轉基因植物環(huán)境安全評價策略

宋新元，張欣芳，于 壯，李新海，張 明吉林省農(nóng)業(yè)科學院，農(nóng)業(yè)部轉基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心，吉林長春304;中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京0008

20世紀80年代以來，轉基因技術飛速發(fā)展，因其能夠克服常規(guī)育種手段的一些局限，在農(nóng)業(yè)生物新品種培育領域備受青睞。如今，科學家已培育出一系列具有優(yōu)良性狀(如抗蟲、抗除草劑等)的轉基因作物新品種，并進行了大面積的推廣種植。這些轉基因作物，在帶來直接經(jīng)濟與生態(tài)效益的同時，也為解決未來世界糧食、能源危機提供了新的途徑。但同時，轉基因技術也存在一定的風險。近年來，轉基因生物安全問題在全世界范圍內(nèi)引起了廣泛關注，尤其關于“轉基因植物環(huán)境安全性”問題更成為爭論的焦點(Andow＆Zwahlen，2006)。我國在“轉基因植物環(huán)境安全評價方法與技術”相關領域進行了大量的研究，在轉基因作物的生存競爭能力、外源基因漂移規(guī)律及其對環(huán)境的影響、轉基因作物對非靶標生物的影響、靶標害蟲抗性演化及抗性治理策略等環(huán)境安全評價技術和程序等方面取得了較大進展。本文擬對轉基因植物環(huán)境安全評價發(fā)展歷程、趨勢、思路、內(nèi)容及評價策略進行概述，旨在為完善轉基因植物環(huán)境安全評價技術體系及轉基因生物研發(fā)和安全管理提供借鑒。

1 轉基因植物環(huán)境安全評價歷程與展望

1.1 特點

轉基因植物環(huán)境安全評價具有特異性、交融性和長期性等特點。具體表現(xiàn):(1)轉基因技術可打破物種界限，擴大基因的使用范圍，應用程度超越了作物自然進化與常規(guī)育種，因此需要特異性評價外源基因進入新的遺傳背景所引發(fā)的效應;(2)轉基因植物環(huán)境安全評價是宏觀與微觀交融的學科，涉及分子生物學、生物化學、生態(tài)學、植物保護學、生物信息學等諸多領域;(3)轉基因植物的許多生態(tài)效應需要長期監(jiān)管，轉基因植物環(huán)境安全評價應力爭在產(chǎn)業(yè)化之前，利用短期、小規(guī)模的試驗積累評價數(shù)據(jù)，以避免環(huán)境風險。

1.2 簡要發(fā)展歷程

1975年，在美國加利福尼亞州舉行的Asilomar會議，標志著人類首次開始關注轉基因技術安全性問題(Berg et al.，1975)。20世紀80年代以來，轉基因植物環(huán)境安全被高度重視，通過研討達成了一定共識:(1)存在轉基因植物環(huán)境風險;(2)環(huán)境安全評價應以個案分析(case-by-case)為基礎;(3)評價內(nèi)容應考慮目標基因來源、釋放環(huán)境、基因受體的生物學與生態(tài)學特性、釋放的規(guī)模與頻率等因素(Andow et al.，1987)。20世紀90年代提出:(1)轉基因植物環(huán)境風險的類型主要包括3個方面，即對非靶標生物和生物多樣性的影響、基因漂移及引發(fā)的效應、靶標生物抗性進化(Snow＆Mora'n-Palma，1997;Wolfenbarger ＆ Phifer，2000;Snow et al.，2005);(2)環(huán)境安全評價應采取逐層風險評價模式(tiered risk assessment);(3)轉基因植物風險評價理論與技術框架仍需要不斷完善與發(fā)展(Andow＆Zwahlen，2006)。

1.3 新的挑戰(zhàn)與展望

21世紀，轉基因技術與產(chǎn)業(yè)空前發(fā)展，新基因、新性狀、新用途的轉基因產(chǎn)品大量涌現(xiàn)。按基因與性狀，轉基因品種發(fā)展大致可分為3代。第一代為抗除草劑與農(nóng)業(yè)有害生物的轉基因植物;第二代為改良植物農(nóng)藝性狀與改善產(chǎn)品品質(zhì)的轉基因植物，如提高非生物逆境(旱、鹽、熱)耐受能力、增加油分、改善加工特性等;第三代為表達特殊用途蛋白質(zhì)的轉基因植物，如藥用蛋白、酶制劑、工業(yè)原料等(陳潔君等，2007)。同時，復合2種或多種性狀的轉基因植物也得到蓬勃發(fā)展。

現(xiàn)有的轉基因植物環(huán)境安全評價技術體系主要針對第一代轉基因植物所建立，各種新型性狀對環(huán)境安全評價工作提出了更高的要求。如今，根據(jù)外源基因作用機理、按產(chǎn)業(yè)鏈條全程安全評價的觀點已基本成為共識。今后，轉基因植物環(huán)境安全評價的趨勢:微觀上向基因型、蛋白譜和代謝物組分變化等方面發(fā)展;宏觀上向生物進化、多樣性和群落演變等方面發(fā)展。完善外源基因、載體及其表達蛋白的安全預測技術體系，優(yōu)化轉化事件篩選技術體系，新型性狀轉化體安全評價技術體系以及產(chǎn)業(yè)化轉基因作物安全監(jiān)測技術體系將是今后研究的重點內(nèi)容。

2 轉基因植物環(huán)境安全評價策略

2.1 評價步驟

科學的風險假設是轉基因植物環(huán)境安全性評價的基礎原則。轉基因植物環(huán)境安全評價大體可分為3個步驟，即潛在風險分析、風險假設驗證和風險特征描述(圖1)。

圖1 轉基因植物環(huán)境安全評價步驟Fig.1 Environmental bio-safety assessment steps of transgenic plants

潛在風險分析主要包括2個過程。(1)查閱文獻資料，對轉基因植物本身與釋放環(huán)境特點進行全面的了解與分析。應掌握的轉基因植物相關信息包括分子特征、蛋白表達、作用機理、靶標效應、作用范圍、可能產(chǎn)生的非靶標效應、已有的安全評價數(shù)據(jù)、類似作用機理的轉基因植物安全評價數(shù)據(jù)等;釋放環(huán)境的相關信息包括釋放目的、釋放規(guī)模、其中植物的種植模式、其生態(tài)學特點等。(2)確定具有科學意義的評價內(nèi)容，并設計評價試驗方案。即根據(jù)所掌握的轉基因植物與釋放環(huán)境的信息，進行科學的風險假設，確定風險評價內(nèi)容，如對非靶標重要植食性害蟲、有益生物群體、土壤生態(tài)功能、瀕臨滅絕物種的影響等;然后根據(jù)評價所需的內(nèi)容設計科學的、操作性強的、能確定危害發(fā)生可能性與危害程度的評價試驗方案。

風險假設驗證是在實驗室或田間自然條件下實施潛在風險分析中確立的試驗方案，并得到科學的試驗數(shù)據(jù)，再對試驗結果進行分析，對潛在風險分析中確定的風險假設進行驗證。如果在驗證時發(fā)現(xiàn)新的問題，應返回潛在風險分析步驟，重新進行風險分析，設計試驗，進行再驗證。

風險特征描述是對轉基因植物環(huán)境安全性進行綜合的描述。如通過潛在風險分析、風險假設驗證2個步驟后，認為以上科學分析與驗證可以全面地說明轉基因植物潛在的環(huán)境安全問題，即對安全性進行全面的描述。

2.2 逐層風險評價模式

科學合理的評價模式是進行轉基因植物環(huán)境安全評價的保障。20世紀90年代，逐層風險評價模式被眾多學者所認可，但如何構建、設計逐層風險評價的具體模式與內(nèi)容，不同學者存在不同的觀點(Strandberg et al.，1998;Kjaer et al.，1999;Poppy，2000;Schuler et al.，2001;Cowgill ＆ Atkinson，2003;Dutton et al.，2003a、b;Hill ＆ Sendashonga，2003;Romeis et al.，2006;Wolt et al.，2010;Romeis et al.，2010)?？傮w來看，逐層風險評價模式為先根據(jù)個案收集相關信息與數(shù)據(jù)，然后進行評價的可行性分析。如果認為已掌握的資料不能滿足評價的需要，則進入下一層，補充必要的信息再進行評價可行性分析;如果認為已掌握的資料可以滿足評價的需要，即進行風險評價。若在風險評價過程中，發(fā)現(xiàn)新的問題，則再進入下一層，繼續(xù)補充必要的信息后再進行評價。可見，所掌握信息量的多少和風險評價者的決策是逐層風險評價的關鍵。Andow＆Zwahlen在2006年結合以往的研究建立了逐層風險評價模型的單層結構圖(圖2)。

圖2 逐層風險評價的單層結構圖(Andow＆Zwahlen，2006)Fig.2 Framework for tiered risk assessment showing the structure of a single tier(Andow ＆ Zwahlen，2006)

2.3 評價內(nèi)容

為保障轉基因植物產(chǎn)業(yè)化，安全評價應貫穿新品種研發(fā)與推廣的全過程。根據(jù)國際慣例與我國相關政策，轉基因植物環(huán)境安全評價可分為4個環(huán)節(jié)，即應用前預測、研發(fā)中篩選、推廣前評價和推廣后監(jiān)測(圖3)。

2.3.1 應用前預測 在研發(fā)之初，應先根據(jù)生物信息學資料對目的基因、載體及外源表達蛋白的安全性進行分析。即從基因的來源(供體生物特性)、結構(包括DNA序列、推導的氨基酸序列、基因中的酶切位點等)、功能、作用方式、安全使用歷史(已有的相關安全性試驗數(shù)據(jù))等方面評價目的基因的安全性;從啟動子、終止子、標記基因、報告基因以及其他表達調(diào)控元件的來源、大小、DNA序列、功能及安全應用記錄等方面評價載體的安全性;從外源基因表達蛋白的分子特征、生化特征、功能與作用方式等方面，與已知致敏原、毒蛋白、抗營養(yǎng)因子(如蛋白酶抑制劑、植物凝集素等)的氨基酸序列進行相似性比較，系統(tǒng)分析目的基因與載體表達蛋白的安全性。值得注意的是，轉基因技術正向高效、安全的方向發(fā)展，選擇型啟動子、無標記或中性標記技術、基因限制技術等已被廣泛應用于轉基因新品種研發(fā)中。

2.3.2 研發(fā)中篩選 轉基因新品種研制的根本途徑是先獲得大群體的轉化事件，再通過淘汰獲得具有產(chǎn)業(yè)化前景的轉化體。因此，在轉化事件選優(yōu)過程中應充分考慮環(huán)境安全性，主要包括6個方面。

躺在床上，他痛苦地閉上了眼睛。大腦飛轉，思緒回到了2 0年前的大學校園，和妻子在樹叢里熱吻；妻子流著淚，對著電話和父母說著絕情的話……思緒翻轉另一個側面。父母臨終前充滿遺憾的目光，楚楚可憐的揚揚和微微隆起的肚子。接著又切換一個畫面，兩個人夾起他，那副錚亮的手銬刺得他睜不開眼。淚水不知不覺間流了滿臉，他抹了抹，又用力地甩了甩，變得剛毅起來。

圖3 轉基因植物環(huán)境安全評價流程Fig.3 The procedure of environmental bio-safety assessment for transgenic plants

(1)基因重組情況。應考核外源基因重組后的完整性、插入的拷貝數(shù)、邊界序列等。一個優(yōu)良的轉化事件，其外源基因應保持完整，插入為單拷貝，插入的位點不降低受體植物的安全性，不影響受體重要的生物功能。

(2)外源蛋白表達情況。應考核目的蛋白在轉基因植物重要生長期、重要器官中的表達水平，且載體中基因表達的蛋白應不降低受體的安全性。

(3)目標性狀有效性。根據(jù)個案采用不同方法考核目標性狀的有效性。如轉Bt基因抗蟲植物需重點考核其對靶標害蟲的殺蟲效果。

(4)遺傳穩(wěn)定性。應考核轉基因植物代際間目的基因的整合與表達情況，包括目的基因整合的穩(wěn)定性、目的基因表達的穩(wěn)定性、目標性狀表現(xiàn)的穩(wěn)定性，至少應進行3代遺傳穩(wěn)定性分析。

(5)轉基因植物主要農(nóng)藝性狀。應考核外源基因插入對植物目標性狀外的其他重要農(nóng)藝性狀產(chǎn)生的影響。農(nóng)藝性狀決定一個品種的優(yōu)劣，是篩選優(yōu)良轉化體過程中的一項重要依據(jù)。對于外源基因作用原理與農(nóng)藝性狀相關的轉基因植物，重要農(nóng)藝性狀的評價更為重要。農(nóng)藝性狀(不包含目標性狀)評價方法與常規(guī)非轉基因植物相同。以轉Bt基因抗蟲玉米為例，在鑒定抗蟲性的同時，還要考察種子的發(fā)芽率、休眠性、植株散粉期、吐絲期、株高、穗位、倒伏率、產(chǎn)量以及對非靶標蟲害、病害、逆境的抗性等重要農(nóng)藝性狀。

(6)釋放到環(huán)境中可能引發(fā)的效應。在室內(nèi)或嚴格控制的小規(guī)模自然條件下，評價轉基因植物與環(huán)境中其他生物的異交能力、對重要非靶標生物的影響、對群落多樣性的影響、目的蛋白在土壤中的降解規(guī)律、對土壤生態(tài)功能的影響等。如果轉基因植物為抗病蟲害性狀，還需根據(jù)外源基因作用的機制和特點，評價靶標生物抗性進化風險，并提出抗性監(jiān)測方案和治理措施。

2.3.3 推廣前評價 根據(jù)我國頒布的法規(guī)——《農(nóng)業(yè)轉基因生物安全管理條例》、《農(nóng)業(yè)轉基因生物安全評價管理辦法》，農(nóng)業(yè)轉基因產(chǎn)品應依次經(jīng)過中間試驗、環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗等步驟，方可申請安全證書，進入品種審定程序。其目的主要是審查和驗證研發(fā)者所提供的安全評價數(shù)據(jù)，以及發(fā)現(xiàn)在特定環(huán)境中釋放轉基因植物，尤其是較大規(guī)模釋放轉基因植物所產(chǎn)生的環(huán)境效應。主要評價內(nèi)容包括5個方面。

(2)目標性狀有效性評價。高效表達目標性狀是轉基因操作的根本所在，因此，目標性狀有效性是一個基本的評價指標。以轉Bt基因抗蟲植物為例，需在室內(nèi)進行生測試驗，在田間自然條件下進行接蟲試驗，調(diào)查靶標害蟲在轉基因植物及受體品種田的危害情況與種群動態(tài)，綜合評價目標性狀有效性。

(3)生存競爭能力評價。一般分為栽培地試驗與荒地試驗，主要評價轉基因植物與受體的種子活力、種子休眠特性、越冬越夏能力、抗病蟲能力、生長勢、生育期、產(chǎn)量、落粒性等的適合度變化及雜草化風險。若受體植物為多年生草類(飼草、制種用的草坪草)或目標性狀能增強生存競爭力(如抗旱、耐鹽等)，應根據(jù)個案提出有針對性的補充資料。

(4)基因漂移及其環(huán)境影響評價。轉基因植物外源基因漂移的風險主要有2個方面:①產(chǎn)生難治理的雜草;②降低野生近緣種的遺傳多樣性。應整理分析野生近緣種的分布與生物學特性，并設計試驗評價外源基因漂移頻率、外源基因在野生近緣種中的表達情況、目的基因是否改變野生近緣種的生態(tài)適合度等。如我國的水稻和大豆都存在野生近緣種，應重視對其外源基因漂移及其環(huán)境影響的研究。而玉米在我國不存在野生近緣種，因此，大部分學者認為，基因漂移不應成為轉基因玉米研究的重點。

(5)對非靶標生物及生物多樣性的影響。由于生態(tài)系統(tǒng)中各元素的關聯(lián)性，應根據(jù)外源基因表達蛋白特點和作用機制，科學地確定具有研究意義的非靶標生物，一般包括評價轉基因植物對群落中的非靶標重要植食性害蟲、害蟲天敵、資源昆蟲及其他受關注與保護的物種可能產(chǎn)生的影響。同時，有選擇地評價轉基因植物對相關動物群落、植物群落和微生物群落結構和多樣性的影響，以及對病蟲害等有害生物演化的影響。

2.3.4 推廣后監(jiān)測 目前，轉基因植物環(huán)境安全評價是利用短期、逐步擴大規(guī)模的試驗來評價與預測環(huán)境風險。因此，在商業(yè)化種植后，對轉基因作物的生態(tài)效應進行長期監(jiān)測，這對于積累生態(tài)效應數(shù)據(jù)尤為重要。監(jiān)測內(nèi)容主要包括重要轉基因作物外源基因成分的流散、靶標生物對轉基因作物的抗性、轉基因作物對生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性和生態(tài)功能的影響、轉基因作物對重要節(jié)肢動物群落演替的影響等。隨著轉基因產(chǎn)業(yè)化的不斷深入與發(fā)展，推廣后監(jiān)測將面臨更大的挑戰(zhàn)。國際通用做法是遵循“誰研發(fā)誰負責”的原則，由研發(fā)單位監(jiān)測轉基因植物商業(yè)化后引發(fā)的效應，再定期向國家相關管理部門匯報。如我國已商業(yè)化種植的轉Bt基因抗蟲棉，對其生態(tài)效應的監(jiān)測與研究主要由國家資助科研部門負責，并已取得重要的進展(Wu et al.，2008;Lu et al.，2010)。今后在我國如何落實監(jiān)測責任與監(jiān)督監(jiān)測工作，還有待深入探討。

3 新型性狀轉基因植物環(huán)境安全評價策略

3.1 復合性狀轉基因植物環(huán)境安全評價策略

復合性狀已成為轉基因植物發(fā)展的重要趨勢。2008年，全球種植的復合性狀轉基因作物達2690萬hm2，與2007年(2180萬 hm2)相比，增長率為23%，已成為發(fā)展最快的性狀組群(James，2009)。2009年，全球復合性狀轉基因作物面積又創(chuàng)新高，達到2870萬hm2(James，2010)。隨著更多轉化體的出現(xiàn)及潛在組合的增加，復合性狀轉基因植物安全評價技術將成為爭論的焦點。評價復合性狀轉基因植物應根據(jù)獲得途徑區(qū)分對待。目前，獲得復合性狀轉化體的途徑通常有3種:(1)基因轉化，即將已獲得批準種植的某一轉化品系作為受體，再轉入新性狀基因;(2)基因操作技術，將含有2個或多個性狀的基因同時轉入1個受體中;(3)常規(guī)育種，對2個或多個已批準種植的轉化品系進行復合。通過基因轉化或分子技術手段而產(chǎn)生的復合性狀轉基因植物應被認為是新的轉化體，需要進行完整的安全評價;通過常規(guī)育種手段獲得的復合性狀轉基因植物應根據(jù)個案進行分析，確定評價策略。通常是從基因整合、蛋白表達、溫室及田間自然狀態(tài)下的靶標效應鑒定等方面評估復合的基因間是否存在互作。如果基因間不存在互作，則認為復合性狀轉基因植物與父母本相比不存在更多的風險;如果基因間發(fā)生了互作，則應根據(jù)個案，補充數(shù)據(jù)，再進行評價(Duesing，2009;Layton，2009)。

孟山都、杜邦、先正達等生物種業(yè)公司認為，“大組合包容小組合原則”適用于評價復合性狀轉基因植物的安全性。即如果已證明A×B×C組合安全，則可認為A×B、B×C與A×C等3個組合均安全(Layton，2009)。但業(yè)內(nèi)人士并未對這一觀點取得共識。同時，評價數(shù)據(jù)的通用性問題，即復合性狀轉基因植物在一個地區(qū)所復合的基因間的互作關系是否適用于其他國家和地區(qū)，也被高度關注。如果僅從植物本身考慮，基因是否互作的數(shù)據(jù)應具有通用性，但在特定的生態(tài)環(huán)境中，是否可能引發(fā)新的風險仍無定論。因此，關于復合性狀轉基因植物安全性的評價策略尚存在一定的爭議，有待于深入研究及更多科學數(shù)據(jù)的證明。

3.2 養(yǎng)分高效與非生物脅迫抗性轉基因植物環(huán)境安全評價策略

近年來，養(yǎng)分高效與非生物脅迫抗性轉基因植物發(fā)展較快，并成為轉基因新品種研發(fā)的重要方向之一，其環(huán)境安全評價策略正處于廣泛探討中。根據(jù)個案原則，以外源基因的作用機制為基礎，科學假設風險，再利用科學試驗驗證，從而完善安全評價技術成為評價新型性狀轉基因植物的共識。有人認為，未來的養(yǎng)分高效與非生物脅迫抗性轉基因植物將傾向于以植物基因來源為主，較之以微生物基因來源為主的抗蟲、抗除草劑轉基因植物更具安全性，可適當減少安全評價程序與內(nèi)容，但此觀點尚未取得大家的共識。筆者認為，應建立科學、統(tǒng)一的養(yǎng)分高效、非生物脅迫抗性轉基因植物目標性狀有效性的鑒定標準;重點評價養(yǎng)分高效轉基因植物對釋放環(huán)境中其他植物、節(jié)肢動物及土壤生態(tài)功能的影響;重點評價非生物脅迫抗性轉基因植物基因漂移及其生態(tài)效應、生存競爭力及雜草化等風險。

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