新疆地區(qū)煙粉虱類群mtDNA COI基因序列分析

段曉東，馬麗娟，姚正培，曹 騫，冷春麗，馬德英，新疆農業(yè)大學農學院，新疆烏魯木齊8005;烏魯木齊市農業(yè)技術推廣中心，新疆烏魯木齊800;教育部棉花工程研究中心，新疆烏魯木齊8005

煙粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是一種嚴重危害農業(yè)生產的世界性害蟲，廣泛分布于除南極洲外的90多個國家和地區(qū)(Brown et al.，1995)。由于寄主范圍、寄主植物適應性和傳毒能力等方面的不同，煙粉虱被認為是一個由11個定義明確的高級群組成的復合體，至少包含24個形態(tài)學上難以分辨的種(De Barro et al.，2011)，主要有B 型、Q 型和非 B/Q 型(包括 A、K、D、E、G、H、L、M、N 等多種生物型)。其中，B型煙粉虱幾乎在全世界均有分布，其他生物型多為區(qū)域性分布。Q型煙粉虱最初記載于西班牙，現(xiàn)在已經分布于許多國家和地區(qū)，如意大利、以色列、摩洛哥、日本、美國、墨西哥、中國等(Palumbo et al.，2001;Horowitz et al.，2003;Muniz，2000;Ueda ＆ Brown，2006;褚棟等，2005)。由于Q型煙粉虱比B型表現(xiàn)出更強的抗藥性，更大的產卵量、化蛹率和成蟲羽化率以及更強的耐極限溫度等生存能力，在部分地區(qū)逐漸取代了B型種群，成為當?shù)氐膬?yōu)勢種群(Hu et al.，2011;Chu et al.，2010)。目前，Q型煙粉虱已經受到越來越多的關注。

我國于2003年首次在云南昆明發(fā)現(xiàn)了Q型煙粉虱(褚棟等，2005)，其后又在北京、河南、山東、遼寧、湖北等地發(fā)現(xiàn)(饒瓊等，2009)。有關新疆煙粉虱的發(fā)生狀況也有一些報道，但均為B型(羅晨等，2002;Ma et al.，2007;Teng et al.，2010)。鑒于近年來Q型煙粉虱在我國的快速擴散，本研究采用mtDNA COI基因作為分子標記，再對新疆地區(qū)煙粉虱的生物型進行鑒定，以期為有關部門對其開展監(jiān)測和防治工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從新疆煙粉虱發(fā)生的地理區(qū)域采集樣品。挑選煙粉虱雌蟲，－20℃下保存，作為分析蟲樣。煙粉虱的采集時間、地點和寄主見表1。

表1 被測試煙粉虱種群的信息Table 1 Information on the origin of the tested B.tabaci populations from Xinjiang，NW China，2008 ～2010

1.2 基因組DNA的提取方法及檢測

基因組DNA的提取采用氯仿/異戊醇抽提法(周志湘等，2007)。將單頭雌性煙粉虱樣本置于1.5 mL離心管中，用液氮破碎研磨，滴加150 μL提取緩沖液(pH 8.0，50 mmol·L－1Tris-HCl、20 mmol·L－1NaCl、1 mmol·L－1EDTA、1%SDS)勻漿;滴加 5 μL 蛋白酶K(20 mg·mL－1)，混勻;60 ℃水浴1 h(中途混勻1～2次);100℃沸水浴5 min。DNA勻漿液中加入200 μL氯仿/異戊醇(24∶1)抽提2次，每次輕柔混勻數(shù)十次，冰上放置 10 min，10000 r·min－1離心 10 min，取上清液;加入2倍體積預冷無水乙醇，輕輕混勻，于 －20 ℃放置30 min，然后12000 r·min－1離心15 min，棄上清液;加入2倍體積預冷的75%乙醇，12000 r·min－1離心15 min，棄上清液。將EP管倒扣于干凈濾紙上，自然干燥30 min，每管加入30 μL超純水，充分溶解后于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增及電泳

反應程序參考Simon et al.(1994)，引物分別為C1-J-2195(5'-ttg att ttt tgg tca tcc aga agt-3')和L2-N-3014(5'-tcc aat gca cta atc tgc cat att a-3')。在1.6%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色后，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察，記錄結果。

1.4 序列的測定與比較

使用EZNA Gel Extraction Spinportocal D2500-01(OMEGA)膠回收試劑盒進行PCR產物回收純化，純化后的樣品送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。每個地理種群至少測3個煙粉虱個體。登錄NCBI網站，查閱并下載相關的煙粉虱mtDNA COI基因片段序列(表2)，通過DNAstar分析軟件，對測序結果及相關引用序列進行比對分析。利用軟件中的MegAlign-ClustalV模型計算出煙粉虱不同地理種群的進化分歧矩陣，并構建系統(tǒng)進化樹，以此分析煙粉虱種群間的遺傳關系，對新疆煙粉虱種群生物型進行鑒定，并推斷其可能來源地。

2 結果與分析

2.1 新疆煙粉虱生物型及不同生物型mtDNA COI的序列差異

所有樣品均得到約840 bp的序列，經測序并提交到GenBank，獲取基因序列編碼。從每個種群所測序列中截取與China Beijing-B相應的720 bp片段序列進行分析。結果表明，同一地區(qū)不同寄主植物上采集到的煙粉虱個體的COI基因序列存在明顯差異;同一地區(qū)同一寄主植物上采集到的煙粉虱種群的COI基因序列也存在明顯差異(表3、圖1)。

表2 引用mtDNA COI基因片段在GenBank中的登錄號Table 2 The code for reference mtDNA COI sequences and the respective GenBank accession numbers

表3 被測試煙粉虱種群的生物型Table 3 Biotype of tested B.tabaci populations

由烏魯木齊市花卉市場采集到的HH-1與吐魯番市溫室不同寄主上采集到的LJ、XHS、QZ煙粉虱個體的COI基因序列完全一樣。序列中各個堿基的含量分別為 178A、142G、308T、92C，A+T 的含量為67.5%。它們與 Morocco Casablanca-Q、France Gironde-Q、USA California-Q、China Jiangsu-Q、China Wuhan-Q等5個已知Q型煙粉虱個體COI基因序列相應的720 bp片段完全一樣;與China Yangzhou-Q、China Jingzhou-Q等2個已知Q型煙粉虱個體COI基因序列相比，具有1個堿基的區(qū)別，為第57位點上的G→C;與Morocco Nador-Q相比，有2個堿基的區(qū)別，為第266位點上的T→C和第294位點上的A→G;與Sudan-Q相比，有12個堿基的區(qū)別，分別為第15位點上的T→A、第74位點上的T→G、第75位點上的G→A、第76位點上的A→C、第87位點上的C→T等;與China Beijing-B、China Guangdong-B、China Hubei-B、USA Florida-B等4個已知B型煙粉虱個體COI基因序列相比，有37個堿基的區(qū)別。

由吐魯番市煙草上采集的YC與China Yangzhou-Q、China Jingzhou-Q等2個已知Q型煙粉虱個體COI基因序列相比，具有2個堿基的區(qū)別，為第3位點上的T→G和第7位點上的C→T;與Morocco Casablanca-Q、France Gironde-Q、USA California-Q、China Jiangsu-Q、China Wuhan-Q等5個已知Q型煙粉虱個體COI基因序列相比，具有3個堿基的區(qū)別，分別為第3位點上的T→G、第7位點上的C→T、第57位點上的G→C;與Morocco Nador-Q相比，有5個堿基的區(qū)別，分別為第3位點上的T→G、第7位點上的C→T、第57位點上的G→C、第266位點上的T→C、第294位點上的 A→G;與Sudan-Q相比，有15個堿基的區(qū)別，分別為第3位點上的T→G、第7位點上的C→T、第15位點上的T→A、第57位點上的G→C、第74位點上的T→G等。

由烏魯木齊市不同寄主上采集到的JK-S、HH-2、ZH-O與吐魯番市不同寄主上采集到的TC1、TC2、TC3煙粉虱個體COI基因序列完全一樣。序列中各個堿基的含量分別為182A、139G、310T、89C，A+T 的含量為 68.3%。它們與 China Beijing-B、China Guangdong-B、China Hubei-B、USA Florida-B 等 B 型煙粉虱序列相應的720 bp片段完全一樣。

2.2 煙粉虱不同生物型mtDNA COI的遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用DNAstar軟件中的MegAlign-ClustalV模型計算出煙粉虱不同地理種群的進化分歧矩陣，并構建系統(tǒng)進化樹(圖2～3)。結果發(fā)現(xiàn)，煙粉虱和白粉虱Trialeurodes vaporariorum首先分開，同源性接近于70.0%;其后B型煙粉虱和Q型煙粉虱分開，形成2個分支，同源性為93.8% ～94.9%。在Q型分支中，被測樣本 HH-1、LJ、XHS、QZ 與 Morocco Casablanca-Q、France Gironde-Q、USA California-Q、China Jiangsu-Q、China Wuhan-Q、Morocco Nador-Q等6個已知Q型煙粉虱種群聚為一類，同源性為99.7% ～100%;被測樣本YC與China Yangzhou-Q、China Jingzhou-Q等2個已知Q型煙粉虱種群聚為一類，同源性為99.7%;非洲Sudan-Q煙粉虱種群獨自為一類，與其他Q型煙粉虱種群的同源性為97.8% ～98.2%。在B型分支中，被測樣本 JK-S、HH-2、ZH-O、TC1、TC2、TC3 與China Beijing-B、China Guangdong-B、China Hubei-B、USA Florida-B等4個已知B型煙粉虱種群聚為一類，同源性為100%，屬于同一個進化分支。

圖2 煙粉虱種群的系統(tǒng)聚類樹Fig.2 The relatinoship of the B.tabaci groups from Xinjiang，NW China and references，based on the mt COI gene sequences

圖3 煙粉虱種群mtDNA COI基因720 bp片段序列的同源性比較Fig.3 Percent identity of 720 the characters examined for COI sequences of B.tabaci collections and reference sequences

3 討論

本研究結果表明，在吐魯番市的溫室蔬菜、烏魯木齊市花卉市場內發(fā)現(xiàn)了Q型煙粉虱，并且在寄主一品紅不同樣本群檢測出了B和Q等2種生物型，表明Q型煙粉虱已經傳入新疆。同時，根據被測煙粉虱樣品與已知Q型煙粉虱mtDNA COI基因在NCBI上進行BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，自2003年首次在我國發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱至2010年在新疆首次發(fā)現(xiàn)，其都在不斷發(fā)生著遺傳變化。由烏魯木齊市花卉市場采集到的HH-1和吐魯番市溫室不同寄主上采集到的 LJ、XHS、QZ 與 Morocco Casablanca-Q、France Gironde-Q、USA California-Q、China Jiangsu-Q、China Wuhan-Q等5個已知Q型煙粉虱的同源性為100%。然而，由吐魯番市煙草上采集的YC與以上5個已知Q型煙粉虱的同源性為99.6%;與China Yangzhou-Q、China Jingzhou-Q等2個已知Q型煙粉虱的同源性為99.7%;與Morocco Nador-Q的同源性為99.3%;與Sudan-Q的同源性為97.8%。這表明入侵新疆的Q型煙粉虱可能有不同來源。

另外，來自野生植物、花卉市場、溫室、棉田的被測樣本 JK-S、HH-2、ZH-O、TC1、TC2、TC3 與 China Beijing-B、China Guangdong-B、China Hubei-B、USA Florida-B等4個已知B型煙粉虱的同源性為100%。由此可以看出，吐魯番、烏魯木齊主要農業(yè)生產區(qū)域的煙粉虱生物型仍然為B型。B型煙粉虱在新疆依然是主要的防治對象。同時，B型煙粉虱未出現(xiàn)Q型煙粉虱所表現(xiàn)的基因分化現(xiàn)象，這可能與Q型煙粉虱種群間遺傳多樣性高于B型種群有關(Moya et al.，2001)。

Q型煙粉虱的發(fā)現(xiàn)對新疆的棉花種植業(yè)及設施農業(yè)生產提出了警示和更加嚴峻的挑戰(zhàn)，同時印證了Ma et al.(2007)的預測。因此，有關部門在關注B型煙粉虱的同時，也應對新疆Q型煙粉虱的傳播及危害引起足夠的重視，并及時采取措施防止其進一步擴散。此外，已經成功建立的針對B型煙粉虱的防治策略與技術體系都將面臨挑戰(zhàn)，因為Q型煙粉虱較B型擁有更強、更廣泛的抗性程度(Hu et al.，2011;Chu et al.，2010)。今后我們還需檢測 Q型煙粉虱的抗藥性狀況，以便針對B型和Q型煙粉虱的發(fā)生狀況和分布區(qū)域提出不同的防治策略。

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