Biofire Filmarray下呼吸道試劑盒在危重癥新型冠狀病毒肺炎繼發(fā)感染患者中的應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

范俊平，肖 盟，王京嵐，陳 雨，張 棟，夏 鵬，柯帆航，趙 靜，楊燕麗，孫雪峰，趙 穎，徐英春

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 2檢驗(yàn)科 3腎內(nèi)科，北京 100730 4中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)八年制，北京 100730

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)已成為肆虐全球的大流行性疾病，與2009年的H1N1流感疫情相比，此次疫情的危重癥患者比率明顯升高，約5%需轉(zhuǎn)入ICU治療[1]。危重癥COVID-19患者，特別是轉(zhuǎn)入ICU的患者易繼發(fā)感染，預(yù)后較差[2-3]。對(duì)繼發(fā)感染者呼吸道標(biāo)本進(jìn)行涂片、培養(yǎng)、分離和鑒定以明確病原體是治療的關(guān)鍵，亦可減少不必要的抗生素尤其是廣譜抗生素的使用[4]。但傳統(tǒng)病原菌培養(yǎng)方法靈敏度差、耗時(shí)長(zhǎng)，而重癥患者病情變化快，對(duì)檢測(cè)的時(shí)限性要求高，傳統(tǒng)檢測(cè)方法難以滿足。近年來(lái)，雖然包括新一代測(cè)序技術(shù)在內(nèi)的分子病原學(xué)診斷得到快速發(fā)展，但由于呼吸道本身存在定植病原體，分子技術(shù)檢測(cè)過(guò)于敏感，難以準(zhǔn)確區(qū)分定植和致病病原體。此外，分子檢測(cè)手段常需外送標(biāo)本，耗時(shí)亦較久，限制了其廣泛應(yīng)用[5]。

梅里埃診斷的Biofire Filmarray下呼吸道試劑盒(pneumonia panel,PN)是一種新開(kāi)發(fā)的商業(yè)化病原學(xué)診斷技術(shù)，其將巢式多重PCR(nested multiplex PCR)與實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)相結(jié)合，可在同一試劑盒中執(zhí)行核酸提取、擴(kuò)增、檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析整個(gè)過(guò)程，并提供半定量報(bào)告。該試劑盒涵蓋18種常見(jiàn)細(xì)菌性病原體、9種病毒和7種耐藥基因(表1)，其應(yīng)用已得到美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)的批準(zhǔn)[6]。作為一種床旁檢測(cè)技術(shù)(point-of-care testing,POCT)，Biofire Filmarray PN樣品準(zhǔn)備時(shí)間僅數(shù)分鐘，約1 h即可出檢測(cè)結(jié)果，是一種方便快捷的下呼吸道病原學(xué)檢測(cè)手段。本研究旨在探討B(tài)iofire Filmarry PN在危重癥COVID-19繼發(fā)感染患者病原體檢測(cè)中的應(yīng)用效果。

表1 Biofire Filmarray下呼吸道試劑盒檢測(cè)靶標(biāo)分類

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為回顧性分析?；仡櫺允占⒎治?020年2月至4月武漢同濟(jì)醫(yī)院中法新區(qū)收入ICU(北京協(xié)和醫(yī)院援鄂醫(yī)療隊(duì)整建制接管該ICU病房)且接受下呼吸道病原學(xué)檢測(cè)的危重癥COVID-19患者的臨床資料。所有患者均經(jīng)口咽或鼻咽拭子PCR檢測(cè)確診為COVID-19，經(jīng)臨床表現(xiàn)及影像學(xué)表現(xiàn)確定為重型/危重型。

本研究已通過(guò)北京協(xié)和醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審批(審批號(hào)：ZS-2326)。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集

通過(guò)醫(yī)院信息系統(tǒng)收集患者基線資料、治療和預(yù)后信息，包括性別、年齡、基礎(chǔ)疾病、起病癥狀、危重癥評(píng)分等。

1.2.2 標(biāo)本獲取和送檢

患者轉(zhuǎn)入ICU后，由臨床醫(yī)生決定采集下呼吸道病原學(xué)的指征和時(shí)機(jī)，由有經(jīng)驗(yàn)的呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科醫(yī)師使用Ambu Scope床旁支氣管鏡系統(tǒng)對(duì)患者進(jìn)行支氣管鏡檢查，選取影像有提示或有膿性分泌物的部位進(jìn)行灌洗，獲取支氣管肺泡灌洗液后立即送檢。2020年3月之前因臨床微生物實(shí)驗(yàn)室無(wú)法使用，僅采用Biofire Filmarray PN(梅里埃診斷中國(guó)公司免費(fèi)捐贈(zèng))進(jìn)行檢測(cè)，之后同一份標(biāo)本同時(shí)送檢Biofire Filmarray PN及微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行普通培養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)學(xué)處理

采用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)描述和整理，氧合指數(shù)、采集標(biāo)本距轉(zhuǎn)入ICU時(shí)間等計(jì)量資料符合正態(tài)性分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；年齡為偏態(tài)分布計(jì)量資料，以中位數(shù)(四分位數(shù))表示；性別、合并疾病、臨床癥狀所占比率等計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(百分率)表示。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

共21例符合納入標(biāo)準(zhǔn)的危重癥COVID-19患者入選本研究。其中，男性12例(57.1%)，女性9例(42.9%)；中位年齡66(53,80)歲；合并高血壓10例(47.6%)，糖尿病5例(23.8%)，腦血管病4例(19.1%)，冠心病3例(14.3%)，慢性呼吸系統(tǒng)疾病2例(9.5%)；起病癥狀分別為發(fā)熱18例(85.7%)，呼吸困難15例(71.4%)，咳嗽14例(66.7%)，乏力11例(52.4%)，咳痰10例(47.6%)，肌痛6例(28.6%)；入ICU時(shí)急性生理學(xué)和慢性健康狀況評(píng)分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)評(píng)分為(14.1±4.4)分，序貫器官衰竭評(píng)分(sequential organ failure assessment,SOFA)為(5.9±2.2)分，氧合指數(shù)為(129.2±79.8) mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)。

21例患者均行氣管插管及機(jī)械通氣，均接受廣譜抗生素治療。共送檢下呼吸道標(biāo)本54份，均為肺泡灌洗液，包括Biofire Filmarray PN 檢測(cè)33份(61.1%)，普通培養(yǎng)21份(38.9%)，其中19對(duì)(38份)為“背靠背”送檢Biofire Filmarray PN和普通培養(yǎng)。獲取各標(biāo)本的時(shí)間距起病時(shí)間為(44.9±15.5)d，距插管時(shí)間為(20.6±11.7)d，距轉(zhuǎn)入ICU時(shí)間為(16.4±11.1)d。

2.2 下呼吸道標(biāo)本培養(yǎng)回報(bào)結(jié)果

Biofire Filmarray PN組結(jié)果回報(bào)時(shí)間約為1 h，21例患者中共20例32份回報(bào)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為97.0%(32/33)。其中30份回報(bào)病原體大于1種，回報(bào)病原體共計(jì)74例次，包括鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體29例次(39.2%)，銅綠假單胞菌21例次(28.4%)，肺炎克雷伯菌16例次(21.6%)，大腸桿菌5例次(6.8%)，陰溝腸桿菌、流感嗜血桿菌及呼吸道合胞病毒各1例次(1.4%)。半定量分析顯示，細(xì)菌性病原體≥107拷貝數(shù)/mL 28例次(38.4%)，106拷貝數(shù)/mL 18例次(24.7%)，105拷貝數(shù)/mL 14例次(19.2%)，104拷貝數(shù)/mL 13例次(17.8%)。耐藥基因共56例次，其中 CTX-M 24例次(42.9%)、KPC 19例次(33.9%)、NDM 10例次(17.9%)、IMP 2例次(3.6%)、VIM 1例次(1.8%)(表2)。

表2 Biofire Filmarray PN組下呼吸道標(biāo)本病原體回報(bào)結(jié)果半定量分析(n)

共14例患者21份標(biāo)本送檢普通培養(yǎng)，該組結(jié)果回報(bào)時(shí)間約為3 d，其中11例患者16份標(biāo)本回報(bào)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為76.2%(16/21)。其中3份回報(bào)病原體大于1種，檢出病原體19例次，包括銅綠假單胞菌8例次(42.1%)，鮑曼不動(dòng)桿菌6例次(31.6%)，嗜麥芽窄食單胞菌4例次(21.1%)，粘金黃桿菌1例次(5.3%)。半定量分析顯示，“+++ ”10例次，“++”8例次，“+”1例次(表3)。

表3 普通培養(yǎng)組下呼吸道標(biāo)本病原體回報(bào)結(jié)果半定量分析(n)

2.3 Biofire Filmarray下呼吸道試劑盒組和普通培養(yǎng)組結(jié)果一致性分析

因Biofire Filmarray PN組每份標(biāo)本陽(yáng)性結(jié)果多大于1種，故僅列出拷貝數(shù)最高的病原體及其拷貝數(shù)；普通培養(yǎng)組則列出鑒定的最高菌量的菌株和菌量(表4)。兩組對(duì)比發(fā)現(xiàn)，19對(duì)(38份)“背靠背”送檢標(biāo)本中，Biofire Filmarray PN組和普通培養(yǎng)組結(jié)果吻合者為15對(duì)，一致率為78.9%(15/19)。在不一致的4對(duì)標(biāo)本中，3例普通培養(yǎng)結(jié)果為陰性，Biofire Filmarray PN檢測(cè)為陽(yáng)性，另1例普通培養(yǎng)為嗜麥芽窄食單胞菌，該菌不在Biofire Filmarray PN的檢測(cè)靶標(biāo)內(nèi)(檢出大腸桿菌)。此外，普通培養(yǎng)組未分離到肺炎克雷伯菌，Biofire Filmarray PN組則回報(bào)16例肺炎克雷伯菌陽(yáng)性，但拷貝數(shù)均相對(duì)較低。另Biofire Filmarray PN組檢出大腸桿菌、陰溝腸桿菌、流感嗜血桿菌及呼吸道合胞病毒各1例。

表4 Biofire Filmarray PN組和普通培養(yǎng)組結(jié)果一致性評(píng)價(jià)

3 討論

本研究中，21例危重癥COVID-19患者共送檢下呼吸道標(biāo)本54份，包括Biofire Filmarray PN組檢測(cè)33份(61.1%)、普通培養(yǎng)組21份(38.9%)，其中19對(duì)(38份)為“背靠背”送檢。兩種方法均有較多陽(yáng)性結(jié)果回報(bào)。19對(duì)“背靠背”送檢標(biāo)本中，Biofire Filmarray PN組和普通培養(yǎng)組結(jié)果的一致率為78.9%(15/19)。

既往研究顯示，流感所致危重癥患者可繼發(fā)其他病原體感染，繼發(fā)感染亦是ICU流感患者死亡的重要原因[7-8]。COVID-19疫情暴發(fā)以來(lái)，轉(zhuǎn)入ICU的患者中，13.5%～44%存在明確的繼發(fā)感染[9]。其最常見(jiàn)的感染類型是細(xì)菌和真菌性肺炎，分離出的病原體包括泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯桿菌、產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBL)的銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌以及煙曲霉、黃曲霉、白色念珠菌和光滑念珠菌等真菌性病原體[10]。由于普通培養(yǎng)靈敏度低、耗時(shí)長(zhǎng)，不能滿足臨床的需求。

Biofire Filmarray PN是一種基于分子技術(shù)的病原診斷新技術(shù)，該試劑盒已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于輔助診斷下呼吸道感染，具有耗時(shí)短、檢測(cè)速度快的優(yōu)勢(shì)。Gadsby等[11]研究表明，病原學(xué)診斷的快慢可影響下呼吸道感染患者的治療決策，特別是在危重癥患者中，早期病原學(xué)診斷可能有助于改善患者的預(yù)后。本研究首次在中國(guó)危重癥COVID-19患者的病原學(xué)檢測(cè)中使用Biofire Filmarray PN。結(jié)果顯示，Biofire Filmarray PN組結(jié)果回報(bào)時(shí)間約為1 h，而普通培養(yǎng)組結(jié)果回報(bào)時(shí)間則約為3 d，提示Biofire Filmarray PN在檢測(cè)時(shí)效性方面具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

本研究Biofire Filmarray PN組送檢的21例患者中，20例(95.3%)回報(bào)陽(yáng)性，普通培養(yǎng)組14例患者中，11例(78.6%)回報(bào)陽(yáng)性，提示危重癥COVID-19患者合并繼發(fā)感染較常見(jiàn)。在檢出病原體類別方面，Biofire Filmarray PN和普通培養(yǎng)均證實(shí)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌是轉(zhuǎn)入ICU的危重癥COVID-19患者最常合并的下呼吸道病原體；此外，Biofire Filmarray PN亦檢出了較高比率的肺炎克雷伯菌和大腸桿菌，這與既往文獻(xiàn)[10]報(bào)道相符。在檢出耐藥基因方面，主要為ESBL相關(guān)的耐藥基因(CTX-M)以及耐碳青霉烯腸桿菌相關(guān)耐藥基因(KPC和NDM)，提示耐藥菌株的存在是ICU值得持續(xù)關(guān)注的問(wèn)題。

在Biofire Filmarray PN與普通培養(yǎng)結(jié)果一致性方面，Buchan等[6]比較了259例成年患者的肺泡灌洗液標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果，Biofire Filmarray PN與普通培養(yǎng)法針對(duì)15種靶標(biāo)病原體回報(bào)結(jié)果的陽(yáng)性一致率(positive percent agreement)為96.2%，陰性一致率(negative percent agreement)為98.1%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)70.7%的患者有基于Biofire Filmarray PN檢測(cè)結(jié)果調(diào)整抗生素的潛力，48.2%的患者可據(jù)此停用或降級(jí)抗生素，抗生素使用日平均可減少6.2 d。另一項(xiàng)研究評(píng)價(jià)了51例轉(zhuǎn)入ICU患者的59份呼吸道吸取物或肺泡灌洗液標(biāo)本回報(bào)結(jié)果，Biofire Filmarray PN檢出的最常見(jiàn)細(xì)菌性病原體為鮑曼不動(dòng)桿菌(10.2%)、肺炎克雷伯菌(16.9%)、銅綠假單胞菌(11.9%)，另有27.1%標(biāo)本檢出了病毒；與普通培養(yǎng)結(jié)果的陽(yáng)性一致率為90%，陰性一致率為97.4%[12]。本研究結(jié)果顯示，Biofire Filmarray PN和普通培養(yǎng)結(jié)果的一致率為78.9%。不一致的4對(duì)標(biāo)本中，3例普通培養(yǎng)為陰性，Biofire Filmarray PN檢測(cè)為陽(yáng)性，另1例普通培養(yǎng)為嗜麥芽窄食單胞菌，該菌不在Biofire Filmarray PN的靶標(biāo)內(nèi)。另Biofire Filmarray PN檢出大腸桿菌、陰溝腸桿菌、流感嗜血桿菌及呼吸道合胞病毒各1例。本研究結(jié)果提示Biofire Filmarray PN可能是檢測(cè)危重癥COVID-19患者繼發(fā)感染病原體的理想方法。Biofire Filmarray PN和普通培養(yǎng)結(jié)果的一致率低于既往報(bào)道的結(jié)果，可能與樣本量較小，普通培養(yǎng)靈敏度低等有關(guān)。

由于定性檢測(cè)的限制，Biofire Filmarray PN無(wú)法明確KPC等耐藥基因，而普通培養(yǎng)則可用抗生素敏感實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)耐藥菌的存在。由于方法不同，目前二者無(wú)法進(jìn)行直接比較。本研究分離到的病原體多數(shù)為多重耐藥菌，即使未分離到耐藥菌或相應(yīng)耐藥表型，若Biofire Filmarray PN提示耐藥基因存在，仍需警惕抗生素對(duì)耐藥菌的被動(dòng)篩選，最終導(dǎo)致耐碳青霉烯類腸桿菌等耐藥病原體的感染。因此，Biofire Filmarray PN的耐藥基因檢測(cè)一方面可起到警示作用，提醒臨床醫(yī)生盡可能避免或減少不必要的廣譜抗生素使用；另一方面，耐藥基因的存在與耐藥菌株高度相關(guān)，耐藥菌株的流行可能導(dǎo)致院內(nèi)感染高發(fā)，對(duì)耐藥基因的快速檢測(cè)有助于監(jiān)測(cè)院內(nèi)感染，加快和促進(jìn)院感防控措施的實(shí)施。

本研究局限性：第一，樣本量較小，采用兩種方法“背靠背”檢測(cè)的標(biāo)本僅19對(duì)，一方面無(wú)法進(jìn)行針對(duì)特定病原體的比較，另一方面在一致性評(píng)價(jià)時(shí)，僅可粗略對(duì)比Biofire Filmarray PN組最高拷貝數(shù)的病原體與普通培養(yǎng)組的結(jié)果。第二，Biofire Filmarray PN靶標(biāo)僅覆蓋臨床常見(jiàn)的下呼吸道病原體，不含真菌性病原體，可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果無(wú)法全面反映危重癥患者繼發(fā)感染的病原體類型。第三，僅針對(duì)病原體回報(bào)情況進(jìn)行比較，未評(píng)估檢測(cè)結(jié)果對(duì)抗生素藥物方案調(diào)整及患者預(yù)后的影響。COVID-19疫情期間廣譜抗生素的廣泛使用和CT等影像學(xué)評(píng)估手段的缺乏使得病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果的解讀和使用存在明顯限制。有待后續(xù)開(kāi)展更多診斷學(xué)研究，進(jìn)一步證實(shí)Biofire Filmarray PN檢測(cè)的準(zhǔn)確性、有效性，并評(píng)價(jià)其在患者臨床結(jié)局改善中的作用。

綜上，危重癥COVID-19患者繼發(fā)感染較常見(jiàn)，病原體可能以鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體、銅綠假單胞菌多見(jiàn)。Biofire Filmarray PN可用于此類患者的下呼吸道病原學(xué)診斷，有助于臨床策略的選擇，但其靈敏度和準(zhǔn)確度仍需大樣本研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)：范俊平、肖盟負(fù)責(zé)撰寫(xiě)并修改論文；徐英春、王京嵐負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)，修改論文；陳雨、張棟負(fù)責(zé)Biofire Filmarray PN的檢測(cè)和數(shù)據(jù)整理；趙靜、楊燕麗、孫雪峰、夏鵬參與標(biāo)本采集、送檢和臨床信息整理；趙穎、柯帆航參與倫理申請(qǐng)和部分文稿撰寫(xiě)。

志謝：感謝生物梅里埃公司的無(wú)私捐贈(zèng)，感謝王皓峰先生等對(duì)本研究的支持和貢獻(xiàn)。

利益沖突：無(wú)