雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證hsa-miR-1291對(duì)ARHGAP29基因的調(diào)控作用

徐 倩 汪 沙 劉麒薇 呂承曉 甘 露 柳 鑫

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心，北京 100006)

微小RNA (microRNA, miR)是重要的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA分子，通過(guò)對(duì)其相應(yīng)靶基因的負(fù)性調(diào)節(jié)，下調(diào)靶基因的表達(dá)，從而影響靶基因相關(guān)的各種生物學(xué)調(diào)控機(jī)制[1-2]。Rho家族小GTP酶(RhoGTP酶)是細(xì)胞表面受體同肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的信號(hào)橋梁，而Rho GTP酶活化蛋白29 (Rho GTPase activating protein 29，ArhGAP29)可以調(diào)節(jié)RhoGTP酶活性，影響細(xì)胞黏附、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)黏附以及肌動(dòng)蛋白重排[3-5]。研究[5]顯示，hsa-miR-1291在宮腔粘連內(nèi)膜組織中出現(xiàn)異常上調(diào)，通過(guò)構(gòu)建差異microRNA與負(fù)相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模式圖，預(yù)測(cè)ARHGAP29為其潛在靶基因。ARHGAP29基因定位于人類染色體1p22.1，基因轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為8 952 bp，編碼蛋白大小為1 261個(gè)氨基酸。本研究擬采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，進(jìn)一步驗(yàn)證hsa-miR-1291能否對(duì)預(yù)測(cè)靶基因ARHGAP29產(chǎn)生靶向調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

ARHGAP29目的基因序列及突變序列由廣州市銳博生物科技有限公司合成，293T細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，蛋白胨、酵母提取物(英國(guó)OXOID公司)，限制性內(nèi)切酶(XhoI, NotI)、連接反應(yīng)液、DNA聚合酶(美國(guó)Thermo公司)，質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生化科技有限公司)，2×Kofu Mix(廣州市銳博生物科技有限公司)，氨芐西林(美國(guó)Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基、胰酶(美國(guó)GIBCO公司)，Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑(碧云天公司)，pmiR-RB-ReportTMh-ARHGAP29(NM_004815.43′UTR: 61-945)-WT(h-ARHGAP29-WT)、pmiR-RB-ReportTMh-ARHGAP29(NM_004815.43′UTR: 61-945)-MUT(81-87: CAGGGCC>GTCCCGG)(h-ARHGAP29-MUT)、micrON?hsa-miR-1291mimic and micrON?miRNA mimic NC(廣州市銳博生物科技有限公司)、Dual-Glo?熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Promega公司)、LUMITRACTM200 96孔白色細(xì)胞培養(yǎng)板、GLOMAX 96 分光光度計(jì)(美國(guó)Promega公司)，PCR儀(美國(guó)Bio-RAD公司)，離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司)，恒溫振蕩器(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，生物潔凈工作臺(tái)(蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物學(xué)位點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用生物學(xué)靶基因預(yù)測(cè)軟件Targetscan(www. targetscan.org)對(duì) hsa-miR-1291與預(yù)測(cè)靶基因ARHGAP29的3′非編碼區(qū)(3′ untranslated region，3′UTR)位點(diǎn)進(jìn)行分析，得到分析結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.2 雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建

序列合成：分別化學(xué)合成ARHGAP29基因野生型序列及突變型序列，并在序列兩端添加X(jué)hoI、NotI酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增及純化：合成序列克隆至pmiR-RB-ReportTM載體骨架中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳分析,引物序列見(jiàn)表1。純化PCR產(chǎn)物。酶切：用XhoI、NotI對(duì)純化產(chǎn)物和載體進(jìn)行雙酶切，回收純化酶切產(chǎn)物。連接：連接目的片段與pmiR-RB-ReportTM載體骨架。轉(zhuǎn)化：取連接產(chǎn)物加到100 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，取出后立即置于冰浴中放置2～3 min，向其中加入900 μL 37 ℃預(yù)熱的LB(不含抗生素)培養(yǎng)基，150 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)45 min。吸走上清液，100 μL 混勻菌液，加到含Amp抗生素LB固體瓊脂培養(yǎng)基上(抗生素濃度100 μg/mL)，將平板倒置，37 ℃培養(yǎng)12～16 h。 菌落鑒定及測(cè)序：挑取上述平板上的單菌落，溶到3 μL水中，取0.5 μL做模板，進(jìn)行PCR。提取質(zhì)粒，陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

表1 雙熒光素酶報(bào)告基因載體引物序列Tab.1 Primer sequence of the Dual Luciferase Reporter

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

接種：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔1.5×104個(gè)細(xì)胞，每孔總體積100 μL，于37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。 混合：采用OPTI-MEM培養(yǎng)基分別稀釋hsa-miR-1291 mimic及NC、野生型載體ARHGAP29-WT 3′UTR pmiR-RB-Report及突變型載體ARHGAP29-MUT 3′UTR pmiR-RB-Report、LipofectamineTM2000試劑，靜置20 min。轉(zhuǎn)染：取50 μL混合液分別共轉(zhuǎn)染于含50 μL培養(yǎng)基的293T細(xì)胞中，共分為4組：h-ARHGAP29-WT+hsa-miR-1291組、h-ARHGAP29-WT+NC組、h-ARHGAP29-MUT+hsa-miR-1291組、h-ARHGAP29-MUT+陰性對(duì)照(non-target control,NC)組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔(n=3)，最終每孔總體積100 μL。6 h后再加100 μL新鮮培養(yǎng)基。

1.2.4 熒光素酶活性測(cè)定

轉(zhuǎn)染48 h后吸出培養(yǎng)基， 以35 μL/孔加入1× PBS，每孔加入35 μL Luciferase底物與Luciferase buffer混合液，振蕩10 min，轉(zhuǎn)移至LUMITRACTM200 96孔白色細(xì)胞培養(yǎng)板中，分光光度計(jì)測(cè)定熒光值。加入30 μL中止液，振蕩10 min，分光光度計(jì)測(cè)定熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 載體骨架的構(gòu)建

選擇海腎熒光素酶基因(hRluc)為報(bào)告熒光，螢火蟲(chóng)熒光素酶基因(hluc)為校正熒光，構(gòu)建3′UTR雙熒光素酶載體骨架，骨架大小為6.3 kb，詳見(jiàn)圖1。

圖1 雙熒光素酶載體骨架(pmiR-RB-ReportTM)Fig.1 Vector frame of dual luciferase reporter system (pmiR-RB-ReportTM)hRluc:renilla luciferase; hluc: firefly luciferase.

2.2 測(cè)序分析

對(duì)含有has-miR-1291基因結(jié)合位點(diǎn)的野生型序列及缺失has-miR-1291基因結(jié)合位點(diǎn)的突變型序列進(jìn)行克隆測(cè)序，h-ARHGAP29(NM_004815.4 3′UTR: 61-945)-WT野生型包含：(81-87) CAGGGCC；h-ARHGAP29(NM_004815.4 3′UTR: 61-945)-MUT(81-87 CAGGGCC>GTCCCGG)，野生型載體及突變型載體均構(gòu)建成功，可用于后續(xù)靶點(diǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(圖2、3)。

圖2 熒光素酶報(bào)告載體 h-ARHGAP29-WT測(cè)序圖Fig.2 Sequence diagram of luciferase reporter vector h-ARHGAP29-WT

圖3 熒光素酶報(bào)告載體h-ARHGAP29-MUT測(cè)序圖(突變靶點(diǎn)序列81-87 CAGGGCC-GTCCCGG)Fig.3 Sequence diagram of luciferase reporter vector h-ARHGAP29-MUT (mutant target sequence 81-87 CAGGGCC-GTCCCGG)

2.3 熒光素酶活性分析

將hsa-miR-1291 mimic及NC分別同野生型載體共轉(zhuǎn)染至工具細(xì)胞293T細(xì)胞，即h-ARHGAP29-WT+hsa-miR-1291組、h-ARHGAP29-WT+NC組，檢測(cè)其相對(duì)熒光值分別為0.67±0.04及1.00±0.08。將hsa-miR-1291 mimic及NC分別同突變型載體共轉(zhuǎn)染至工具細(xì)胞293T細(xì)胞，即h-ARHGAP29-MUT+hsa-miR-1291組、h-ARHGAP29-MUT+NC組，檢測(cè)其相對(duì)熒光值為1.20±0.05及1.00±0.10。對(duì)各組熒光素酶檢測(cè)結(jié)果分析顯示，野生型載體轉(zhuǎn)染hsa-miR-1291 mimic后，其熒光表達(dá)較NC組明顯下降(0.67±0.04vs1.00±0.08，P=0.014)；轉(zhuǎn)染hsa-miR-1291 mimic后，突變型載體的熒光表達(dá)相對(duì)于野生型載體的熒光表達(dá)有所上升(1.20±0.05vs0.67±0.04,P<0.001),詳見(jiàn)圖4。

圖4 相對(duì)熒光值表達(dá)(n=3)Fig.4 Relative fluorescence expression of different vector groups(n=3)*P<0.05 vs h-ARHGAP29-WT+NC group， ***P<0.001 vs h-ARHGAP29-WT+ hsa-miR-1291 group. NC:non-target control.

3 討論

MicroRNA是長(zhǎng)度為20～22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，能夠通過(guò)互補(bǔ)序列和3′ UTR之間的核苷酸堿基配對(duì)在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達(dá)[1]。本研究組前期使用基因芯片技術(shù)，對(duì)宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜和非宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜組織中hsa-miR的差異表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在宮腔粘連患者的子宮內(nèi)膜中hsa-miR-1291水平顯著升高[6]。研究[7-8]顯示， miR-1291可具有多種功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞藥物反應(yīng)及化學(xué)敏感性，以及通過(guò)特定靶基因來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增生和代謝。

通過(guò)GO分析、miRDB數(shù)據(jù)庫(kù)及Targetscan軟件，筆者預(yù)測(cè)ARHGAP29為hsa-miR-1291的負(fù)性調(diào)節(jié)靶基因。ArhGAP29是抑制Rho信號(hào)傳導(dǎo)途徑的特定類型RhoGTP酶活化蛋白，具有RhoA的GAP結(jié)構(gòu)域，同RhoA具有很強(qiáng)的親和力，是RhoA的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可使RhoA由三磷酸鳥(niǎo)苷(guanosine triphosphate，GTP)限制型轉(zhuǎn)變?yōu)槎姿狲B(niǎo)苷(guanosine diphosphate，GDP)限制型而失活，進(jìn)一步影響下游效應(yīng)分子，其對(duì)細(xì)胞骨架及細(xì)胞遷移、侵襲的影響已在多種疾病細(xì)胞系中得以證實(shí)[9-10]。

RhoA是小G蛋白超家族中的一個(gè)成員，具有GTP酶活性，是細(xì)胞表面受體同胞內(nèi)多種信號(hào)蛋白的中介，參與多種信號(hào)通路調(diào)控，其中，Rho相關(guān)蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing protein kinases，RhoA/ROCK)信號(hào)通路涉及多種纖維化疾病的調(diào)控，在肺、腎、心血管和肝臟纖維病變中被廣泛研究[11-13]。目前研究[14]顯示，宮腔粘連的重要病變機(jī)制為子宮內(nèi)膜纖維化改變，筆者推測(cè)，ArhGAP29的降低可能導(dǎo)致RhoA被激活，影響下游效應(yīng)分子ROCK，調(diào)節(jié)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，進(jìn)而影響細(xì)胞分裂及細(xì)胞周期，改變上皮細(xì)胞極性的穩(wěn)定性，參與子宮內(nèi)膜纖維化過(guò)程的調(diào)控。ArhGAP29可以通過(guò)同相關(guān)蛋白結(jié)合，蛋白移位以及多聚體的形成等方式，抑制Rho信號(hào)通路，促進(jìn)應(yīng)力纖維形成，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)[15-16]，這可能是ArhGAP29 在纖維化過(guò)程中發(fā)揮作用的機(jī)制之一。ArhGAP29作為分子開(kāi)關(guān)在胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控中發(fā)揮重要橋梁作用，因此有可能成為子宮內(nèi)膜纖維化的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)之一。

宮腔粘連內(nèi)膜病變中hsa-miR-1291及其預(yù)測(cè)靶基因ARHGAP29的發(fā)現(xiàn)，為闡明宮腔粘連子宮內(nèi)膜纖維化打開(kāi)了新的視角。本研究確定了hsa-miR-1291同ARHGAP29基因的靶向調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步研究其在子宮內(nèi)膜纖維化病變機(jī)制中的作用奠定了基礎(chǔ)。MiR-1291是否有可能成為宮腔粘連的分子標(biāo)志物，其靶基因ARHGAP29能否成為宮腔粘連的治療靶點(diǎn)，通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)及改變細(xì)胞遷移能力，逆轉(zhuǎn)和阻斷子宮內(nèi)膜纖維化病變的發(fā)展，值得進(jìn)一步深入研究。