吉西他濱單磷酸鹽/紫杉醇聯(lián)用靶向納米粒的制備及其大鼠體內(nèi)藥動學研究

賴夢琴，張 鵬,，楊 明,，李 翔,*，張 婧,*

1.江西中醫(yī)藥大學 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004

2.江西中醫(yī)藥大學 創(chuàng)新藥物與高效節(jié)能降耗制藥設(shè)備國家重點實驗室，江西 南昌 330006

3.九江學院 臨床醫(yī)學院/附屬醫(yī)院，江西 九江 332000

紫杉醇（paclitaxel，PTX）通過促進微管聚合，抑制微管蛋白解聚，誘導細胞周期阻滯在G2與M期并促進凋亡，具有獨特的抗腫瘤機制[1-2]，被廣泛應(yīng)用于乳腺癌等各種腫瘤的治療，然而紫杉醇幾乎不溶于水、且無選擇性全身分布是限制其臨床應(yīng)用的主要原因[3-4]。為此，制劑工作者嘗試采用多種制劑技術(shù)方法改善其水溶性及靶向性[5-6]。吉西他濱（gemcitabine，GEM）作為水溶性胞嘧啶核苷衍生物，是細胞周期特異性抗代謝藥物，通過核苷激酶磷酸化，轉(zhuǎn)化成具有活性的二磷酸及三磷酸核苷發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。紫杉醇/吉西他濱作用機制相異、無交叉耐藥性[8]，聯(lián)合用藥后毒性顯著下降[9-10]，然而由于紫杉醇與吉西他濱溶解性完全相反，且吉西他濱的體內(nèi)半衰期比較短，影響了藥物聯(lián)用的臨床效果。

由于第1 步的單磷酸化反應(yīng)為吉西他濱能夠產(chǎn)生活性的重要限速步驟[11-12]，因此本課題使用吉西他濱單磷酸鹽（gemcitabine monophosphate，GMP）作為吉西他濱替代藥物。前期研究結(jié)果表明GMP具有和吉西他濱相同的作用機制，且無明顯骨髓抑制反應(yīng)[13]，本課題組前期已成功采用反相微乳液法在反相微乳體系中制備了尺寸均一、分散性良好且負載GMP 藥物的單層脂質(zhì)包裹的磷酸鈣納米核心（GMP-Cores）[14]。

為了驗證并實現(xiàn)GMP 和紫杉醇的協(xié)同作用，本實驗進一步將GMP-Cores、紫杉醇、膽固醇、長循環(huán)靶向磷脂分散于有機溶劑中，采用薄膜分散法對GMP-cores 進行二次包裹，得到非對稱脂質(zhì)雙層修飾的紫杉醇/GMP 的納米粒（asymmetric lipid layers coated nanoparticles co-loaded with gemcitabine monophosphate and paclitaxel，P/G-NPs，結(jié)構(gòu)示意圖見圖1），并對所得P/G-NPs 的理化性質(zhì)及體內(nèi)藥動學行為進行評價。

圖1 P/G-NPs 結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic structure of P/G-NPs

1 儀器與材料

1.1 儀器

JEM-1200 EX 型透射電子顯微鏡（TEM），日本JEOL 公司；Nano ZS 型納米粒度儀，英國Malvern公司；3-18K 型冷凍高速離心機，德國Sigma 公司；Qtrap4500 三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀，美國AB Sciex公司；減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi 公司；Bio-RAD 680 酶標儀，美國Bio-RAD 公司；FV1000-IX81 激光共聚焦顯微鏡，日本Olympus 公司；BSA124S電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司；KQ5200BE 型數(shù)控超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；JY92-ⅢN 探頭超聲儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；DF-101S 磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司。

1.2 材料

紫杉醇，質(zhì)量分數(shù)≥97%，美國Sigma-Aldrich公司；GMP，質(zhì)量分數(shù)≥97%，常州施嘉生物醫(yī)藥科技有限公司；紫杉醇注射劑（規(guī)格5 mL∶30 mg），批號1604201，四川三精升和制藥有限公司，國藥準字H20046119；多西紫杉醇（doxorubicin，DOX），質(zhì)量分數(shù)≥99.0%，批號18072044，上海同田生物技術(shù)股份有限公司；頭孢克洛（cefaclor，CEC），質(zhì)量分數(shù)94.4%，批號130481-201205，中國食品藥品檢定研究院；1,2-二油?；?3-三甲基銨-丙烷（甲基硫酸鹽）（ 1,2-dioleoyl-3-trimethylammoniumpropane chloride salt，DOTAP）和二油酰磷脂酸（dioleoylphosphatidic acid，DOPA），美國Avanti Polar Lipids 公司；1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇 2000（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]，DSPE-PEG2000）和1,2-二硬酯酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-cRGD（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000]-cRGD，DSPEPEG2000-cRGD），西安瑞禧生物科技有限公司；表面活性劑聚氧代乙烯（5）壬基苯基醚，支化（Igepal?CO-520），美國Sigma 公司；實驗用水為去離子水，甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑或藥品均為分析純。

人乳腺癌MCF-7 細胞，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清，美國Gibco 公司；CCK-8 試劑盒、膽固醇，美國Sigma公司。SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，雄性，湖南斯萊克景達有限公司提供，合格證號：SCXK（湘）2019-0004。所有動物實驗遵循江西中醫(yī)藥大學有關(guān)實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R 原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 體外協(xié)同作用考察

取對數(shù)生長期的MCF-7 細胞，以細胞數(shù)5×104/mL 接種在96 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄去上層培養(yǎng)液，分別加入含有不同物質(zhì)的量比藥物溶液的培養(yǎng)基（free PTX/GMP，P/G-Free）（給藥組為實驗組），同時設(shè)置陰性對照孔（以未給藥的含細胞組為對照組）和空白孔（RPMI 1640 培養(yǎng)基的不含細胞孔作為空白組），每個濃度設(shè)3 復孔，24 h 后每孔加入CCK-8 液10 μL，混勻，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，以酶標儀檢測450 nm 處的吸光度（A）值，按照說明書計算細胞生長抑制率［生長抑制率＝(A對照－A實驗)/(A對照－A空白)］。P/G-Free對MCF-7 細胞的生長抑制率結(jié)果見表1。

采用金正均Q值法判斷兩藥是否具有協(xié)同作用，計算q值[15]：q＝Eab/(Ea＋Eb－Ea×Eb)，其中Ea、Eb為單藥抑制率，Eab為兩藥合用抑制率。

q值計算結(jié)果見表2，其中，q＞1.15 為協(xié)同作用，0.85≤q≤1.15 為相加作用，q＜0.85 為拮抗作用。結(jié)果見表2，當GMP 與紫杉醇混合物質(zhì)的量比為17∶1 時，q值為0.908，表現(xiàn)為相加作用且抑制率最高。

2.2 P/G-NPs 的制備

2.2.1 GMP-Cores 的制備 采用反向微乳法制備納米核心GMP-Cores[14]。取一定量含有環(huán)己烷-Igepal?CO-520 溶液（71∶29）的混合物作為油相，分成2份（A 和B）。A 油相中滴加300 μL 60 mmol/L CaCl2溶液；B 油相中滴加300 μL 由75 μL 50 mmol/L Na2HPO4、90 μL 60 mmol/L GMP 組成的水溶液，攪拌均勻后加入1 mL 20 mmol/L DOPA，然后將A、B 2 相混合，繼續(xù)在混合液中滴加1 mL 20 mmol/L DOPA，20 min 后待反應(yīng)完成，加入等量無水乙醇破乳，4 ℃高速離心（10 000×g）20 min，棄去上清液，無水乙醇洗滌2 次后，將得到的GMP-Cores溶解在氯仿中，置于-20 ℃冰箱中備用。

表1 P/G-Free 對MCF-7 細胞的生長抑制率 (n = 3)Table 1 Inhibition rates of P/G-Free on MCF-7 cells (n = 3)

表2 P/G-Free 對MCF-7 細胞的協(xié)同抑制作用 (n = 3)Table 2 Synergistic inhibition effect of P/G-Free on MCF-7 cells (n = 3)

2.2.2 P/G-NPs 的制備 采用改進的薄膜分散法[16]，制備P/G-NPs。將GMP-Cores 與紫杉醇（GMP 與紫杉醇的物質(zhì)的量比為17∶1），總磷脂與膽固醇質(zhì)量比為 7.1∶1，含 cRGD 多肽的磷脂混合物（DOTAP、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-cRGD質(zhì)量比3.5∶11∶1）共同溶解于一定量氯仿中，旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)除去有機溶劑，并在恒定的氮氣流下進一步干燥30 min，以在玻璃壁表面形成含藥的脂質(zhì)薄膜。以水為水化介質(zhì)，60 ℃水浴攪拌30 min，洗脫脂質(zhì)薄膜，所得混懸液于200 W 功率下探頭超聲2 min，得到的混懸液通過0.22 μm 濾膜濾過，并儲存在4 ℃。

2.3 理化性質(zhì)考察

2.3.1 GMP 和紫杉醇的測定 采用三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀（LC-MS/MS）測定GMP 和紫杉醇的含量。

（1）色譜條件：色譜柱為Welch Materials 柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～1 min，50%乙腈；1～2.5 min，55%乙腈；2.5～3 min，96%乙腈；3～6.6 min，10%乙腈；體積流量0.28 mL/min；自動進樣器溫度25 ℃，進樣體積10 μL。

（2）質(zhì)譜條件：質(zhì)譜儀在多離子反應(yīng)監(jiān)測模式下以正離子模式操作。用于GMP 和內(nèi)標CEC 的定量分析的離子反應(yīng)比分別為m/z342.0→301.2和m/z368.1→174.1。GMP 與內(nèi)標的碰撞能量分別為15、16 eV。紫杉醇和內(nèi)標DOX 的定量分析的離子反應(yīng)比分別為m/z876.3→308.1 和m/z830.5→549.3。紫杉醇和內(nèi)標的碰撞能量分別為37、36 eV。電離條件包括使用電噴霧離子源，注入電壓為5.5 kV，離子源溫度為600 ℃，GS1 和GS2 壓力為379.21 kPa（55 psi），碰撞氣體壓力為48.26 kPa（7 psi）。

以質(zhì)量濃度為縱坐標（Y），藥物峰面積與內(nèi)標峰面積比值為橫坐標（X）建立標準曲線，得紫杉醇、GMP 線性回歸方程分別為Y＝0.113 1X＋0.050 3（r＝0.999 0）、Y＝0.019 9X－0.003 8（r＝0.998 5），線性范圍依次為紫杉醇 0.02～20.00 μg/mL、GMP 0.01～10.00 μg/mL。

2.3.2 包封率與載藥量的測定 采用超濾離心分離游離藥物[17]。取P/G-NPs 適量置于超濾離心管中（截留相對分子質(zhì)量10 000），4 ℃離心（4000×g）15 min，收集濾液，采用“2.2”項下方法測定濾液中GMP、紫杉醇含量（Wfree）；另取等體積P/G-NPs，按照1∶4 的體積比加入有機溶劑［四氫呋喃-1 mol/L 鹽酸（7∶3）］，渦旋混勻，測定混合液中GMP、紫杉醇含量（Wtotal），計算P/G-NPs 的包封率［包封率＝(Wtotal－Wfree)/Wtotal］與載藥量［載藥量＝(Wtotal－Wfree)/W納米粒］，其中納米粒總質(zhì)量（W納米粒）由冷凍干燥后稱定計算得到。結(jié)果紫杉醇、GMP的包封率分別為（98.70±0.50）%、（93.60±1.20）%（n＝3），載藥量分別為（0.800±0.004）%、（6.300±0.100）%（n＝3）。

2.3.3 形態(tài)及粒徑、Zeta 電位測定 分別取GMPCores 和P/G-NPs 5 μL 滴加于銅網(wǎng)上，2 min 后吸去多余液體，自然晾干，TEM 下觀察，GMP-Cores呈球形，分散性好，透射電鏡測得的粒徑約20 nm（圖2-A）。表面修飾非對稱的磷脂雙分子層，并將脂溶性的紫杉醇嵌入于磷脂雙分子層后，觀察到球形或橢球形P/G-NPs（圖2-B）。

圖2 GMP-Cores (A) 和P/G-NPs (B) 的TEM 圖Fig.2 TEM of GMP-Cores (A) and P/G-NPs (B)

采用馬爾文激光粒度測定儀測定其粒徑及Zeta電位。結(jié)果P/G-NPs 的平均粒徑為（85.7±10.5）nm（n＝3），多分散指數(shù)為0.14±0.06（n＝3），Zeta電位為（18.3±0.63）mV（n＝3）。

2.4 體外釋放度考察[18]

采用流通池法考察P/G-NPs 的體外釋放（CE7 Smart，美國Sotax 公司）。精密量取一定量的P/GNPs，置于透析袋中（截留相對分子質(zhì)量300 000），然后放置于100 mL 不同pH 值的PBS 溶液中（含有0.5%聚山梨酯80，pH 7.4、6.5、5.0），在37 ℃、200 r/min 的條件下恒溫振蕩。分別于0.5、1、2、4、8、12、24 h 取樣1 mL，并補充相同體積的新鮮釋放介質(zhì)，按“2.3.1”項下測定釋放介質(zhì)中藥物的質(zhì)量濃度，以釋放時間為橫坐標、累積釋放率為縱坐標繪制釋放曲線，結(jié)果見圖3。P/G-NPs 的藥物釋放未見明顯突釋。對于紫杉醇，在不同pH 值釋放介質(zhì)中均釋放快于GMP，尤其在pH 7.4 條件下24 h累積釋放率達到50%。對于GMP，隨著釋放介質(zhì)pH 值的降低，P/G-NPs 釋放速度逐漸加快，pH 值為5 介質(zhì)中在24 h 藥物累積釋放率達到34%，分別是pH 7.4、6.5 條件下釋放度的3.8、1.7 倍，說明P/G-NPs 中GMP 的釋放具有一定的pH 值敏感性，對腫瘤內(nèi)部酸性環(huán)境具有響應(yīng)性。

圖3 P/G-NPs 中的GMP 和紫杉醇在不同pH 值介質(zhì)中的體外釋放曲線 (n = 3)Fig.3 In vitro release profiles of GMP and PTX from P/G-NPs in media with different pH values (n = 3)

2.5 藥物動力學研究

2.5.1 血漿樣品處理 取大鼠眼眶靜脈血300 μL加入到肝素鈉抗凝血管中，8000 r/min 離心10 min，取上清液備用。取血漿100 μL，精密加入質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL DOX 的甲醇溶液50 μL 作為紫杉醇的內(nèi)標，加入質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL 頭孢克洛內(nèi)標水溶液50 μL 作為GMP 的內(nèi)標，渦旋5 min，再加入300 μL 甲醇沉淀劑，繼續(xù)渦旋5 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液按照“2.3.1”項下方法進樣檢測。

圖4 空白血漿 (A)、空白血漿加紫杉醇和DOX (B)、空白血漿加GMP 和CEC (C)、空白血漿加紫杉醇、DOX、GMP和CEC (D)的HPLC 圖Fig.4 HPLC of blank plasma (A),plasma spiked with PTX and DOX (B),plasma spiked with GMP and CEC (C),and plasma spiked with PTX,DOX,GMP and CEC (D)

2.5.2 專屬性考察 專屬性考察結(jié)果如圖4 所示，在此色譜條件下，可實現(xiàn)同時檢測溶解度不同的紫杉醇和GMP，與血漿內(nèi)源性物質(zhì)分離良好。

2.5.3 精密度實驗 精密稱取紫杉醇和GMP 對照品適量，用甲醇溶解并定容，搖勻，再次稀釋至系列質(zhì)量濃度，得到混合對照品溶液，將空白血漿與對照品溶液混勻，按照“2.5.1”項下操作，得到紫杉醇的質(zhì)量濃度分別為0.1、2.0、20.0 μg/mL，GMP的質(zhì)量濃度分別為0.05、1.00、10.00 μg/mL 的低、中、高3 個質(zhì)量濃度的樣品，平行制備5 份樣本進行檢測。每個質(zhì)量濃度在同1 d 內(nèi)檢測3 次，分別計算紫杉醇和GMP 的日內(nèi)精密度；相同的方法下每個濃度連續(xù)檢測3 d，分別計算紫杉醇和GMP 的日間精密度，結(jié)果見表3，結(jié)果顯示該方法日內(nèi)、日間精密度RSD＜15%，符合方法學要求。

表3 紫杉醇和GMP 血漿樣品的精密度考察 (n = 5)Table 3 Precision of PTX and GMP plasma samples (n = 5)

2.5.4 提取回收率 配制質(zhì)量濃度分別為0.1、2.0、20.0 μg/mL 的低、中、高3 個質(zhì)量濃度的紫杉醇血漿樣品，質(zhì)量濃度分別為0.05、1.00、10.00 μg/mL的低、中、高3 個質(zhì)量濃度的GMP 血漿樣品，按照“2.5.1”項下方法分別測定紫杉醇、GMP 的峰面積（A實測）。

精密稱取紫杉醇和GMP 對照品適量，用甲醇溶解并定容，搖勻，再次稀釋至系列濃度，得到混合對照品溶液，將空白血漿與對照品溶液混勻，按照“2.5.1”項下操作，得到紫杉醇的濃度分別為0.1、2.0、20.0 μg/mL、GMP 的濃度分別為0.05、1.00、10.00 μg/mL 的低、中、高3 個質(zhì)量濃度的樣品，測定紫杉醇和GMP 的峰面積（A理論）。計算紫杉醇和GMP 的提取回收率（提取回收率＝A實測/A理論），平行5 次。結(jié)果表明，高、中、低3 個質(zhì)量濃度的紫杉醇提取回收率均在86.4%～95.5%，高、中、低3個質(zhì)量濃度的GMP 提取回收率均在 80.3%～94.4%，符合生物樣品檢測要求。

2.5.5 藥動學實驗 SD 大鼠12 只，體質(zhì)量（200±20）g，隨機分為2 組，實驗前禁食不禁水。按照16 mg/kg GMP 和2.0 mg/kg 紫杉醇的劑量尾iv 分別注射P/G-Free（按照規(guī)定劑量將GMP 溶解于紫杉醇注射液中）、P/G-NPs，分別于給藥后1、4、7、15、30 min 及1、2、4、8、12 h，大鼠眼眶靜脈叢取血0.5 mL，放置于低溫離心機6000 r/min 離心5 min，取上清按照“2.5.1”項下方法處理，檢測紫杉醇及GMP 的血藥濃度，數(shù)據(jù)經(jīng)PK solver 軟件處理，血藥濃度-時間曲線如圖5 所示，藥動學參數(shù)結(jié)果見表4。

圖5 靜脈注射含有紫杉醇、GMP 不同制劑的血藥-濃度時間曲線 (n = 6)Fig.5 Plasma concentration-time curves of PTX and GMP after iv injection of different preparations (n = 6)

3 討論

多成分藥物聯(lián)合治療在腫瘤等疾病領(lǐng)域愈發(fā)重要，將多種成分同時包載于納米載體中，可以保持藥物活性的同時，進一步發(fā)揮其相加作用而增強制劑療效[19]。本研究采用核-殼結(jié)構(gòu)納米粒對紫杉醇、GMP 進行聯(lián)合包載。紫杉醇、GMP 分別從抑制微管蛋白解聚、阻止DNA 聚合酶鏈延長、降低核苷酸還原酶活力等方面對腫瘤細胞起到殺傷作用[20]。紫杉醇/吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用與單純紫杉醇的III 期試驗表明，在紫杉醇中加入吉西他濱，對先前接受蒽環(huán)類藥物治療的乳腺癌婦女，是一種有效的治療方法[21]。本實驗設(shè)計金正均Q值法實驗也證明了紫杉醇及GMP 單藥在物質(zhì)的量比為17∶1 的條件下可以對降低MCF-7 細胞細胞活力起到協(xié)同作用。

本研究采用反相微乳法制備了粒徑可控的GMP-Cores，并用薄膜分散法在GMP-Cores 表面包裹非對稱的磷脂雙分子層，并將脂溶性的紫杉醇嵌入于磷脂雙分子層，雙分子層修飾cRGD 靶向長循環(huán)磷脂，制備得到主動靶向P/G-NPs。體外釋放結(jié)果顯示，和GMP 相比，紫杉醇釋放速度更快，原因在于紫杉醇位于磷脂雙分子層疏水區(qū)，而GMP包裹于內(nèi)部核心顆粒中，因此紫杉醇更容易接觸釋放介質(zhì)。由于GMP 是在發(fā)生磷酸鹽與鈣鹽共沉淀的過程中，包裹于Ca-P 顆粒中，其釋放特性具有一定的酸敏感特性，體外不同pH 釋放介質(zhì)對GMP 的體外釋放行為的影響也顯示，Ca-P 在接近內(nèi)涵體酸性pH 條件下（pH 5.0～5.5）可快速溶解，GMP 釋放速度快于pH 7.4、6.5，這有利于實現(xiàn)納米粒在內(nèi)涵體內(nèi)造成滲透壓的失衡致內(nèi)涵體破裂，釋放藥物進入胞漿中，使其具有自發(fā)的胞漿釋藥特性。

表4 P/G-Free 和P/G-NPs 中紫杉醇和GMP 的藥動學參數(shù) (n = 6)Table 4 Pharmacokinetic parameters of PTX and GMP in P/G-Free and P/G-NPs (n = 6)

藥動學結(jié)果顯示，P/G-NPs 中紫杉醇和GMP的最大血漿濃度（Cmax）均顯著高于P/G-Free。P/G-NPs（AUC0～t）的面積比P/G-Free 高6 倍，平均停留時間（MRT0～t）增加2.3 倍。與P/G-Free 相比，P/G-NPs 中紫杉醇和GMP 的Vz值明顯降低，分別為50.3%和72.1%，說明與P/G-Free 相比，P/G-NPs 可實現(xiàn)較好的長循環(huán)效果，這與納米粒中PEG2000 修飾磷脂相關(guān)，PEG 可在納米粒表面水化形成屏障[22]，可減少血液中蛋白對其的吸附，還可幫助納米粒逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮吞噬系統(tǒng)的捕獲，使得納米粒在血液系統(tǒng)中的穩(wěn)定性明顯提高。

在長循環(huán)PEG 鏈可延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間的同時，P/G-NPs 表明修飾 DSPE-PEG2000-cRGD，其靶向基團cRGD 可與癌細胞表面αvβ3/β5整合素受體特異性結(jié)合[23-24]，進而通過內(nèi)吞作用進入腫瘤細胞，有望進一步增強納米粒靶向性，在腫瘤部位發(fā)揮藥物協(xié)同作用，提高藥物抗腫瘤效果。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突