微波-無水氯化鈣真空干燥聯(lián)合脫除水飛薊素中殘留乙醇的研究

＊陳家寶 李爽 田麗敏 劉慧

（武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院 綠色化工過程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北 430205）

水飛薊素是一類傳統(tǒng)的肝臟疾病輔助治療藥物[1]，最早是由Wagner等科學(xué)家從菊科草本植物水飛薊的果實(shí)和種子中提取出來的一類天然活性成分，該藥物在南歐、北非較為流行，我國于1972年引進(jìn)栽培水飛薊。水飛薊素具有良好的藥理活性，除了具有保肝、護(hù)肝的功效外，對(duì)一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茲海默癥等都有較好的治療效果。水飛薊素主要包括水飛薊賓、水飛薊寧、異水飛薊賓等四種異構(gòu)的黃酮類成分，被稱為“天然的護(hù)肝藥”，其中，水飛薊賓含量最高，占到了60%～70%，護(hù)肝活性最強(qiáng)[2]。

水飛薊素是從水飛薊的果實(shí)和種子中提取出來的有效成分，傳統(tǒng)藥用植物的活性組分一般比較復(fù)雜，由于其活性成分的特殊性，其分離、提取、純化的工藝也比較復(fù)雜。傳統(tǒng)的分離、提取方法有溶劑提取法和水蒸氣蒸餾法，近年來，一些超臨界流體的發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了超臨界流體萃取技術(shù)的發(fā)展，新型的半仿生提取和酶工程技術(shù)也有所突破，目前在工業(yè)上，根據(jù)水飛薊素易溶于丙酮、乙醇以及乙酸乙酯等有機(jī)溶劑的溶解特性，主要是通過機(jī)械壓榨出脂肪（油）后，再溶于丙酮、乙醇以及乙酸乙酯等有機(jī)溶劑中，加熱回流，經(jīng)過多次萃取、洗脫、重結(jié)晶來提取有效組分[3]。其中，乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑作為一種溶劑應(yīng)用于水飛薊素的提取、重結(jié)晶工藝中，作為第三類溶劑，根據(jù)《中國藥典》2020版以及人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）的規(guī)定，乙醇的溶劑殘留限度不得超過0.5%。干燥、沸騰干燥、真空干燥等方法都能有效除去殘留乙醇，隨著當(dāng)代膜分離技術(shù)的發(fā)展，滲透汽化在脫醇技術(shù)上有著巨大的應(yīng)用潛力。

微波是一種常見的電磁波，波長在0.1mm到1m之間，微波干燥技術(shù)是一種通過微波輻照，物體內(nèi)外同時(shí)受熱，使物體內(nèi)部迅速產(chǎn)生蒸氣，形成壓力梯度從而產(chǎn)生推動(dòng)力加快物料干燥的一種方法。因?yàn)槲⒉訜崾求w熱源加熱，在沒有其它輔助熱源的情況下，一般其內(nèi)部溫度都會(huì)高于表面溫度[4]。微波干燥技術(shù)在許多行業(yè)都已經(jīng)廣泛應(yīng)用，20世紀(jì)60年代初，國外就報(bào)道了許多微波干燥技術(shù)及原理的文獻(xiàn)，我國在微波干燥技術(shù)方面起步較晚，與國外有一定差距，但在食品、醫(yī)藥等行業(yè)也取得了重大突破。研究表明，若將物料平鋪，熱能會(huì)迅速累積，達(dá)到迅速干燥的效果。傳統(tǒng)的熱干燥技術(shù)（如熱風(fēng)干燥、蒸汽干燥等）存在著對(duì)環(huán)境不友好，污染嚴(yán)重，設(shè)備容易銹蝕等缺點(diǎn)，相比較來言，微波干燥技術(shù)具有綠色、環(huán)保的特點(diǎn)，其干燥速度快，可在較低的干燥環(huán)境下對(duì)物料進(jìn)行加熱，從內(nèi)部加熱等特點(diǎn)能有效避免表皮過熱，烤焦等情況，不破壞物料。隨著全球變暖日益嚴(yán)重，近年來我國也加入到“碳中和”“碳達(dá)標(biāo)”等新理念中，全球?qū)?jié)能減排的呼吁導(dǎo)致能源結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，與傳統(tǒng)的干燥技術(shù)相比，微波干燥的優(yōu)勢(shì)非常明顯的體現(xiàn)出來。

工業(yè)上在用乙醇提取、重結(jié)晶水飛薊素的過程中，乙醇被包裹在水飛薊素中或是與水飛薊素共同構(gòu)成晶體從而在產(chǎn)品中殘留下來，我們通過微波干燥和無水氯化鈣真空干燥聯(lián)用的方法脫除水飛薊素中的殘留乙醇，首先利用微波輻照，使水飛薊素中的微分子進(jìn)行震動(dòng)，將包裹的乙醇釋放出來，釋放出來的乙醇一部分直接受熱揮發(fā)脫除，一部分繼續(xù)吸附在水飛薊素表面。吸附在水飛薊素表面的殘留乙醇，使用無水氯化鈣真空干燥的辦法脫除，無水氯化鈣是一種常見的干燥劑，乙醇分子中氧的孤電子對(duì)和氯化鈣游離離子的空軌道形成配位鍵，所以利用氯化鈣和乙醇可以形成結(jié)晶醇的機(jī)理，將微波輻照過后的水飛薊素加入到無水氯化鈣的真空干燥器中，殘留在水飛薊素表面的乙醇在低壓下?lián)]發(fā)，同真空干燥器中的無水氯化鈣形成結(jié)晶醇，從而達(dá)到除去乙醇的目的。

1.儀器與試劑

Ganlanz G80F20CN1L-DG（W0）微波爐，真空干燥器（成都蜀牛科技有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵，紅旗Y-60真空表，Agilent 7890氣相色譜儀，Agilent7697A頂空進(jìn)樣裝置，配有Agilent操作控制及積分軟件，NHA-300氮?dú)淇找惑w機(jī)，AB204-N分析天平（南京安鐸貿(mào)易有限公司），傅里葉紅外光譜分析儀（WQF-510A/520A），甲醇、乙醇、DMF均為色譜純，無水氯化鈣，樣品為水飛薊素（遼寧沃德藥業(yè)樣品，乙醇含量為0.5043%）。

2.試驗(yàn)步驟

(1)微波干燥水飛薊素

精密稱取來自工廠樣品的乙醇含量不達(dá)標(biāo)的水飛薊素產(chǎn)品1.0000g，將稱取完的水飛薊素均勻平鋪在培養(yǎng)皿中，使其在培養(yǎng)皿中是足夠薄的一層，將培養(yǎng)皿放置于微波爐中進(jìn)行微波輻照，即得到微波干燥后的水飛薊素初品。

(2)真空干燥水飛薊素

在真空干燥器底層加入適量的無水氯化鈣，將處理后的水飛薊素初品于培養(yǎng)皿中一起置于真空干燥器中干燥，連接上循環(huán)水式真空泵抽真空至真空度為0.1MPa，干燥48h以上，期間多次重復(fù)抽真空，保持真空度，得到的樣品用頂空-氣相色譜法檢測其乙醇?xì)埩袅俊?/p>

(3)儀器分析

干燥好的樣品通過頂空進(jìn)樣方法進(jìn)行氣相色譜分析：

精密稱取甲醇適量，加DMF溶解稀釋成每毫升含3mg甲醇的內(nèi)標(biāo)溶液，精密稱取乙醇（色譜純）適量，加內(nèi)標(biāo)溶液稀釋成每毫升含2.5mg乙醇的對(duì)照溶液。精密稱取乙醇適量至10mL容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液稀釋成乙醇濃度為0.025μg/mL、0.25μg/mL、0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取干燥好的水飛薊素樣品0.5g加入到頂空瓶中，加已配好的內(nèi)標(biāo)溶液1mL溶解，頂空瓶預(yù)熱進(jìn)樣。

以KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜分析。

3.色譜條件

色譜柱：以5%二苯基-95%甲基聚硅氧烷為固定液的HP-5彈性石英毛細(xì)管柱（Agilent19091J-413，30m×320μm，i.d，0.25μm）；柱溫：初始溫度為40℃，維持6min，采用程序升溫以每分鐘15℃升溫至180℃，維持3min，采用氫火焰離子化檢測器（FID），檢測器溫度為250℃。載氣：高純氮，流速為1.7mL/min，分流比為1∶10。頂空預(yù)熱溫度為85℃，預(yù)熱時(shí)間為20min，傳輸管溫度為95℃，進(jìn)樣口溫度為105℃。

4.均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以水飛薊中殘留乙醇含量為指標(biāo)，應(yīng)用2因素6水平均勻設(shè)計(jì)法，探究微波功率、輻照時(shí)間對(duì)水飛薊中殘留乙醇含量的影響。按照U6（62）因素水平表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平表見表1，表2是常見的6因素6水平均勻設(shè)計(jì)表。

表1 因素水平Tab.1 Level of factor

表2 U6（66）均勻設(shè)計(jì)表Tab.2 Homogeneous design on U6(66)

利用均勻設(shè)計(jì)表來安排實(shí)驗(yàn)，在探究不同因素對(duì)于水飛薊中殘留乙醇含量的影響時(shí)，選取微波功率、微波輻照時(shí)間2因素，每個(gè)因素選取6個(gè)水平，即選取均勻設(shè)計(jì)表2中的前兩列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)安排，詳細(xì)的微波輻照時(shí)間及功率均勻設(shè)計(jì)安排表見表3。

表3 微波輻照時(shí)間及功率均勻設(shè)計(jì)表Tab.3 Uniform design of microwave irradiation time and power

5.結(jié)論與分析

(1)線性關(guān)系考察

分別取試驗(yàn)步驟3中標(biāo)準(zhǔn)溶液各1.0mL于6個(gè)頂空瓶中依次進(jìn)樣，通過積分確定峰面積，以乙醇濃度為橫坐標(biāo)，乙醇與甲醇的峰面積比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算得線性方程為Y=0.5392X-0.02837，r=0.9999，殘留乙醇濃度在0.025～20.0μg/mL內(nèi)，線性關(guān)系良好。

(2)均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與分析

按照表3，分別在微波功率0～800W、微波輻照時(shí)間1～6min中選取6個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示：

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Tab.4 Experimental results

續(xù)表

從表4的數(shù)據(jù)結(jié)果可以看出，6號(hào)樣的殘留乙醇含量最低，其輻照時(shí)間及微波功率也較高。

(3)數(shù)據(jù)處理

組別4是在微波功率水平為0，即結(jié)果是未經(jīng)處理過的水飛薊中的殘留乙醇，其作為對(duì)照組，對(duì)其它5組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用IBM SPSS Statistics22.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如表5所示。

表5 線性回歸分析結(jié)果Tab.5 Linear regression analysis results

從表5可知，將輻照時(shí)間（min），微波功率（%）作為自變量，而將殘留乙醇（%）作為因變量進(jìn)行線性回歸分析，從上表可以看出，模型公式為：殘留乙醇（%）=0.524-0.024×輻照時(shí)間（min）-0.001×微波功率（%），模型R2為0.990，對(duì)模型進(jìn)行F檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)模型通過F檢驗(yàn)（F=102.924，p=0.010＜0.05）也就是說明微波輻照時(shí)間及功率最少有一項(xiàng)會(huì)對(duì)水飛薊素中殘留乙醇的量產(chǎn)生影響，總回歸效果顯著。

輻照時(shí)間（min）的回歸系數(shù)值為-0.024（t=-8.187，p=0.015＜0.05），微波功率（%）的回歸系數(shù)值為-0.001（t=-7.771，p=0.016＜0.05），意味著輻照時(shí)間（min），微波功率（%）均會(huì)對(duì)殘留乙醇（%）產(chǎn)生顯著的負(fù)向影響關(guān)系。

(4)紅外譜圖分析

圖1為實(shí)驗(yàn)中在利用微波-無水氯化鈣真空干燥聯(lián)合脫除水飛薊素中殘留乙醇前和后水飛薊素的通過KBr壓片法進(jìn)行紅外分析得到的譜圖。圖1中顯示，使用微波和無水氯化鈣真空干燥聯(lián)用后得到的乙醇?xì)埩暨_(dá)標(biāo)的水飛薊素紅外吸收光譜圖與未處理前過的乙醇?xì)埩舨贿_(dá)標(biāo)得水飛薊素紅外吸收光譜圖并無明顯變化，說明水飛薊素的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化。

圖1 處理前后水飛薊的紅外譜圖Fig.1 Infrared spectra of Silybum marianum before and after treatment

(5)結(jié)果與討論

以微波輻照和無水氯化鈣真空干燥聯(lián)用的方法處理水飛薊素，在對(duì)微波功率和輻照時(shí)間雙因素進(jìn)行試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用均勻設(shè)計(jì)法研究其對(duì)殘留乙醇含量的影響。通過頂空-氣相色譜法檢測結(jié)果表4可以看出，在微波功率為0～800W之間，輻照時(shí)間1～6min之內(nèi)的條件下進(jìn)行微波干燥時(shí)，其在640W，微波輻照6min條件下，乙醇提取的比較徹底，為最優(yōu)條件。該方法使用純物理手段進(jìn)行殘留溶劑的脫除，不引入新的雜質(zhì)；在合適的微波條件下對(duì)水飛薊素的結(jié)構(gòu)不造成較大的破壞；操作簡單，成本損耗低，易于工業(yè)化，綠色無污染。該實(shí)驗(yàn)研究可為食品、藥品行業(yè)除殘留溶劑提供參考依據(jù)，為新型干燥技術(shù)的提高與完善提供研究基礎(chǔ)。