PBAT地膜降解菌的篩選及其降解特性研究

劉佳茜，侯麗君，劉婷婷，王沛媛，高祥，林雁冰*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

塑料產(chǎn)品由于成本低廉、不易腐爛和適用范圍廣泛等，在人類生活中被大量使用，但同時(shí)，自然環(huán)境中的塑料污染問題也愈發(fā)嚴(yán)重。特別在農(nóng)業(yè)中，塑料地膜的使用在提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的同時(shí)也使農(nóng)田中白色污染問題愈加嚴(yán)重[1-4]?，F(xiàn)階段，農(nóng)用地膜大部分為聚乙烯材料，其化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并難以降解[5-6]，殘留在農(nóng)田中的地膜會(huì)影響土壤結(jié)構(gòu)與功能，甚至影響植物生長[7-8]。目前對廢棄塑料地膜的處置方式大多為填埋、焚燒、二次加工等，這些處理方式對環(huán)境的污染較大，且處理成本高[9]。因此，地膜殘留問題現(xiàn)已成為全球環(huán)境污染的熱點(diǎn)問題。

近年來，生物降解地膜的出現(xiàn)在一定程度上減輕了農(nóng)田中聚乙烯地膜的污染問題。聚己二酸/對苯二甲酸丁二酯（Polyadipate/butylene terephthalate，PBAT）是一種可生物降解的聚合物，其具有良好的耐熱性和延伸性，在土壤微生物作用下可降解為無毒小分子，對生態(tài)環(huán)境友好。目前全球PBAT 產(chǎn)量占生物塑料總產(chǎn)量的7.2%，PBAT 地膜已成為生物降解地膜中常見的一種，已經(jīng)逐漸商業(yè)化[10-12]。2011年，國家發(fā)改委出臺的《產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整指導(dǎo)目錄（2011年本）》中指出，要鼓勵(lì)使用生物降解材料，推動(dòng)農(nóng)用薄膜無污染降解技術(shù)的開發(fā)和利用。2017 年，全生物降解材料被列入《“十三五”材料領(lǐng)域科技創(chuàng)新專項(xiàng)規(guī)劃》。自此，PBAT地膜的年生產(chǎn)量從2011年的1.19萬t增長至2018年的3.38萬t。據(jù)綜合農(nóng)膜發(fā)展趨勢以及塑料污染防控政策預(yù)測分析，PBAT地膜的產(chǎn)量將增至每年34萬t[13]。

雖然PBAT 屬于可降解材料，但有研究表明其在特定條件下才能達(dá)到較好的降解效果，實(shí)際應(yīng)用過程中其降解情況并不理想，鄔強(qiáng)等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在棉花種植過程中鋪施PBAT地膜，180 d后，PBAT地膜表面僅出現(xiàn)細(xì)小裂紋，降解程度不明顯。目前關(guān)于PBAT地膜的降解菌種資源還較少，且現(xiàn)有菌種在溫和條件下對PBAT 的降解效果不理想[15-16]。因此，深入尋找對PBAT塑料地膜的高效降解菌株非常必要。

本試驗(yàn)從垃圾場下層土壤中篩選對PBAT 有潛在降解作用的菌種，通過降解性能測定，擬篩選可以高效降解PBAT 地膜的菌株，旨在豐富PBAT 降解菌種資源庫，為PBAT 地膜降解提供理論支持和參考，有利于生物降解地膜的推廣。

1 材料與方法

1.1 塑料樣品與塑料降解菌來源

本試驗(yàn)使用的塑料地膜樣品類型為PBAT 生物可降解地膜，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)徐靜教授提供。本試驗(yàn)菌株分離自長期存在PBAT 塑料地膜污染的陜西省楊凌示范區(qū)曹新莊生活垃圾填埋場的下層土壤。

1.2 試驗(yàn)儀器與培養(yǎng)基

所需儀器有高壓蒸汽滅菌鍋（GI54TW），超聲波清洗器（KQ-250B），恒溫培養(yǎng)搖床（ZWY-2102C），恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9272），PCR 儀（SimpliAmp），酶標(biāo)儀（Epoch），電泳儀（Powerpac Basic），凝膠成像儀（Biorad Gel Imager），掃描電子顯微鏡（S-4800；Hitachi，Japan），原子力顯微鏡（Multimode-8；Bruker，USA），傅里葉變換紅外光譜儀（Vetex70；Bruker，Germany）和水接觸角儀（JC2000D1；Powereach，China）等。

所需培養(yǎng)基有微量碳源培養(yǎng)基、無機(jī)鹽培養(yǎng)基、LB 營養(yǎng)培養(yǎng)基、脲酶產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基、碳源利用試驗(yàn)培養(yǎng)基、脂肪酶產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基、H2S 產(chǎn)生培養(yǎng)基、淀粉降解試驗(yàn)培養(yǎng)基、漆酶產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基以及過氧化氫酶產(chǎn)生試驗(yàn)培養(yǎng)基等[17-19]。

1.3 PBAT地膜降解菌的篩選

膜片表面滅菌處理：將PBAT 地膜剪成大小為2 cm×1.5 cm 的膜片，然后依次浸泡于2% SDS、75%乙醇、95%乙醇中4 h，再用無菌水沖洗干凈，置于紫外滅菌燈下滅菌15 min[20]。

將1.0 g 土壤加入9.0 mL 微量碳源液體培養(yǎng)基中，并加入 1 片預(yù)處理過的 PBAT 膜片，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)10 d；再將膜片轉(zhuǎn)接入10.0 mL 新的微量碳源液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)10 d。使用PBS 溶液（0.1 mol·L-1）振蕩清洗膜片，將菌懸液轉(zhuǎn)接入30 mL含有0.1 g 左右PBAT 地膜的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，180 r·min-1、28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)30 d。使用稀釋平板涂布法，吸取培養(yǎng)30 d 后的培養(yǎng)懸液涂布于LB 固體培養(yǎng)基，挑選優(yōu)勢菌落進(jìn)行多次分離純化，得到對PBAT有潛在降解能力的菌株。

1.4 PBAT地膜降解菌的鑒定

使用堿裂解法提取細(xì)菌總DNA[21]，以其為模板，以27F/1492R（27F：5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）和P1/P6（P1：5′-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCT?CAGAACGAACG CT-3′；P6：5′-CGGGATCCTACG?GCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′）為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 1 min，58 ℃退火 1 min，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30 次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結(jié)果與Ezbiocloud 數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行序列比對分析，并選取同源性相近的菌株，采用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，構(gòu)建方法為Neighbor-joining，檢驗(yàn)方法為Bootstrp method，比對次數(shù)為1 000。

1.5 PBAT地膜降解率的測定

將分離、純化得到的潛在PBAT 降解菌株于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，4 ℃、8 000 r·min-1離心10 min，去掉上清液，沉淀菌體用0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液沖洗。將菌體接種于含有30 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中，調(diào)整并保持菌液的OD600值為0.8～1.0。加入0.1 g 表面滅菌的PBAT 塑料地膜膜片（滅菌方法同1.3），28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)8周。將不接種菌懸液的含有PBAT 膜片的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基在相同條件下培養(yǎng)，作為空白對照（CK）。8 周后，將膜片表面沖洗干凈并干燥至恒質(zhì)量，計(jì)算膜片失重率[2，22]。

膜片的失重率=（膜片初始質(zhì)量-膜片被降解后質(zhì)量）/膜片初始質(zhì)量×100%

1.6 掃描電子顯微鏡（SEM）以及原子力顯微鏡（AFM）觀察

將被降解8 周的膜片清洗干凈后自然干燥。固定噴金后在掃描電子顯微鏡（S-4800；Hitachi，Japan）下觀察其表面是否出現(xiàn)褶皺及孔洞等破損情況[2]。利用原子力顯微鏡（Multimode-8；Bruker，USA）掃描塑料地膜的表面特征，通過NanoScope Analysis 軟件分析圖像，觀察膜片表面的粗糙程度，掃描尺寸為5 mm×5 mm[2，23]。

1.7 傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR）測定

將被降解8 周的膜片清洗干凈后自然干燥。使用傅里葉紅外光譜儀（Vetex70；Bruker，Germany）測定膜片表面的官能團(tuán)，掃描波長范圍為600～4 000 cm-1，觀察降解后膜片表面是否有新的極性官能團(tuán)[5，24]。

1.8 水接觸角（WCA）測定

將降解8 周的塑料地膜清洗干凈后自然干燥，使用水接觸角計(jì)（JC2000D1；Powereach，China）進(jìn)行膜片靜水接觸角的測定，進(jìn)而分析膜片表面疏水性的變化[24-25]。

1.9 數(shù)據(jù)處理

本研究數(shù)據(jù)運(yùn)用IBM SPSS Statistics 23 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析T檢驗(yàn)對不同處理進(jìn)行分析（n=3），利用OriginPro 2016繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PBAT地膜降解菌株鑒定結(jié)果

從以PBAT 地膜為唯一碳源的培養(yǎng)基中共篩選出56 株細(xì)菌。通過潛在降解菌生長的優(yōu)勢程度，挑選出6株優(yōu)勢菌作為潛在的高效PBAT塑料降解菌進(jìn)行后續(xù)降解性能分析。該6 株優(yōu)勢菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖 1 所示，菌株 N1-2、RD1-3 以及 D4-2 均屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），菌株D2-1、N3-2和D5-3分別屬于黃桿菌屬（Chryseobacterium）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）。

6 株潛在降解菌株的各項(xiàng)生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)果如表1 所示。菌株RD1-3 可以分泌的酶的種類最多且可產(chǎn)生H2S。其他5 株潛在高效塑料降解菌均能分泌脂肪酶和淀粉酶，菌株N3-2 分泌脲酶的能力較高。

2.2 潛在降解菌對PBAT的降解能力

2.2.1 PBAT地膜失重率

由圖2可知，以PBAT 為唯一碳源時(shí)，菌株RD1-3對PBAT 膜片的降解率最高，8 周降解率可達(dá)6.88%±0.06%。其次為菌株N1-2 以及N3-2，對膜片的降解率分別可達(dá)6.49%±0.01%和6.54%±0.09%。其余菌株對PBAT 的降解率均在5%左右。由此可以初步推測，菌株RD1-3、N1-2以及N3-2對PBAT具有較高的降解作用。

2.2.2 PBAT地膜表面形態(tài)特征變化

掃描電鏡結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的原膜（ORI）以及CK 處理表面光滑平整，6 株潛在的PBAT 降解菌均可使膜片表面產(chǎn)生破損。菌株N1-2、RD1-3 以及D4-2處理組中，膜片表面均出現(xiàn)明顯的褶皺以及溝壑。在菌株N3-2、D2-1 以及D5-3 處理組中，膜片表面也出現(xiàn)細(xì)小溝壑以及微孔，但均不明顯（圖3）。

表1 潛在降解菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical test results of potentially degrading bacteria

圖4 為原子力顯微鏡下觀察到的降解8 周后PBAT地膜表面特征。ORI和CK組中膜片表面粗糙程度很輕，較為平整。在菌株N1-2、RD1-3 以及D5-3降解8 周后，PBAT 膜片表面出現(xiàn)明顯凸起及凹陷，粗糙程度加深。其余處理組的膜片表面粗糙度與CK組差別均不明顯。本結(jié)果與掃描電鏡結(jié)果相似，可以看出，菌株N1-2 以及RD1-3 對PBAT 膜片表面形態(tài)影響較大。

2.2.3 PBAT地膜的紅外光譜特征分析

PBAT為芳香族和脂肪族的聚合物。由圖5可知，紅外光譜圖中1 450 cm-1附近的苯環(huán)特征峰（—C6H4—）、1 716 cm-1附近的羰基特征峰（—C＝O）以及2 966 cm-1附近的—CH2—不對稱伸縮振動(dòng)峰均為PBAT 的特征峰。降解8 周后，6 株潛在PBAT 降解菌均向PBAT 結(jié)構(gòu)中引入了新的極性官能團(tuán)，如碳氮三鍵（2 350 cm-1附近）、碳碳雙鍵（3 099 cm-1附近）以及羥基（3 400～3 330 cm-1）等，極性官能團(tuán)的引入可以降低塑料膜片的穩(wěn)定性，從而使其更易被降解。菌株RD1-3 及N1-2 在2 350 cm-1附近的特征峰較其他菌株強(qiáng)，說明該兩株菌能增強(qiáng)膜片的不穩(wěn)定性，從而更易對PBAT薄膜進(jìn)行降解。

2.2.4 PBAT地膜的疏水性特征分析

水接觸角能反映膜片表面疏水性大小，膜片表面疏水性降低是塑料被降解的重要表征[26]。如圖6 所示，降解8 周后，6 種菌株均可顯著降低PBAT 膜片表面水接觸角大?。≒＜0.05），菌株D4-2以及N1-2降低膜片水接觸角的程度最大，分別降低至73.6°±1.3°和73.1°±1.4°。此外，菌株RD1-3 降低水接觸角的程度也較高（77.9°±0.7°）。由此可知，此3 株菌均能較大程度地降低膜片表面疏水性，從而證明3 株菌對PBAT塑料膜片具有較好的降解作用。

3 討論

塑料在降解過程中會(huì)發(fā)生很多物理、化學(xué)表征變化，最典型的降解特征為質(zhì)量發(fā)生損失，但質(zhì)量的降低程度不能完全反映塑料的降解程度[27]，因此本文除膜片降解率外，還對膜片表面微觀特征、表面疏水性、表面官能團(tuán)等進(jìn)行測定。綜合上述各指標(biāo)的結(jié)果，最終從6 株潛在PBAT 降解菌中選擇出RD1-3 和N1-2兩株菌，推測其為潛在高效PBAT 降解菌。大多數(shù)塑料降解菌都會(huì)通過分泌降解酶從而對塑料產(chǎn)生降解作用，如脲酶、漆酶、過氧化物酶以及脂肪酶等[28-29]。本試驗(yàn)中菌株RD1-3 具有合成并分泌多種胞外降解酶的能力。

菌株RD1-3 和N1-2 對PBAT 的降解率均在6%以上，與其他在常溫下進(jìn)行的研究相比降解率較高。如霍向東等[12]從南疆農(nóng)田中分離得到的鞘脂單胞菌XJSL2，其 60 d 的 PBAT 降解率僅不到 1%；Wang 等[27]研究發(fā)現(xiàn)PBAT地膜在常規(guī)農(nóng)田土壤中3個(gè)月的降解率僅為2.3%；Tan 等[30]在土壤中篩選出19 種細(xì)菌，其在30 ℃條件下對PBAT的絕對降解量均很低，且只有兩株菌對PBAT 造成可見的降解。另有研究表明，真菌對塑料地膜的降解率遠(yuǎn)高于細(xì)菌，如7 d內(nèi)，菊異莖點(diǎn)霉（Paraphoma ChrysanthemicolaB47-9）對該類地膜的降解面積高達(dá)99.2%，但在現(xiàn)有研究中未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對PBAT有如此高的降解率[31]。提高降解體系的溫度或改變pH 值，以及在降解體系中加入氧助化劑等均能提高微生物對塑料膜片的降解率，如在溫度為58 ℃的堆肥條件下，PBAT 膜片48 d 的降解率可達(dá)64.3%[19，32-34]。但在自然環(huán)境中控制農(nóng)田溫度和酸度或添加助化劑實(shí)施較困難。本試驗(yàn)在常溫條件下進(jìn)行，目的是篩選出在常溫且溫和條件下即可以對PBAT 有高效降解作用的菌株。除降解率外，本研究中掃描電鏡、原子力顯微鏡、紅外光譜以及水接觸角結(jié)果，均能很好地展現(xiàn)菌株RD1-3 和N1-2 對PBAT良好的降解性。

菌株RD1-3 和N1-2 均屬于假單胞菌屬。關(guān)于假單胞菌屬細(xì)菌對塑料有降解作用的報(bào)道也較多。綠膿假單胞菌、惡臭假單胞菌和施氏假單胞菌等具有高效降解低密度聚乙烯的能力[35-38]。此外，該屬細(xì)菌對聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚氨酯、氯代芳烴等也有降解作用[38-39]。假單胞菌對烴類化合物產(chǎn)生降解能力的原因之一為其攜帶編碼烷烴羥化酶的基因，可以利用氧分子從而在塑料穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)中引入不穩(wěn)定的含氧官能團(tuán)[40]。

推測兩株高效降解菌RD1-3 和N1-2 可通過產(chǎn)生多種酶對烴鏈進(jìn)行降解。此外，PBAT 塑料膜片疏水性降低、粗糙度增加、產(chǎn)生破損以及新的極性官能團(tuán)的引入，均有利于微生物在膜表面的附著和薄膜的分解，從而進(jìn)一步加快了菌株的降解作用[26，41]。

4 結(jié)論

（1）本試驗(yàn)從垃圾場土壤中分離得到6 種潛在的PBAT塑料降解菌，通過對6株菌對PBAT降解性能結(jié)果的綜合分析，最終得到兩株高效降解PBAT 的假單胞菌，分別為Pseudomonassp. RD1-3 和Pseudomonassp.N1-2。

（2）28 ℃條件下，經(jīng)8 周培養(yǎng)，兩株菌對PBAT 地膜的降解率分別為6.88%±0.06%和6.49%±0.01%。

（3）兩株菌作用8 周后，PBAT 地膜表面均出現(xiàn)明顯的褶皺與溝壑，粗糙程度增加，且薄膜表面結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)新的極性官能團(tuán)，薄膜表面親水性增加。