外界因素和食品內(nèi)部環(huán)境變化對(duì)Brevilaterin抗菌特性的影響

王美姿，劉楊柳，韓盼盼，秦 明，王露露，王星星，陳 洲，賈英民

(北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，北京 100048)

食品防腐是保障食品免受微生物污染、延遲保質(zhì)期的重要舉措，除采用低溫、腌制(高糖或高鹽等)、真空保藏等傳統(tǒng)的防腐方法以外，通常還會(huì)添加各類防腐劑以達(dá)到協(xié)同抗菌的功效[1]。隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題的日益重視，以往常用的化學(xué)類防腐劑由于易殘留、過(guò)量食用后易導(dǎo)致人體出現(xiàn)健康問(wèn)題等缺陷已逐步被限制使用[2]，一些新型的生物類防腐劑應(yīng)運(yùn)而生?？咕?antimicrobial peptides，AMPs)被認(rèn)為是當(dāng)下研究最熱、應(yīng)用前景最好的生物防腐劑之一[3]。AMPs是由宿主產(chǎn)生的能抵御外界微生物侵害、消除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類小分子多肽[4]，具有抑菌譜廣、抑菌機(jī)制獨(dú)特且不易殘留等優(yōu)勢(shì)；而且，諸如Nisin等一系列的AMPs物質(zhì)都已被正式批準(zhǔn)并應(yīng)用在食品防腐當(dāng)中[5]。

食品是一個(gè)復(fù)雜多變的混合體系，受組分構(gòu)成、加工方式以及存儲(chǔ)條件等眾多因素的影響，并由此影響食品添加劑，如防腐劑等的使用[6]：Nisin在酸性食品中能發(fā)揮出非常好的抗菌效果，但在中性或堿性條件下卻幾乎無(wú)抗菌作用，高溫處理或在含卵磷脂(≥1%)的食品中也同樣會(huì)完全失去抗菌活力[7]；食品中存在的金屬離子也可能對(duì)AMPs的抗菌活性造成影響，如張煒等[8]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e2+能使抗菌肽BSN-37的活性消失；此外，食品的酸堿性以及表面活性劑等的存在均可能對(duì)AMPs的抗菌活性產(chǎn)生影響，如酸處理能顯著降低辣椒籽AMPs[9]的抗菌活性，而吐溫-20和吐溫-80卻能使其抗菌能力提高[10]?？梢姡珹MPs能否適應(yīng)外界因素和食品內(nèi)部環(huán)境的變化直接制約其在食品防腐領(lǐng)域中的應(yīng)用。為此，挖掘出適應(yīng)不同食品的AMPs新資源成為該領(lǐng)域研究者期待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的生物抗性細(xì)菌，能分泌多組分AMPs物質(zhì)，這些AMPs具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗癌細(xì)胞和抗病毒等生物特性，而且能抵抗溫度、pH值及化學(xué)試劑等外界因素對(duì)其抗菌活性的影響。本課題組前期已獲得了一株優(yōu)良的B.laterosporus[11]，并發(fā)現(xiàn)溫度、pH值、化學(xué)試劑以及紫外線處理等外界因素均不會(huì)影響該菌分泌的AMPs(Brevilaterin)的抗菌活性，表現(xiàn)出了Brevilaterin良好的應(yīng)用潛能[12-13]。然而，Brevilaterin是否能抵抗食品中更多外界因素對(duì)其抗菌活性的影響還不得而知，這也一定程度上限制了其應(yīng)用，此外，Brevilaterin在食品發(fā)生變化的過(guò)程中所表現(xiàn)出的抗菌作用規(guī)律也不清楚。本研究將以Brevilaterin為對(duì)象，系統(tǒng)研究不同外界因素對(duì)其抗菌活性的影響，并考察Brevilaterin在食品內(nèi)部環(huán)境變化過(guò)程中的抗菌作用規(guī)律，旨在為其在食品防腐中的應(yīng)用提供充足的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抗菌肽Brevilaterin，由本實(shí)驗(yàn)室篩選的側(cè)孢短芽孢桿菌B.laterosporusS62-9[14]分泌所得，其終效價(jià)為861.0 AU/mL。

指示菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，CICC No.10001)、單增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，CICC No.21635)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus，CICC No.10269)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，CICC No.10351)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis，CICC No.20711)、嗜堿芽孢桿菌(Halomonasalkalicola，CICC No.11012s)、梭狀芽孢桿菌(Bacillusfusiformis，CICC No.20463)，均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15.0 g，魚蛋白胨12 g，CaCl21.38 g，ZnCl20.008 16 g、Tween-20 1 g，蒸餾水1.0 L，pH值7.0。

胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基：胰蛋白胨15.0 g，大豆胨5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂13.0 g，蒸餾水1.0 L，pH值7.3±0.2。

乳酸菌培養(yǎng)基I(LBMI)：酵母膏7.5 g，葡萄糖10.0 g，番茄汁100 mL，蛋白胨7.5 g，KH2PO42.0 g，Tween-80 0.5 g，蒸餾水900 mL，pH值7.0。

MRS肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g, 牛肉粉5 g，葡萄糖20 g，酵母粉4 g，乙酸鈉5 g，KH2PO45 g，MgSO40.2 g，檸檬酸三銨2 g，MnSO40.05 g，Tween-80 1 g，蒸餾水 1.0 L，pH 值6.2±0.2。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉浸粉3 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1.0 L，pH值7.3±0.1。

1.2 儀器與設(shè)備

PREP中壓層析系統(tǒng)，瑞士BUCHI公司；Scan 4000型全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，法國(guó)Interscience；INFINITE Spark 10M型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；Omega series微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀，德國(guó)BMG Labtech公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1Brevilaterin抗菌活性測(cè)定

采用瓊脂擴(kuò)散法，以S.aureus為指示菌[9]。以經(jīng)2代活化的菌為種子液發(fā)酵制備菌懸液，稀釋菌濃度至OD600為0.7～0.8，按體積分?jǐn)?shù)為3%的量添加到預(yù)冷至50 ℃左右的NA培養(yǎng)基中，迅速混勻后倒平板，備用。

取無(wú)菌牛津杯擺放在倒好的平板上，加入50 μL Brevilaterin溶液，將平板移至4 ℃冰箱并靜置預(yù)擴(kuò)散1 h，再移至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)16 h，待平板上長(zhǎng)出致密的菌層，并出現(xiàn)清晰的抑菌圈后取出，用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀測(cè)量抑菌圈直徑。

1.3.2最小抑菌濃度的測(cè)定

最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定，采用微量液體稀釋法，參照Kondejewski等[15]的方法并作適當(dāng)修改。

1)調(diào)節(jié)菌體濃度。以無(wú)菌培養(yǎng)基為空白，測(cè)定菌懸液的OD600，調(diào)節(jié)菌濃度至與0.5麥?zhǔn)媳葷峁?McFarland)相同的OD600(約為1×108CFU/mL)，再用0.85%無(wú)菌生理鹽水稀釋菌濃度至1.0×106CFU/mL，備用。

2)MIC測(cè)定。以96板的每行為一個(gè)測(cè)試組，各設(shè)3個(gè)平行，1～10列分別為不同濃度的處理組，11列為陽(yáng)性對(duì)照組，12列為空白對(duì)照組。向1～11列微孔中分別注入100 μL無(wú)菌培養(yǎng)基，第12列加入200 μL無(wú)菌培養(yǎng)基。向第1列中加入100 μL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的AMPs溶液，再逐級(jí)向后進(jìn)行2倍稀釋至第10列，混勻后舍棄第10列板孔中的100 μL溶液。再分別向1～11列微孔中接入100 μL預(yù)調(diào)好濃度的菌懸液，使其終濃度為5×105CFU/mL，置于菌株最適生長(zhǎng)溫度下培養(yǎng)16～20 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)600 nm波長(zhǎng)處的吸光值(A值)，根據(jù)A值計(jì)算AMPs對(duì)菌株的生長(zhǎng)抑制率。結(jié)合抑制率大于等于90%所對(duì)應(yīng)的濃度，以及肉眼觀察無(wú)可見菌生長(zhǎng)的最低濃度最終確定MIC。

1.3.3最小殺菌濃度的測(cè)定

最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)的測(cè)定，以MIC測(cè)定結(jié)果為基礎(chǔ)，分別吸取MIC實(shí)驗(yàn)中無(wú)菌生長(zhǎng)濃度下的菌懸液100 μL并涂布于固體培養(yǎng)基上，置于該菌最適生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)24 h，以平皿上菌落數(shù)小于5個(gè)的最低濃度為MBC值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4不同外界因素及處理對(duì)Brevilaterin抗菌活性影響實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 金屬離子、乳化劑、增稠劑、酶類和蔗糖對(duì)Brevilaterin抗菌活性影響的處理方法

考察了不同外界因素對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響，包括金屬離子、乳化劑、增稠劑、酶類和高濃度蔗糖。處理方法：分別將金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Al3+和Fe3+，終濃度為12.5～300.0 mmol/L、乳化劑(甘油、十二烷基苯磺酸鈉、單硬脂酸甘油酯和大豆磷脂，終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)、增稠劑(明膠、羧甲基纖維素鈉、黃原膠和卡拉膠，終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%)、酶類(脂肪酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、溶菌酶、酸性蛋白酶和堿性蛋白酶，終質(zhì)量濃度為30.0 mg/mL)和蔗糖(終質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%～50%)與Brevilaterin(終質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL)混勻，再按1.3.1的方法測(cè)定其抗菌活性。以只添加不同因素的樣品組作為陰性對(duì)照組，以只添加Brevilaterin的樣品組作為陽(yáng)性對(duì)照組。

1.3.4.2 反復(fù)凍融對(duì)Brevilaterin抗菌活性影響的處理方法

將終質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的Brevilaterin反復(fù)凍融(-20 ℃凍結(jié)，常溫解凍；0～12次)處理，再按1.3.1的方法測(cè)定Brevilaterin的抗菌活性，以不經(jīng)凍融處理的Brevilaterin為空白對(duì)照。

1.3.5食品內(nèi)部環(huán)境變化對(duì)Brevilaterin抗菌作用影響實(shí)驗(yàn)

分別考察了食品內(nèi)部溫度、pH值、滲透壓變化以及氧含量變化對(duì)Brevilaterin抗菌作用規(guī)律的影響，以MIC和MBC為最終考察指標(biāo)。

1.3.5.1 溫度變化實(shí)驗(yàn)

以S.aureus、L.monocytogenes、M.luteus、P.aeruginosa為指示菌，按照1.3.2和1.3.3的方法分別測(cè)定Brevilaterin在溫度變化條件下(4、10、25、37 ℃)對(duì)指示菌的MIC和MBC。

1.3.5.2 pH值變化實(shí)驗(yàn)

以L.lactis、S.aureus和H.alkalicola為指示菌，按照1.3.2和1.3.3的方法分別測(cè)定Brevilaterin在pH值變化條件下(pH值 2.0～11.0)對(duì)指示菌的MIC和MBC。

1.3.5.3 滲透壓變化實(shí)驗(yàn)

以S.aureus為指示菌，按照1.3.2和1.3.3的方法分別測(cè)定Brevilaterin在滲透壓變化條件下(蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%～50%；NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～15%)對(duì)S.aureus的MIC和MBC。

1.3.5.4 氧含量變化實(shí)驗(yàn)

以B.fusiformis、S.aureus為指示菌，按照1.3.2和1.3.3的方法分別測(cè)定Brevilaterin在氧氣含量變化條件下(5%～21%)對(duì)B.fusiformis、S.aureus的MIC和MBC。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外界因素及處理?xiàng)l件對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響

2.1.1不同外界因素對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響

本課題組前期探索發(fā)現(xiàn)，溫度、pH值、常見的化學(xué)試劑以及紫外線等并不直接影響B(tài)revilaterin的抗菌活性[12-13]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步系統(tǒng)考察了更多外界因素對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響，包括金屬離子、乳化劑、增稠劑、酶類和高濃度蔗糖。結(jié)果表明，Brevilaterin能夠抵抗除大豆磷脂以外的所有測(cè)試因素對(duì)其抗菌活性的影響。可見，Brevilaterin具有很好的環(huán)境適應(yīng)性，這也為其在更多類別食品中的抗菌應(yīng)用提供了良好的理論支撐。

2.1.1.1 金屬離子的影響

某些食品(如皮蛋、油條、鹵水豆腐等)因加工的需要通常會(huì)添加較高濃度的金屬離子，如Pb2+、Al3+、Mg2+、Ca2+等。這些金屬離子(添加量在10～300 mmol/L)很可能會(huì)對(duì)蛋白或肽類物質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響并造成其活性的變化[1,10,16]，如金屬離子會(huì)抑制魚精蛋白的抑菌活力，并隨著電荷數(shù)和濃度的增加而增強(qiáng)[1]。李軍等[16]發(fā)現(xiàn)，90.0 mmol/L Ag+使蘿卜籽蛋白提取物的抗菌活性降低70%，而300.0 mmol/L的Ca2+可以使花椒籽蛋白AMPs的活性提高[10]。還有部分肽類抗生素要發(fā)揮抗菌作用還需依賴金屬離子的存在，這也為其應(yīng)用帶來(lái)一定的麻煩，如桿菌肽和博來(lái)霉素就是典型的金屬依賴類抗菌肽[17]。金屬離子對(duì)Brevilaterin抗菌活性研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 金屬離子對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響

2.1.1.2 乳化劑的影響

乳化劑是在面包、蛋糕和餅干等食品中起乳化、分散、潤(rùn)滑和穩(wěn)定作用的常用添加劑(添加量在0.5%～5.0%)[18-19]。乳化劑在疏水和靜電作用下，很可能會(huì)與蛋白或肽類結(jié)合，進(jìn)而影響它們的活性[20]，如G?nzle等[7]曾研究發(fā)現(xiàn)，1%的卵磷脂會(huì)使Nisin完全失去抗菌活性。乳化劑對(duì)Brevilaterin抗菌活性研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。由圖1可見，Brevilaterin的抗菌活性除了受到大豆磷脂一定程度的抑制以外，均不受其他乳化劑的影響。

圖1 乳化劑對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響

2.1.1.3 增稠劑的影響

增稠劑主要用于改善和增加食品的黏稠度，保持流態(tài)食品、膠凍食品的色、香、味和穩(wěn)定性，改善食品物理性狀，并能使食品有潤(rùn)滑適口的感覺(jué)。增稠劑常添加在果凍、調(diào)味糖漿、軟糖等食品中[21]，常用添加量為0.5%～5.0%[22]。如李鵬等[23]發(fā)現(xiàn)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.05%卡拉膠和0.45%海藻酸鈉組成的復(fù)合膠制備南瓜果凍，能更好地保持果凍的柔軟性和彈性。增稠劑對(duì)Brevilaterin抗菌活性研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可見，Brevilaterin的抗菌活性基本不受增稠劑的影響，因此，Brevilaterin適合果凍、軟糖等食品的防腐應(yīng)用。

圖2 增稠劑對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響

2.1.1.4 酶制劑的影響

焙烤食品、釀造食品、肉類食品等，在加工過(guò)程中通常會(huì)添加某種酶制劑來(lái)有效提高其加工程度、改進(jìn)加工工藝以及改善其風(fēng)味和品質(zhì)[24-25]；然而，酶的添加(質(zhì)量濃度一般達(dá)10 mg/mL以上時(shí))，尤其是蛋白酶，通常會(huì)對(duì)蛋白或肽類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成破壞，致使其生物活性喪失[12,23]。研究發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的AMPs對(duì)蛋白酶具有不同的敏感性，如蘿卜籽蛋白提取物基本不受9 mg/mL蛋白酶影響[16]，而格氏乳球菌分泌的garviecin LG 34極易被蛋白酶(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶，5 mg/mL)水解[26]?；诳咕腂revilaterin是由13個(gè)氨基酸、N末端有一個(gè)C6脂肪酸組合而成的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，本研究重點(diǎn)考察蛋白酶與脂肪酶對(duì)其抗菌活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。圖3表明，Brevilaterin對(duì)多種蛋白酶均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗性；此外，Brevilaterin的抗菌活性同樣不受脂肪酶影響。

圖3 蛋白酶對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響

2.1.1.5 高濃度蔗糖的影響

果脯、蜜餞以及罐頭類食品通常采用過(guò)量加糖的方式來(lái)擬造高滲的保藏環(huán)境，以此來(lái)防止微生物的侵染，如此極端的食品屬性就對(duì)生物防腐劑提出更高的要求。本研究發(fā)現(xiàn)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4)，Brevilaterin在含有50%蔗糖的環(huán)境中依然能夠保持原有的抗菌活力，這表明其非常適用于高滲的保藏環(huán)境下的防腐保鮮。

圖4 蔗糖對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響

2.1.2反復(fù)凍融處理對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響

本研究還考察了反復(fù)凍融處理對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。圖5表明，Brevilaterin能夠完全耐受反復(fù)凍融處理對(duì)其抗菌活性的影響，表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性。

圖5 凍融次數(shù)對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響

低溫及冷凍環(huán)境可以保持水果、蔬菜、奶制品、鮮肉等食品品質(zhì)(嫩度、持水性、脂肪氧化)和商品品質(zhì)(色澤、質(zhì)構(gòu))，但反復(fù)解凍過(guò)程又很容易引入食品腐敗菌的侵染；同時(shí)，蛋白和肽類物質(zhì)的生物活性很可能會(huì)受凍融處理的影響而改變，給其應(yīng)用帶來(lái)一定的隱患[27]。圖5顯示，Brevilaterin在經(jīng)過(guò)12次反復(fù)凍融之后依然能夠保持原有的抗菌活力，表明其能夠適應(yīng)于較大的溫度反復(fù)變化。其他來(lái)源的AMPs如BSN-37、F1的粗提物，經(jīng)10～12次、5次反復(fù)凍融后[28]，抗菌活性也能保持不變。

2.2 食品內(nèi)部環(huán)境變化對(duì)Brevilaterin抗菌作用的影響

食品的屬性及其加工工藝不盡相同，為了實(shí)現(xiàn)有效抑制食品腐敗菌的生長(zhǎng)、延長(zhǎng)貨架期，存儲(chǔ)時(shí)通常都會(huì)選用差異性很大的食品保藏環(huán)境。降低保藏溫度、調(diào)整酸堿度、創(chuàng)造高滲環(huán)境和應(yīng)用真空包裝或脫氧劑是最常用于控制食品腐敗菌生長(zhǎng)的重要方式，但為了延長(zhǎng)食品保存的貨架期，目前大部分食品保藏時(shí)除了選用上述特殊食品保藏環(huán)境外，還需加入一定量的防腐劑來(lái)強(qiáng)化抑制食品腐敗菌的生長(zhǎng)。

隨著食品貯藏時(shí)內(nèi)部環(huán)境的變化，食品腐敗菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和生長(zhǎng)量可能會(huì)受到不同程度的影響。特別是當(dāng)生長(zhǎng)條件偏離菌株最適生長(zhǎng)條件時(shí)，菌株的生長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)緩慢，甚至休眠的狀態(tài)，菌體生長(zhǎng)量也會(huì)隨之出現(xiàn)一定程度的下降[29]。為此，本研究以O(shè)D600為指標(biāo)，考察了受試菌在生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生變化時(shí)的生長(zhǎng)量變化。結(jié)果表明，受試菌在最適生長(zhǎng)環(huán)境下，菌體生長(zhǎng)良好，但逐漸偏離受試菌最適生長(zhǎng)條件時(shí)，菌體生長(zhǎng)緩慢，菌體量出現(xiàn)一定程度的減少(具體結(jié)果未列出)。

此外，雖然前期研究已證實(shí)Brevilaterin在不同因素的影響以及不同條件的處理下均能保持良好的抗菌效果[12-13]，但是，Brevilaterin在食品內(nèi)部環(huán)境發(fā)生變化時(shí)是否會(huì)對(duì)食品腐敗菌表現(xiàn)出不同的抗菌作用規(guī)律呢？本研究通過(guò)模擬不同食品內(nèi)部環(huán)境的變化(溫度、pH值、滲透壓以及氧含量)，考察抗菌肽Brevilaterin對(duì)食品腐敗菌的抗菌作用規(guī)律，旨在明確Brevilaterin能夠抑制或者殺死受試菌所需要添加的參考量。

2.2.1溫度變化對(duì)Brevilaterin抗菌作用的影響

選取S.aureus、L.monocytogenes、M.luteus和P.aeruginosa為指示菌，分別測(cè)定4 ℃(冷藏)、10 ℃(低溫)、25 ℃(室溫)和37 ℃(菌體最適生長(zhǎng)溫度)下Brevilaterin對(duì)各指示菌的MIC和MBC，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。表2表明，Brevilaterin對(duì)所有測(cè)試溫度下的菌株均有很好的抑制效果，但隨著溫度的改變，Brevilaterin對(duì)各指示菌的MIC和MBC也產(chǎn)生了不同程度的變化。在4 ℃下，Brevilaterin對(duì)M.luteus的MIC和MBC均為37 ℃下的1/8；在10 ℃下，Brevilaterin對(duì)P.aeruginosa的MIC和MBC均為37 ℃下的1/4，對(duì)L.monocytogenes的MIC和MBC分別為37 ℃下的1/4和1/2，對(duì)S.aureus的MIC和MBC均為37 ℃下的1/2。

表2 溫度變化對(duì)Brevilaterin抗菌作用的影響

溫度是調(diào)控微生物生長(zhǎng)性狀的主要因素之一，而降低保藏溫度也是食品防腐的重要措施[30]。所以，闡明溫度變化時(shí)Brevilaterin對(duì)食源性致病菌的抗菌作用規(guī)律對(duì)于科學(xué)地指導(dǎo)AMPs的防腐應(yīng)用有著重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，Brevilaterin對(duì)各指示菌的MIC和MBC逐漸減小，這也反映出Brevilaterin對(duì)食源性致病菌的抗菌作用逐漸增強(qiáng)。可能原因是，低溫條件下微生物逐步進(jìn)入休眠狀態(tài)，生長(zhǎng)繁殖趨緩，代謝和免疫等功能逐漸弱化，在此環(huán)境下Brevilaterin便能發(fā)揮出更好的抗菌效果[31]；同時(shí)，這也表明了在達(dá)到相同的抗菌效果時(shí)，Brevilaterin在較低溫度下所需添加的量便能大大減少，降低了其應(yīng)用成本[32]。

2.2.2pH值變化對(duì)Brevilaterin抗菌作用的影響

以L.lactis、S.aureus、H.alkalicola為指示菌，分別測(cè)定pH值變化時(shí)Brevilaterin對(duì)各指示菌的MIC和MBC，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。表3表明，Brevilaterin對(duì)所有測(cè)試pH值下的菌株均有很好的抑制效果，但隨著pH值的改變，Brevilaterin對(duì)各指示菌的MIC和MBC也產(chǎn)生了不同程度的變化。pH值為2時(shí)，Brevilaterin對(duì)L.lactis的MIC和MBC降低為pH為6值時(shí)的1/2；pH值為8～9時(shí)，Brevilaterin對(duì)S.aureus的MIC和MBC減小到pH值為7時(shí)的1/2；而Brevilaterin在pH值為7.0值時(shí)會(huì)對(duì)H.alka-licola表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗菌活性。

表3 pH值變化對(duì)Brevilaterin的抗菌作用的影響

酸堿環(huán)境是影響微生物生長(zhǎng)的重要因素之一，而調(diào)整食品保存的pH值也是有效防止食品腐敗變質(zhì)的重要方法。本課題組前期研究結(jié)果證實(shí)，pH值的變化對(duì)Brevilaterin抗菌活性并不產(chǎn)生影響[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在偏離菌株最適的生長(zhǎng)pH值時(shí)，Brevilaterin對(duì)指示菌的MIC和MBC顯著減小，說(shuō)明其對(duì)食源性致病菌的抗菌作用增強(qiáng)。產(chǎn)生該結(jié)果的原因：一方面是因?yàn)榫晟L(zhǎng)趨緩；另一方面可能是，pH值改變會(huì)引起膜電勢(shì)的改變[1]，從而導(dǎo)致指示菌對(duì)Brevilaterin敏感性改變，進(jìn)而使Brevilaterin的添加量減少，同樣達(dá)到防止腐敗的效果。

2.2.3滲透壓變化對(duì)Brevilaterin抗菌作用的影響

以S.aureus為指示菌，分別測(cè)定不同濃度的蔗糖和NaCl存在環(huán)境下，Brevilaterin對(duì)S.aureus的MIC和MBC，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。表4結(jié)果表明，隨著蔗糖或者NaCl濃度的改變，Brevilaterin對(duì)S.aureus的MIC和MBC也發(fā)生了變化。在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)12.5%及以上時(shí)，Brevilaterin對(duì)S.aureus的MBC為初始條件下的1/2；類似的，在8%NaCl存在時(shí)，Brevilaterin對(duì)S.aureus的MBC為對(duì)照的1/2。

表4 滲透壓變化對(duì)Brevilaterin抗菌作用的影響

擬造高滲環(huán)境是最常用于控制微生物生長(zhǎng)的食品存儲(chǔ)方法之一[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)食品的滲透壓較高時(shí)，Brevilaterin對(duì)S.aureus的MBC會(huì)顯著減小，可見其對(duì)食源性致病菌的抗菌作用增強(qiáng)，Brevilaterin與滲透壓的協(xié)同能對(duì)食源性致病菌產(chǎn)生更強(qiáng)的抗菌作用。產(chǎn)生該結(jié)果的可能原因是，微生物離開其生長(zhǎng)最適的水分活度后[34]，菌株逐漸出現(xiàn)緩慢、休眠等狀態(tài)，菌體量也隨之降低，進(jìn)而使得Brevilaterin抑制指示菌所需用量減少。

2.2.4氧含量對(duì)Brevilaterin抗菌作用的影響

以B.fusiformis和S.aureus為指示菌，分別測(cè)定氧氣體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、21%時(shí)，Brevilaterin對(duì)各指示菌的MIC和MBC，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。表5表明，氧含量的變化僅能一定程度上調(diào)控菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)，但并不影響B(tài)revilaterin對(duì)指示菌的抗菌效果。

表5 氧含量變化對(duì)Brevilaterin抗菌作用的影響

氧氣是影響微生物生長(zhǎng)不可缺少的因素之一，使用真空包裝或應(yīng)用脫氧劑都是食品防腐的重要手段[35]，但常見的食源性致病菌多屬于兼性厭氧型菌株，它們?cè)谟醒鹾蜔o(wú)氧環(huán)境中均能生長(zhǎng)，如大腸桿菌、沙門氏菌。本研究發(fā)現(xiàn)，氧含量的變化并不影響B(tài)revilaterin對(duì)厭氧菌B.fusiformis和對(duì)照菌S.aureus的抗菌作用，因此Brevilaterin在厭氧環(huán)境也能達(dá)到防腐抗菌的效果。

3 結(jié) 論

本研究考察了不同外界因素對(duì)Brevilaterin抗菌活性的影響，結(jié)果表明，Brevilaterin能抵抗除大豆磷脂以外的所有因素以及反復(fù)凍融處理對(duì)其抗菌活性的影響。本研究還深入探討了食品內(nèi)部環(huán)境變化對(duì)Brevilaterin抗菌作用規(guī)律的影響，結(jié)果表明，隨著溫度、pH值和滲透壓的改變，Brevilaterin的抗菌作用規(guī)律均會(huì)發(fā)生顯著變化。隨著溫度的降低，Brevilaterin對(duì)S.aureus、L.monocytogenes、M.luteus和P.aeruginosa的抗菌作用逐漸增強(qiáng)，MIC和MBC減少至菌株生長(zhǎng)最適溫度下的1/8～1/2；當(dāng)pH值偏離L.lactis、S.aureus和H.alkalicola生長(zhǎng)最適pH值時(shí)，Brevilaterin對(duì)這些菌株的MIC和MBC均減小為初始的1/4～1/2；滲透壓升高后，Brevilaterin對(duì)S.aureus的MBC也降低為常壓下的1/2?？傮w上，當(dāng)食源性致病菌的生長(zhǎng)條件偏離其最適條件時(shí)，Brevilaterin能表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌作用，而此時(shí)的MIC和MBC均降低至最適條件下的1/8～1/2。Brevilaterin良好的穩(wěn)定性，以及能隨著食品內(nèi)部環(huán)境變化而表現(xiàn)出不同的抗菌作用的特點(diǎn)，可為Brevilaterin在食品防腐中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。