼同源序列和Emr切下連到載體pRL277上得到運載質粒pHB5255。

基因ava_4412的側翼同源序列0.69和0.86 kb分別克隆到質粒pHB518和pHB576得到質粒pHB 5231和pHB5241,再將質粒pHB5231的上游側翼同源序列和Emr切下連接到pHB5241上得到質粒pHB5251,質粒pHB5251上的兩個側翼同源序列和Emr切下連到載體pRL277上得到運載質粒pHB5261。

運載質粒pHB5255含有基因ava_1237上下游兩側分別約有0.7 kb的序列,其基因中間142 bp的序列被Em抗性基因置換,用于ava_1237基因失活研究;另一個運載質粒pHB5261含有ava_4412上游0.69 kb和下游0.86 kb序列,其基因中間126 bp的序列被Em抗性基因置換,用于ava_4412基因失活研究。兩個運載質粒上面還含有bom位點和用于雙交換篩選的蔗糖致死基因(sacB)及壯觀霉素抗性基因(Spr)。

2.3 基因的一步插入失活

本研究構建了兩種接合轉移菌株E.coliDH10B(pDS4101+pHB6088+運載質粒+pRL443)和E.coliDH10B(pRL623+運載質粒+pRL443)。pDS4101提供接合轉移所需的Mob蛋白;pHB6088含有多變魚腥藻兩個甲基化酶基因(M. AvaⅠ和M. AvrⅡ),對運載質粒特定位點進行甲基化保護;pRL623上有來源于其他微生物的三種甲基化酶基因(M.AvaⅠ、M. Eco47Ⅱ和M. EcoT22Ⅰ)和Mob蛋白基因;接合質粒pRL443,具有自主轉移特性并提供接合所需的性纖毛,質粒上的tra基因叢編碼的蛋白能驅動運載質粒從E. coli到藻細胞的接合轉移;運載質粒含bom位點,克隆有本研究將要敲除的基因的上下游同源序列和插入其間的紅霉素抗性基因。

將以上菌株分別與多變魚腥藻ATCC 29413進行接合轉移后,在添加果糖和紅霉素的BG11平板上篩選。7—14d后,利用含有輔助質粒pHB6088的菌株進行的接合轉移平板開始長出接合子,每組都長出20個左右的接合子,而利用含有輔助質粒pRL623的菌株進行接合轉移的平板沒有接合子長出。將接合子劃線到添加果糖和紅霉素的BG11固體平板培養(yǎng),長出的藻落再接種到添加果糖和紅霉素的AA/8液體培養(yǎng)基中傳兩代。提取基因組DNA,在基因組與運載質粒同源序列的上下游兩側和紅霉素抗性基因內部設計引物(表1),進行PCR檢測與比較。這兩個突變株分別隨機檢測了2個(ava_1237)和4個接合子(ava_4412),都顯示發(fā)生了同源雙交換,而不是單交換(圖2),也就是省略了在絲狀藍藻構建基因敲除突變株要先獲得單交換株的傳統(tǒng)實驗步驟。圖2中泳道3和4都顯示獲得了基因ava_1237的雙交換突變,但泳道3檢測的接合子突變尚未完全分離(藍藻基因組有多拷貝,該接合子仍有野生型拷貝);泳道7和9是基因ava_4412完全分離的雙交換突變株,泳道8和10是未完全分離的突變株;泳道1、2和5、6是兩個基因的野生型對照。圖3為同源雙交換示意圖。

圖2 突變株PCR檢測結果Fig.2 PCR examination of mutants

由于以PCR隨機檢查的6個接合子全部為雙交換株,本實驗室敲除其他基因獲得的幾十個接合子也均為雙交換株,我們推測以該遺傳操作系統(tǒng)獲得的全部或絕大多數(shù)接合子均直接發(fā)生雙交換。因此,可按所得到的抗性接合子數(shù)除以藻細胞數(shù)計算通過接合轉移敲除基因的效率。結果顯示,用輔助質粒pHB6088進行接合轉移,獲得基因ava_4412插入失活突變株的效率約為4.95×10-8,基因ava_1237插入失活的效率約為4.09×10-8,而以pRL623作為輔助質粒進行接合轉移未得到接合子。

圖3 同源雙交換示意圖Fig.3 Schematic diagram of homologous double crossover

3 討論

在絲狀藍藻中,通常利用接合轉移的方法來開展遺傳操作[2],但接合轉移僅僅提供一個外源DNA導入藻細胞的途徑,DNA進入后能否在細胞內復制或整合還受多種因素的影響,尤其是藻株的限制修飾系統(tǒng)(R-M系統(tǒng))[12]。為了克服限制酶對外源DNA的降解,采用較多的方法是在導入藍藻之前對DNA進行甲基化修飾從而逃脫藍藻限制酶的切割[20]。因此在輔助質粒上可克隆藻株的甲基化酶基因,在大腸桿菌對運載質粒進行甲基化保護,從而提高接合轉移的效率。比如用于魚腥藻PCC 7120接合轉移的輔助質粒pRL623上就有三種甲基化酶基因(M. AvaⅠ、M. Eco47Ⅱ和M. EcoT22Ⅰ),針對其三種限制酶(AvaⅠ、AvaⅡ和AvaⅢ)進行甲基化保護,極大地提高了接合轉移效率[13]。本研究發(fā)現(xiàn),應用絲狀藍藻輔助質粒pRL623在對多變魚腥藻ATCC 29413接合轉移時得不到接合子,通過克隆多變魚腥藻ATCC 29413基因組中的兩個甲基化酶基因(ava_3181和ava_4359),構建輔助質粒pHB6088,結果獲得了接合子,相對而言在一定程度上促進了遺傳操作的成功。此外,利用這個接合轉移系統(tǒng)和輔助質粒pHB6088,我們又進行了19個未知功能基因敲除或失活并獲得了成功。因此,輔助質粒pHB6088比pRL623更有利于對多變魚腥藻ATCC 29413進行遺傳操作。

有研究表明在藍藻細胞中提取的質粒DNA由于被甲基化而不能轉化基因型為mcrA+的E. coliDH5a[21],這是由于在一些大腸桿菌株系中含有特異性降解甲基化DNA的限制酶系統(tǒng)[22,23]。本研究構建的輔助質粒在嘗試轉入E. coliDH5α(mcr+mrr+)菌株時無法得到轉化子,而轉入E. coliDH10B(mcr-mrr-)沒有障礙,這也說明輔助質粒上的甲基化酶基因有表達,發(fā)揮了甲基化保護作用。

在藍藻的接合轉移中,一般運載質粒進入藻細胞后需要經(jīng)歷單交換和雙交換兩個過程的篩選[24],現(xiàn)有文獻報道的對多變魚腥藻ATCC 29413基因敲除的研究也是要先發(fā)生單交換[4—6]。但作者在基因敲除的過程中觀察到,多變魚腥藻ATCC 29413在某種條件下,可一步發(fā)生同源雙交換,直接跳過單交換篩選得到插入失活突變株,這在一定程度上縮短了獲得突變株的周期。通常接合轉移效率是依據(jù)導入能自主復制的質粒獲得接合子的數(shù)量來計算的,而本研究導入的是不能復制的質粒,進入細胞后一步發(fā)生雙交換,所以獲得接合子的頻次不高。以一步發(fā)生雙交換的概率來看,本文所構建的接合轉移系統(tǒng)效率并不低。

我們對多變魚腥藻ATCC 29413基因組序列搜索比較發(fā)現(xiàn),該藻株也含有識別和切割特定位點甲基化DNA的Mrr限制系統(tǒng)(由ava_B0091基因編碼)[23,25]。推測如果運載質粒上有Mrr識別位點而目的基因側翼片段和抗性基因上沒有,很可能進入藻細胞的DNA質粒被部分切割、線性化,導致基因側翼片段直接與目標基因進行同源雙交換。因此,為了進一步提高該藻株的接合轉移效率,構建Mrr限制系統(tǒng)缺陷藻株,消除Mrr限制系統(tǒng)對DNA的影響也是有必要的。