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    肥胖大鼠袖狀胃切除術(shù)后骨折風(fēng)險增加的初步探討

    2021-02-04 06:24:20岑曉霞溫興鑄
    創(chuàng)傷外科雜志 2021年1期
    關(guān)鍵詞:空白對照骨髓脛骨

    王 強(qiáng),岑曉霞,溫興鑄,李 偉,張 偉

    (海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院普外三科,上海 200003)

    當(dāng)前,減重手術(shù)治療肥胖及相關(guān)并發(fā)癥療效確切且安全,但隨著手術(shù)數(shù)量的增加,越來越多的臨床證據(jù)表明,減重術(shù)后骨健康狀態(tài)會出現(xiàn)變化[1-3],主要表現(xiàn)術(shù)后隨著顯著的生化、激素和機(jī)械應(yīng)力的改變可能明顯提升骨折風(fēng)險。袖狀胃切除術(shù)(sleeve gastrectomy,SG)已經(jīng)成為當(dāng)前國際上最流行的減重手術(shù),目前雖有臨床數(shù)據(jù)提示SG術(shù)后骨健康狀態(tài)惡化[3],但關(guān)于SG術(shù)后骨健康狀態(tài)變化和機(jī)制研究的動物實驗尚較欠缺。本研究以肥胖SD大鼠為模型,初步探討SG術(shù)后對大鼠骨折風(fēng)險升高的主要表現(xiàn)以及可能的機(jī)制。

    材料與方法

    1 實驗對象及分組

    本研究共采購6周齡清潔級雄性SD大鼠40只,由海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供[許可證號:SCXK(滬)2007-0003,動物倫理申請?zhí)枺?0175001126]。

    構(gòu)建肥胖大鼠模型:將40只SD大鼠隨機(jī)分成高脂飼料組(30只)和普通飼料組(10只)。高脂飼料組大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng),兩組同時喂養(yǎng)8周后,高脂飼料組中體質(zhì)量超過對照組平均體質(zhì)量120%的大鼠定為飲食誘導(dǎo)的肥胖大鼠,最終共26只大鼠誘導(dǎo)成功。

    26只肥胖大鼠再次隨機(jī)分為肥胖組(10只),SG組(16只)。SG組大鼠施行SG術(shù),共6只大鼠在術(shù)后圍手術(shù)期死亡。故最終進(jìn)入實驗的三組:空白對照組(原普通飼料組),肥胖組(肥胖大鼠),SG組(肥胖大鼠+SG術(shù)),各10只。

    2 實驗方法

    大鼠均術(shù)前24h禁食,術(shù)前10h禁水。嚴(yán)格稱重后采用10%水合氯醛300mg/kg腹腔注射麻醉。

    SG組:大鼠充分麻醉待檢查疼痛反射及角膜反射消失后,取仰臥位固定于操作臺上。備皮、常規(guī)消毒、鋪無菌洞巾、換無菌手套。取腹部正中長2~2.5cm切口,以劍突下2~3cm為宜。進(jìn)腹后以鹽水紗布縫蓋切口。用無菌醫(yī)用棉簽輕柔地牽拉開肝臟,以暴露大鼠胃。無損傷鑷子將胃從腹腔中游離出,離斷肝胃韌帶及胃脾韌帶,5-0絲線結(jié)扎、離斷朝向脾門的胃短血管和幽門旁的胃網(wǎng)膜血管。用無損傷腸鉗在胃大彎處夾閉,距幽門部3~5mm起向賁門his角下沿腸鉗切除整個胃底和3/4胃體。鹽水棉簽清理殘胃后用5-0可吸收縫線連續(xù)縫合胃切緣,出血處適當(dāng)以間斷縫合加固。檢查無活動性出血,溫?zé)嵘睇}水沖洗腹腔2~3次后關(guān)腹。

    大鼠術(shù)后立即予皮下注射葡萄糖生理鹽水20mL,常規(guī)禁食禁水24h,術(shù)后1~3d給予半流質(zhì)(氨素奶粉+少許飼料碎末攪拌而成)。術(shù)后第7天恢復(fù)各組術(shù)前飲食(不限量),術(shù)后第2周開始分別計算各組大鼠每周平均日進(jìn)食量;實驗結(jié)束后,動物均通過10%水合氯醛過劑量麻醉行安樂死。

    3 觀察以及檢測指標(biāo)

    (1)術(shù)前1d及術(shù)后8周每天定時監(jiān)測大鼠體質(zhì)量;術(shù)后第2周起每天記錄每只大鼠的攝食總量,計算每周日均攝食量。(2)術(shù)后8周通過ELISA法測定三組大鼠血清血鈣、甲狀旁腺素(parathyroid hormone,PTH)和25-羥基維生素D3[25(OH)D3],以上試劑盒均由上海研謹(jǐn)生物公司提供。(3)術(shù)后8周通過雙能X線骨密度儀測定右側(cè)股骨以及脊柱的骨密度(bone mineral density,BMD)。(4)術(shù)后8周通過ELISA法測定三組大鼠血清骨代謝相關(guān)指標(biāo):I型膠原蛋白C端末端肽(C-tenninal cross linked peptide,CTX)、I型前膠原氨基端前肽(Procollagen type ⅠN-terminal propeptide,PINP)、抗酒石酸酸性磷酸酶-5a(tartrate resistant acid phosphatase,TRACP-5a)、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(tartrate resistant acid phosphatase,TRACP-5b),以上試劑盒均由上海研謹(jǐn)生物公司提供 。(5)術(shù)后8周處死大鼠,取右側(cè)股骨以及脛骨中上段,通過HE染色觀察骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨小梁以及炎細(xì)胞浸潤等情況。(6)通過取肥胖組和SG組脛骨中段骨髓組織石蠟包埋后HE染色,在高倍鏡下選取3個不連續(xù)的視野,人工計算脂肪細(xì)胞數(shù)量并取平均值進(jìn)行比較。

    4 統(tǒng)計學(xué)分析

    結(jié) 果

    1 體質(zhì)量以及攝食量的變化

    空白對照組、肥胖組和SG組術(shù)前體質(zhì)量分別為(374.51±15.68)g、(487.30±13.70)g和(483.51±11.19)g,肥胖組與SG組體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。SG組術(shù)后第1周體質(zhì)量迅速下降,最低體質(zhì)量出現(xiàn)在術(shù)后第8天(411.23±14.87)g,隨著術(shù)后不限量飲食的開放,SG組術(shù)后的體質(zhì)量再次緩慢上升。至術(shù)后第8周,三組的體質(zhì)量分別為(437.50±10.76)g、(550.78±10.76)g和(473.45±6.62)g。術(shù)后第1天至術(shù)后8周每日測定各組體質(zhì)量,SG組體質(zhì)量均顯著低于肥胖組(P<0.05),提示SG手術(shù)干預(yù)成功。

    三組術(shù)后第2周攝食量分別為(29.34±1.19)g、(32.11±0.94)g和(15.89±1.12)g,SG組顯著降低(P<0.05)。隨后SG組術(shù)后的攝食量緩慢增加,至術(shù)后第8周,三組的攝食量分別為(30.98±1.29)g、(32.17±1.17)g和(29.41±4.37)g,組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

    2 BMD變化

    雙能X線BMD儀測定結(jié)果提示肥胖組股骨和脊柱BMD較空白對照組大鼠顯著降低(P<0.05),SG組術(shù)后大鼠的BMD進(jìn)一步降低,組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1a、b。

    3 骨組織學(xué)的變化

    股骨HE染色(圖2a),SG組較其他兩組骨小梁顯著變細(xì),部分出現(xiàn)斷裂和穿孔,骨小梁間隔增寬和連接消失。同時部分大鼠股骨出現(xiàn)骨皮質(zhì)變薄,炎細(xì)胞浸潤增加。肥胖組和SG組脛骨骨皮質(zhì)無顯著肉眼可見的差異,但SG組的骨小梁同樣顯著變細(xì)(圖2b)。

    4 血鈣、PTH和25(OH)D3

    術(shù)后8周空白對照組、肥胖組和SG組血鈣分別為(2.21±0.47)mmol/L、(2.33±0.59)mmol/L和(2.20±0.51)mmol/L,PTH各組分別為(32.85±4.18)ng/L、(34.55±6.42)ng/L和(35.01±8.91)ng/L,25(OH)D3分別為(18.21±3.95)μg/L、(18.58±4.44)μg/L和(19.34±6.73)μg/L,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)合SG后攝食量的結(jié)果,提示SG能有效控制體重,但對營養(yǎng)物質(zhì),特別是Ca吸收未造成顯著影響。

    5 骨代謝指標(biāo)的變化

    肥胖組和SG組CTX較空白對照組顯著升高,但肥胖組和SG組組間無差異(P>0.05)。圖1c。肥胖組和SG組的血清PINP亦較空白對照組顯著升高,但兩組組間無差異(P=0.09)。圖1d。肥胖組TRACP-5a較另外兩組顯著升高,SG組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1e)。SG組TRACP-5b顯著高于空白對照組,但與肥胖組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,空白對照組與肥胖組比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1f)。

    6 骨髓脂肪細(xì)胞

    肥胖組和SG組脛骨中段脂肪細(xì)胞數(shù)量分別為(11.2±2.8)個和(13.7±3.9)個,兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.11)(圖3)。

    圖1 術(shù)后8周三組BMD、CTX、PINP、TRACP-5a和TRACP-5b比較(*P<0.05空白對照組 vs.肥胖組;@P<0.05空白對照組 vs.SG組;#P<0.05肥胖組vs.SG組)

    圖2 術(shù)后8周股骨和脛骨HE染色(10×10)。a.三組右側(cè)股骨HE染色(10×10,SG組較其它兩組骨小梁顯著變細(xì),部分出現(xiàn)斷裂和穿孔,同時部分大鼠股骨出現(xiàn)骨皮質(zhì)變薄,炎細(xì)胞浸潤增加);b.肥胖組和SG組脛骨HE染色(10×10,SG骨小梁顯著變細(xì),部分出現(xiàn)斷裂和穿孔,炎細(xì)胞浸潤增加)

    圖3 術(shù)后8周肥胖組和SG組脛骨中段HE染色(10×40,黑箭頭所示為骨髓中的脂肪細(xì)胞)

    討 論

    2018年聯(lián)合國糧農(nóng)組織關(guān)于超重以及肥胖問題的報道指出,超重和肥胖已成為一種全球性的“流行病”。SG術(shù)由于其確切的療效以及較少的并發(fā)癥已經(jīng)逐漸取代胃旁路手術(shù),逐漸成為最流行的減重手術(shù)。已有報道指出SG術(shù)后會出現(xiàn)骨密度持續(xù)性降低和骨折風(fēng)險的增加。本研究SG大鼠模型中發(fā)現(xiàn)SG可能導(dǎo)致骨折風(fēng)險[1,3-5]升高,主要表現(xiàn)為大鼠股骨和脊柱的BMD顯著下降,股骨和脛骨的骨小梁破壞明顯,最初的理論常認(rèn)為是SG術(shù)后能量攝入的減少導(dǎo)致了骨健康的惡化。但在本研究中術(shù)后第2周即恢復(fù)SG組不限量的高脂飲食,至術(shù)后第8周的攝食量已與其他兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。另一方面,三組的血鈣、PTH以及25(OH)D3差異無統(tǒng)計學(xué)意義,因此不能以機(jī)體能量攝入和骨代謝原料[血鈣和25(OH)D3]的減少來解釋SG術(shù)后骨健康狀態(tài)的變化。

    骨代謝生化指標(biāo)包括鈣磷代謝調(diào)節(jié)指標(biāo)、骨形成標(biāo)志物、骨吸收標(biāo)志物、激素與細(xì)胞因子。雖然骨代謝指標(biāo)不能作為診斷骨相關(guān)疾病的金標(biāo)準(zhǔn),但是常用于評價骨代謝狀態(tài)、預(yù)測骨折風(fēng)險等。CTX是骨吸收的重要指標(biāo),其升高程度與破骨細(xì)胞[6-7]活性增高相一致[8]。TRACP-5b作為第二代骨吸收標(biāo)志物,是一個有特異和高敏感的骨吸收指標(biāo),主要來源于破骨細(xì)胞。CTX和TRACP-5b在骨質(zhì)疏松患者中明顯增高,對于骨折風(fēng)險預(yù)測具有主要的意義[7,9]。PINP是新骨形成的特異性敏感指標(biāo),在兒童發(fā)育期、妊娠晚期、骨腫瘤和骨轉(zhuǎn)移等情況下會明顯升高。Ivaska等[6]報道19例糖尿病肥胖患者和27例非糖尿病肥胖患者行旁路手術(shù)和SG術(shù),術(shù)后6個月檢測CTX、PINP和TRACP-5b等骨代謝指標(biāo),發(fā)現(xiàn)旁路手術(shù)和SG術(shù)后骨代謝指標(biāo)均明顯增高,同時在體重減輕后2型糖尿病緩解的患者中骨代謝指標(biāo)變化的更為顯著。本研究中CTX、PINP以及TRACP-5b的結(jié)果提示肥胖個體骨代謝指標(biāo)顯著活躍,主要表現(xiàn)在骨吸收和骨形成的平行增加,而以骨吸收升高更為明顯。由于檢測時點為體重已達(dá)平臺期,負(fù)重變化的影響可忽略。而SG術(shù)后增加能量攝入不可逆轉(zhuǎn)骨損害,提示SG術(shù)所造成的骨損害不單單與能量平衡狀態(tài)有關(guān)。

    有研究指出SG術(shù)后造成顯著的腰椎和股骨干骨髓脂肪組織積聚,并與骨密度降低顯著相關(guān)[10],這提示SG術(shù)后體脂肪減少和骨髓脂肪組織異常積聚的重分布現(xiàn)象可能與骨健康惡化相關(guān)。骨髓脂肪細(xì)胞(bone marrow adipose tissue,BMAT)在同時參與能量代謝和骨重塑形成過程中是橋接能量和骨代謝的媒介,主要可以分為結(jié)構(gòu)性BMAT(cBMAT)和調(diào)節(jié)性BMAT(rBMAT),兩者在分布范圍及造血潛能方面截然不同[11-12]。因此在特殊的能量狀態(tài)下(如SG術(shù)后)可能會影響骨髓微環(huán)境的變化,并進(jìn)一步影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨化/脂化的種系分化走向,從而影響骨的代謝與更新。本研究初步分析了脛骨骨髓中的脂肪細(xì)胞個數(shù),雖然SG組的脂肪細(xì)胞數(shù)較高脂組高,但并未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異。分析原因,一方面可能與實驗時間以及樣本數(shù)量有關(guān),另一方面可能與選取標(biāo)本的部位和采取計數(shù)方法的精密度不同有關(guān)。即便如此,研究結(jié)果提示了一個方向,即SG術(shù)后BMAT的變化是否是骨健康惡化的原因。進(jìn)一步精確的分析BMAT數(shù)量、超微結(jié)構(gòu)以及骨髓脂肪微環(huán)境的分子表達(dá)狀況,如脂環(huán)素、瘦素和脂類組學(xué),可能更為精確地判斷SG術(shù)后骨髓脂肪細(xì)胞的變化,并對SG術(shù)后骨健康狀態(tài)變化做出更全面的解釋。

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