金黃色葡萄球菌的表型藥物敏感性與耐藥基因攜帶性的相關(guān)分析

于美美，王佳齊，顧增輝，吳湘艷，沈蘭東，莊龍其，李倩

金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)存在于皮膚和軟組織感染、敗血癥等感染性疾病。目前SA耐藥情況嚴(yán)重，耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)治療非常困難[1]。細(xì)菌攜帶的耐藥基因與耐藥性有一定相關(guān)性，對(duì)耐藥菌株的檢測(cè)有一定輔助作用。為了解SA耐藥與基因攜帶性的關(guān)系，指導(dǎo)臨床合理用藥，本研究對(duì)分離的SA菌株86株進(jìn)行表型藥物敏感性和耐藥基因攜帶性的相關(guān)分析?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：選取2015年8月-2016年5月濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科分離出的非重復(fù)SA菌株86株。

1.1.2 主要試劑及儀器 EasyTaq? DNA Polymerase和EasyPure? Bacteria Genomic DNA Kit購(gòu)自北京全式金公司，全自動(dòng)微生物鑒定藥敏試驗(yàn)分析儀VITEK 2-Compact和鑒定卡VITEK? 2 AST-GP67購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司，PCR擴(kuò)增儀Applied BiosystemsTMVeritiTM96-Well Thermal Cycler購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.1 菌株鑒定與藥敏試驗(yàn)：全自動(dòng)微生物分析儀用于菌株鑒定及藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果參考CLSI 2014標(biāo)準(zhǔn)[2]。質(zhì)控菌株為SA ATCC 29213。MRSA指對(duì)苯唑西林耐藥[最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)≥4 μg/ml]或頭孢西丁耐藥(抑菌圈直徑≤21 mm或MIC≥8 μg/ml)的SA[2]。

1.2.2 耐藥基因檢測(cè)：取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液1 ml離心去上清，加入EasyPure? Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒中的RB11 200 μl和溶葡萄球菌素(10 mg/ml)10 μl重懸，37 ℃溫育1 h，再用試劑盒提取基因組。在華大基因進(jìn)行耐藥基因片段的引物合成(表1)，使用相應(yīng)引物對(duì)每株SA的基因組分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min。PCR陽(yáng)性片段在北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，使用Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行DNA序列比對(duì)，測(cè)序片段序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中該基因序列符合者納入統(tǒng)計(jì)范圍。耐藥基因PCR擴(kuò)增相應(yīng)引物見(jiàn)表1。

表1 耐藥基因PCR擴(kuò)增相應(yīng)引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用WHONET 5.6對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。耐藥率比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本及科室分布

2.1.1 患者臨床資料分布構(gòu)成比：患者中男性患病率略高于女性，18～60歲患者最多，標(biāo)本主要來(lái)源于分泌物、膿液和痰。見(jiàn)表2。

表2 患者臨床資料分布構(gòu)成比

2.1.2 科室分布：SA菌株多分布在兒科、關(guān)節(jié)外科、ICU和皮膚病科等。見(jiàn)表3。

表3 86株SA的科室分布

2.2 菌株耐藥情況

圖1 86株SA藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表4 MRSA與MSSA耐藥情況比較

2.3 相關(guān)耐藥基因檢測(cè)情況

表5 SA耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

注：M為DNA marker；a：泳道1為blaZ，2為tetM，3為msrA，4為qacA；b：泳道1為mecA，2為dfrG，3為tet38；c：泳道1為msrB，2為tetK，3為aac(6′)aph(2″)，4為ermB，5為qacC；d：泳道1為ermA；e：泳道1為ermC

2.3.2 MRSA和MSSA耐藥基因檢測(cè)結(jié)果：MRSA中mecA、tetK和tetM基因檢出率大于MSSA(P<0.05)，MRSA中最常見(jiàn)的四種耐藥基因攜帶譜blaZ+msrA+msrB+tet38占73.91%。見(jiàn)表6。

3 討 論

表6 MRSA和MSSA耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

環(huán)境對(duì)基因表達(dá)的影響使得SA對(duì)某些抗生素的表型耐藥性和耐藥基因攜帶性之間的相關(guān)性不高，因此分子生物學(xué)方法只能作為輔助診斷工具。本研究中檢出的MRSA除對(duì)苯唑西林、青霉素完全耐藥外，對(duì)紅霉素、克林霉素、四環(huán)素的耐藥率均>60%，說(shuō)明MRSA除對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥之外，對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、林克酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)抗生素也具有一定耐藥性。MRSA對(duì)3種及3種以上抗生素耐藥的菌株占95.65%，表現(xiàn)出多重耐藥的特征，可能與MRSA攜帶多種耐藥基因有很大關(guān)系。MRSA最常見(jiàn)的耐藥基因譜為blaZ+msrA+msrB+tet38，且23株MRSA均含有不等數(shù)目的耐藥基因，有1株MRSA攜帶12種耐藥基因，這要求今后臨床用藥更加謹(jǐn)慎[7]。

綜上所述，本地區(qū)SA表現(xiàn)出多重耐藥的特征，且與部分耐藥基因密切相關(guān)，治療時(shí)應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選用抗生素進(jìn)行治療。