基于多元統計分析的不同訶子屬藥材多指標成分研究

李國衛(wèi)，索彩仙，吳文平，潘禮業(yè)，胡綺萍，何嘉瑩，孫冬梅

廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，佛山 528244

2020年版《中國藥典》收載的訶子屬藥材品種有訶子、絨毛訶子、西青果。訶子性苦、酸、平，歸肺、大腸經，為使君子科植物訶子TerminaliachebulaRetz.或絨毛訶子T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的成熟果實，每年的秋、冬季果實成熟的時候采收；西青果別名藏青果，是使君子科植物訶子T.chebulaRetz.的干燥幼果[1]，每年的9～10月將尚未成熟的幼果采下，置于沸水中略煮燙，曬干或者是烘干。訶子、絨毛訶子及西青果化學成分較為相似，以可水解類鞣質為主[2-4]，還含有多酚類、黃酮類等化學成分。訶子具有抗病毒、抗炎、降血糖和鎮(zhèn)咳等藥理作用[5,6]，西青果清熱生津，解毒，主治陰虛白喉，具有清除羥自由基、抗氧化等功效，臨床常用于咽喉腫痛、咽炎等癥狀[7]，兩者的藥理作用、性味功效存在較大不同[8]。

目前針對訶子屬的研究多以單個品種的含量測定及特征圖譜為主，但未見有對訶子屬藥材的整體質量研究[9-14]。Zhao等[15]基于化學成分預測了訶子的Q-marker可能為沒食子酸、訶子酸、訶藜勒酸、鞣花酸，在此基礎上，本研究擬通過建立多指標含量測定方法，利用化學模式識別法，包括方差分析、聚類分析(HCA)、主成分分析(PCA)、偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)，探討訶子、絨毛訶子和西青果三者的差異，以期為訶子屬藥材的質量評價及資源利用提供參考依據。

1 儀器與材料

Waters H-Class型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Waters Cortecs T3 C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；XP-26型百萬分之一天平，ME204E型萬分之一天平(瑞士Mettler公司)；Milli-Q超純水凈化系統(美國Millipore公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

沒食子酸對照品(批號：110831-201906，含量：91.5%)、柯里拉京對照品(批號：111623-200301，含量：≥98%)，由中國食品藥品檢定研究院提供；訶子次酸對照品(批號：Yz0613211，含量：≥98%)由南京源植生物科技有限公司提供；安石榴苷(A&B)對照品(批號：CFS201901，含量：≥98%)、訶藜勒酸對照品(批號：CFS201901，含量：≥98%)、訶子酸對照品(批號：CFS201902，含量：≥98%)，由武漢天植生物技術有限公司提供；甲醇、乙腈為色譜純；水為純化水；其余試劑為分析純。

實驗所用藥材共44批，經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，H1～H17號樣品為使君子科植物訶子T.chebulaRetz.的干燥成熟果實；X1～X14號樣品為使君子科植物訶子T.chebulaRetz.的干燥幼果；RH1～RH13為使君子科植物絨毛訶子T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實，詳細信息見表1。

表1 藥材信息來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Cortecs T3 C18(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；以乙腈(A)-0.2%磷酸(B)為流動相，梯度洗脫(0～3 min，0%A；3～5 min，0%→3%A；5～12 min，3%→10%A；12～20 min，10%A；20～25 min，10%→14%A；25～35 min，14%→17%A；35～40 min，17%→21%A；40～45 min，21%→60%A；45～50 min，60%A)，流速為0.35 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為270 nm。

2.2 對照品溶液制備

取訶子次酸、沒食子酸、安石榴苷(A&B)、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為413.560、105.271、519.400、116.700、1609.552、495.635 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取本品粉末(過三號篩)約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用70%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統適應性

取“2.2”項下的對照品儲備液，供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進行測定，訶子次酸、沒食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子在1.00～1.05之間?；旌蠈φ掌啡芤杭肮┰嚻啡芤阂妶D1。

圖1 對照品、供試品UPLC圖Fig.1 UPLC chart of reference substance and sample注：A：混合對照品；B：訶子；C：西青果；D：絨毛訶子。1：訶子次酸；2：沒食子酸；3：安石榴苷A；4：安石榴苷B；5：柯里拉京；6：訶藜勒酸；7：訶子酸。Note:A:Mixed references;B:Mature fruit of T.chebula Retz.;C:Immature fruit of T.chebula Retz.;D:Mature fruit of T.chebula Retz.var.tomentella Kurt.1:Chebulic acid;2:Gallic acid:3:Punicalagin A;4:Punicalagin B;5:Corilagin;6:Chebulagic acid;7:Chebulinic acid.

2.4.2 線性范圍

取“2.2”項下的對照品儲備液，加甲醇稀釋制得6個不同質量濃度的對照品溶液，其中訶子次酸質量濃度分別為0.345、3.446、34.463、206.780、413.560、620.340 μg/mL，沒食子酸質量濃度分別為0.351、3.509、35.090、105.271、210.542、315.812 μg/mL，安石榴苷A+B質量濃度分別為2.841、28.410、259.700、519.400、831.040、1 038.800 μg/mL，訶藜勒酸質量濃度分別為0.340、3.404、34.039、1 005.970、1 609.552、2 011.940 μg/mL，柯里拉京質量濃度分別為0.389、3.890、38.900、116.700、233.400、350.100 μg/mL，訶子酸質量濃度分別為0.346、3.459、34.594、495.635、793.016、991.270 μg/mL,以峰面積為縱坐標(y)，質量濃度(μg/mL)為橫坐標(x)進行線性回歸，得到各個對照品的線性關系良好，R2值均值0.999 5以上，結果見表2。

2.4.3 精密度試驗

取同一供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進樣6次，訶子酸、沒食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸的峰面積RSD<2%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按“2.1”項下的的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣測定，訶子酸、沒食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸的峰面積RSD<2%，表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復性試驗

取樣品粉末約0.25 g，平行6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，訶子酸、沒食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸的峰面積RSD<2%，表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率考察

精密稱取已知含量的訶子藥材(H17)0.125 g，平行6份，加入與樣品中含量等量的對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率。測得7個成分平均加樣回收率均在97.34%～99.75%，RSD<3%，結果見表3。

表2 回歸方程及線性范圍

表3 加樣回收考察

續(xù)表3(Continued Tab.3)

2.4.7 結果與分析

2.4.7.1 含量測定結果

精密稱取44批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，得到含量測定結果，見表4。結果顯示，3種藥材的7個成分含量存在顯著差異，RSD在33.03%～77.32%之間。其中，RSD≥50%的包括6個成分，分別為沒食子酸(49.5%)、安石榴苷A&安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸；訶子次酸在不同批次樣品中較為穩(wěn)定，RSD為33.03%。

表4 含量測定結果

續(xù)表4 (Continued Tab.4)

2.4.7.2 方差分析

以上述7個含量測定指標為檢驗變量，訶子、西青果、絨毛訶子作為分組變量，采用SPSS 20.0軟件，通過Shapiro-Wilk檢驗法對44批藥材樣品7個成分數據進行正態(tài)分布驗證，結果顯示7個指標的sig.值均小于0.05，不服從正態(tài)分布；因此采用非參數檢驗法(秩和檢驗)進行下一步分析，選擇Kruskal-Wallis法進行對三個不同基原的7個指標進行兩兩比較，結果見表5。其中，安石榴苷A & B、訶藜勒酸在三組樣品間均有極顯著差異(P<0.01)；訶子次酸在訶子與西青果、西青果與絨毛訶子間有極顯著差異(P<0.01)，在訶子與絨毛訶子間無顯著差異；柯里拉京在訶子與絨毛訶子、西青果與絨毛訶子間有極顯著統計學差異(P<0.01)，在訶子與西青果無顯著差異；沒食子酸在訶子與絨毛訶子、訶子與西青果間有極顯著差異(P<0.01)；在絨毛訶子與西青果間無顯著差異；訶子酸在西青果與絨毛訶子、訶子與絨毛訶子間有極顯著差異(P<0.01)，在訶子與西青果間無顯著差異；上述分析結果說明訶子、西青果、絨毛訶子三者間的成分含量存在差異。

表5 各含量指標分析表

2.4.7.3 聚類分類

運用SPSS軟件對44批藥材樣品7個成分的含量測定結果進行系統聚類，采用組間平均數聯結法，以余弦距離作為樣品相似度的距離公式，樣品聚為3類(見圖2)。13批絨毛訶子樣品(RH1～RH13)聚為一類，14批訶子樣品(H1～H14)聚為一類，14批西青果樣品(X1～X14)與3批訶子(H15～H17)樣品聚為一類。從總體數據來看，不同品種藥材樣品間具有明顯差異，其中絨毛訶子與其他兩種藥材的差異較大，距離為25時就可以歸為不同的類型；西青果和訶子具有一定的相似性，當距離為20時，可以聚為一類，當距離為15時，兩者可以區(qū)分，但仍然有部分訶子樣品未能在西青果樣品中分離，在距離為5時才能完全分離，說明兩者具有較高的相似性。

2.4.7.4 主成分分析

以7個成分含量測定結果為變量，采用SPSS 22.0軟件進行主成分分析，由表6可知，共提取了2個特征值大于1的主成分，累積方差貢獻率達86.674%，表明可以用2個主成分反映不同樣品主要的質量特征。從表7可以看出，在第一主成分有較高載荷的包括安石榴苷A&B、柯里拉京、訶藜勒酸；在第二主成分有較高載荷的包括沒食子酸、訶子酸。(載荷值>0.80)以降維得到的2個主成分得分作為X、Y軸，得到44個樣品的散點分布圖，結果顯示，3種藥材樣品能實現較好區(qū)分，同類樣品基本能聚在同一區(qū)域，說明3種藥材之間的成分存在一定差異，結果見圖4。三批訶子樣品(H15～H17)與西青果樣品聚在同一區(qū)域，與聚類分析結果一致。3種樣品的主成分得分分析：西青果樣品除X1的主成分2評分為-0.08外，2個主成分評分基本為正值；絨毛訶子樣品主成分1評分均為負值，主成分2評分除個別批次(RH1)外均為正值；訶子樣品除H15～H17外，其他樣品的兩個主成分評分基本為負值，結果見表8。

圖2 44批藥材樣品聚類分析結果Fig.2 Cluster analysis results of 44 batches of samples

2.4.7.5 OPLS-DA

依據PCA結果，對3種不同藥材樣品進行OPLS-DA分析。該OPLS-DA模型，R2X(cum)=0.976，R2X(cum)=0.936，Q2(cum)=0.923，均大于0.5，說明模型穩(wěn)定可靠，可用于使君子科不同藥材樣品的區(qū)分。結果顯示，數據的分類算法中OPLS-DA的效果較好，可使3種樣本點完全被分開，相互之間沒有樣品出現交叉的情況，且全部樣品均位于95%可信區(qū)間之內，說明3種樣品在這7種化學成分含量上存在一定的差異，結果見圖5。采用變量重要性投影值(ariable importance in project，VIP)篩選體現3種樣品差異性的標志物，其中VIP值大于1的成分包括3個，分別為訶子酸(VIP=1.06)、安石榴苷A&B(VIP=1.01)，是體現3種樣品間差異的主要標志性成分，其余峰VIP值小于1，對樣品的區(qū)分影響較小，結果見圖5。

表6 特征根、各主成分的貢獻率

表8 主成分得分

圖3 主成分得分分布圖Fig.3 Score plot of principal components

3 分析與討論

3.1 檢測條件的確定

安石榴苷A與安石榴苷B為一對同分異構體，且容易發(fā)生相互轉化，本研究已在色譜條件下將兩者分離，呈雙峰，但考慮到兩者容易發(fā)生相互轉化若單獨計算會影響加樣回收率的計算，故以2個色譜峰峰面積之和計算。在200～400 nm處進行全波長掃描，訶子次酸、沒食子酸、安石榴苷A、安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、訶子酸在270 nm均有最大吸收，故選擇270 nm為同時測定波長。

圖4 OPLS-DA得分圖Fig.4 Score plot of OPLS-DA注：橫坐標t[1]為預測主成分值；縱坐標t[2]為正交主成分值。Note:X-axis is predicted principal component value;Y-axis is orthogonal principal component value.

圖5 7個化學成分的VIP值Fig.5 VIP value of 7 chemical components

3.2 多指標含量測定結果分析

本研究測定了2020年版《中國藥典》收載的3種訶子屬藥材訶子、絨毛訶子、西青果中7種化學成分的含量，并結合方差分析、聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法 - 判別分析等化學計量法分析了不同種藥材含量的差異。方差分析結果顯示，訶子次酸、安石榴苷A&安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸5個成分在西青果中含量均值均最高，且與其他兩種藥材的含量均值均有明顯差異，P<0.05具有統計學意義；訶子酸在訶子中含量均值最高，且與其他兩種藥材的含量均值均有明顯差異(P<0.01)具有統計學意義；沒食子酸在絨毛訶子中含量最高，但與西青果的含量差異不大，但兩者與訶子的含量均值有明顯差異((P<0.01)具有統計學意義。聚類分析、主成分分析與正交偏最小二乘法-判別分析均可以將不同樣品按品種進行劃分，主成分分析結果顯示安石榴苷A&安石榴苷B、柯里拉京、訶藜勒酸、沒食子酸、訶子酸為體現不同品種差異的主要因素，正交偏最小二乘法-判別分析結果顯示訶子酸、安石榴苷A&安石榴苷B為區(qū)分不同品種的主要因素。綜上可見，不同訶子屬藥材的化學成分組成較為接近，其差異主要體現在不同化學成分的含量上，安石榴苷A、安石榴苷B、訶子酸、柯里拉京、訶藜勒酸、沒食子酸等成分在不同訶子屬藥材間的差異較大，建議建立對訶子屬藥材的進行多指標質量控制，才能全面評價該類藥材的質量。

在主成分分析結果中有三批訶子樣品(H15～H17)其得分分布與西青果靠近，分析含量測定數據發(fā)現，這三批樣品的含量數據均接近訶子、西青果整體含量均值的中間值，而訶子為使君子科植物訶子干燥成熟果實，而西青果則為使君子科植物訶子的干燥幼果，推測可能是由于果實成熟度不足導致。從本研究中的結果可以看出，除訶子酸外，訶子的其余6個指標均遠低于西青果，訶子酸則大幅度高于西青果，說明訶子在成熟的過程中，其含量組成會發(fā)生轉化，也從另一方面為訶子與西青果藥效特點不一致提供了依據。

本研究建立了訶子屬藥材7個指標成分的UPLC含量測定方法，對44個不同藥材樣本進行了測定，并采用方差分析、聚類分析、主成分分析與正交偏最小二乘法-判別分析對含量測定結果進行了分析，分析結果顯示3種訶子屬藥材的成分組成存在明顯差異，為訶子屬藥材的質量控制提供了可靠的分析方法與參考依據。