基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討朱茯苓用于失眠的作用機(jī)制

周 揚(yáng)，郭冷秋，劉 遜，談如藍(lán)，鐘其新，曾 峰

1蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 蘇州檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215009；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)青蒿研究中心，廣州 510445；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院(福田)，深圳 518034

失眠通常指患者對(duì)睡眠時(shí)間和(或)質(zhì)量不滿足并影響白天社會(huì)功能的一種主觀體驗(yàn)，是一種常見的生理心理疾患[1]，其發(fā)病率約為20%[2]，已日益成為涉及范圍甚廣的社會(huì)熱點(diǎn)，引起人們的廣泛重視。失眠在中醫(yī)中亦稱“不寐”，指由于外感或內(nèi)傷等原因，造成陰陽氣血及心、肺、脾、腎等臟腑功能失調(diào)而引起的無法正常睡眠為特征的一種病癥[3]，輕者入睡困難、睡后易醒、醒后不能再寐或時(shí)寐時(shí)醒等。重者整夜徹夜難眠，長期失眠會(huì)給人的正常生活和工作帶來嚴(yán)重的不利影響。目前臨床治療失眠的西藥以苯二氮卓、非苯二氮卓類為主，此類藥物主要作用于神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)[4]，但副作用大、依賴性強(qiáng)、有成癮風(fēng)險(xiǎn)。而中醫(yī)藥治療失眠主要以補(bǔ)虛瀉實(shí)、調(diào)整臟腑陰陽為治則，在治療失眠方面具有副作用小、無依賴性和成癮性等優(yōu)勢(shì)，越來越受到重視，在臨床應(yīng)用廣泛并取得良好的療效。

茯苓味甘性平，歸心、肺、脾和腎經(jīng)，有利水滲濕、健脾寧心的功效[5]。茯苓的主要有效成分為茯苓多糖和三萜類物質(zhì)，相關(guān)研究表明茯苓特有的四環(huán)三萜化合物茯苓酸具有鎮(zhèn)靜催眠作用且茯苓酸的催眠效果與調(diào)節(jié)腦內(nèi)GABA的A型受體(GABA-A)表達(dá)水平有關(guān)[6]。朱砂為硫化物類礦物辰砂族辰砂，主含硫化汞(HgS)，朱砂味甘性微寒，歸心經(jīng)，有清心鎮(zhèn)驚、安神、明目、解毒的功效，相關(guān)研究表明，朱砂能夠延長大鼠的慢波睡眠，有效改善大鼠的睡眠[7]。拌衣炮制是一種傳統(tǒng)炮制工藝，朱茯苓即為采用此工藝制成，取茯苓塊以清水噴淋，稍悶潤后加水飛朱砂細(xì)粉撒布均勻，反復(fù)翻動(dòng)，使其外表粘滿朱砂粉末，然后晾干而成(每50 g茯苓配用水飛朱砂細(xì)粉1 g)[8]?！侗静菥V目》中記載：“茯苓，本草言利小便，伐腎邪……同朱砂能秘真元”。因此理論上，茯苓拌染朱砂后，可共奏鎮(zhèn)靜安神、祛邪寧心之效，多用于失眠、驚悸、健忘諸癥。然而，目前關(guān)于朱茯苓治療失眠的研究和機(jī)制探討的文章尚不多見。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)緊緊圍繞系統(tǒng)生物學(xué)、生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析等進(jìn)行藥物有效性、代謝特性的揭示，是建立在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索基礎(chǔ)上的生物信息網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析策略和技術(shù)基礎(chǔ)上的科學(xué)思想和研究策略。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)構(gòu)建多層次網(wǎng)絡(luò)模型，從整體角度對(duì)中藥進(jìn)行研究，已成為一種科學(xué)解釋中藥有效性和科學(xué)性的新策略，在多方面的中藥研究中已具備了成功應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)[9]。

本研究以朱茯苓鎮(zhèn)靜安神的功效為切入點(diǎn)，遵循網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論與技術(shù)，篩選朱茯苓活性成分及潛在靶點(diǎn)，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行器官定位，并進(jìn)行GO功能和KEGG通路的富集分析以及分子對(duì)接驗(yàn)證，通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)驗(yàn)證朱茯苓對(duì)GABA受體α1亞基基因(Gamma-aminobutyric acid receptor subunit alpha-1，GABRA1)和γ2亞基基因(Gamma-aminobutyric acid receptor subunit gamma-2，GABRG2)兩種受體蛋白水平的影響，以期從分子層面初步闡述朱茯苓治療失眠的可能的分子作用機(jī)制，為朱茯苓進(jìn)行后續(xù)深入研究提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1 朱茯苓的活性成分篩選

朱茯苓活性成分的篩選，基于TCMSP平臺(tái)(http://tcmspw.com/index.php)、TCMID數(shù)據(jù)庫(http://www.megabionet.org/tcmid/)和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)以及文獻(xiàn)查閱，收集茯苓和朱砂的活性成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和類藥性(drug-likeness，DL)篩選區(qū)符合條件的候選活性成分和對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，將OB≥30%和DL≥0.18設(shè)為篩選條件，針對(duì)某些成分雖然OD值和DL值較低但仍具有較強(qiáng)活性這一情況，結(jié)合相關(guān)活性成分的文獻(xiàn)記載，得到最終篩選得到的活性成分，使用Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)驗(yàn)證活性成分并獲取其分子結(jié)構(gòu)及PubChem CID等信息。

1.2 靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選

運(yùn)用TCMSP平臺(tái)、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫和STITCH數(shù)據(jù)庫(http://stitch.embl.de/)預(yù)測(cè)活性成分的靶點(diǎn)。在OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、CTD數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org/)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)上篩選失眠相關(guān)靶點(diǎn)。將活性成分和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)，篩除非人類靶點(diǎn)并校正靶點(diǎn)名稱。

1.3 化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)及靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將活性成分及其靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Cytoscape_v3.7.2軟件(http://www.cytoscape.org/)，構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)?；赟tring數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)獲取活性成分和疾病的交集靶點(diǎn)的高置信度PPI網(wǎng)絡(luò)信息，在Cytoscape軟件中構(gòu)建靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用“NetworkAnalyzer”工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，根?jù)拓?fù)鋮?shù)篩選核心化合物和核心靶點(diǎn)。

1.4 器官定位

將朱茯苓治療失眠的潛在靶點(diǎn)上傳至BioGps數(shù)據(jù)庫(http://biogps.org/)進(jìn)行器官定位分析，并繪制靶點(diǎn)的器官定位圖。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析及化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將朱茯苓治療失眠的潛在靶點(diǎn)上傳至David6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，選擇物種和背景為人(Homo sapiens)，進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析并在Cytoseape軟件中構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

根據(jù)上述篩選出的活性成分和核心靶點(diǎn)，從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)獲取相應(yīng)靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)，使用Autodock_vina軟件(http://vina.scripps.edu/)對(duì)靶點(diǎn)與核心活性成分和陽性對(duì)照藥物艾司唑侖(estazolam)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。

1.7 Western blot檢測(cè)小鼠腦組織中GABRA1及GABRG2的表達(dá)

1.7.1 藥材、試劑和儀器

艾司唑侖片(20180710，常州四藥制藥有限公司)；朱砂拌白茯苓飲片(2017101808，上海余天成中藥飲片有限公司)；戊巴比妥鈉(626Y9216，美國Sigma公司)；GABRA1單克隆抗體、GABRG2單克隆抗體、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)(AH01126063，AC072366，AH11279138，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司)；PowerPac Basic 型蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.7.2 動(dòng)物

健康SPF級(jí)ICR雄性小鼠，體重<15 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。

1.7.3 實(shí)驗(yàn)方法

將30只健康SPF級(jí)雄性ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后，隨機(jī)分為生理鹽水組、艾司唑侖組、朱茯苓水煎液低、中、高劑量組，分別灌胃相應(yīng)濃度的藥液(艾司唑侖藥液劑量為0.15 mg/kg，朱茯苓水煎液低中高劑量分別為1.14、2.28和4.55 g/kg)，給藥體積20 mL/kg，每天1次，連續(xù)灌胃7天，于末次給藥50 min后腹腔注射戊巴比妥鈉閾劑量并禁食12 h，脫頸椎處死小鼠，于冰浴皿上快速取出大腦，剝?nèi)ツX膜，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈，濾紙吸干后，然后取腦組織加入裂解液，冰上裂解1 h后高速離心取上清，測(cè)定組織蛋白濃度，以PAGE凝膠電泳分離蛋白樣品。按照說明書提供的分子量條帶選定切膠范圍，濕法轉(zhuǎn)膜，用封閉液封閉1 h(含5%脫脂奶粉的TBS-T緩沖液)。室溫孵育后棄去封閉液，加入一抗在4 ℃孵育過夜，TBS-T洗5×5 min，加入二抗溫育1 h，TBS-T洗5×5 min，最后進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1 朱茯苓的活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過TCMSP平臺(tái)、TCMID數(shù)據(jù)庫、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫、STITCH數(shù)據(jù)庫以及文獻(xiàn)查閱，收集朱茯苓的活性成分并預(yù)測(cè)其潛在靶點(diǎn)，篩除重復(fù)化合物及缺少靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的化合物后，使用Pubchem數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證活性成分的分子結(jié)構(gòu)并獲取PubChem CID等信息。結(jié)果共篩選朱茯苓活性成分33種，其中茯苓32種、朱砂1種，經(jīng)過Uniprot篩選和校正的潛在靶點(diǎn)有267個(gè)。表1為朱茯苓的活性成分信息。

表1 朱茯苓的活性成分信息

2.2 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape中構(gòu)建朱茯苓的化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer進(jìn)行拓?fù)浞治??；衔?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共有300個(gè)節(jié)點(diǎn)(包括 33個(gè)化合物和267個(gè)靶點(diǎn))，453條邊。網(wǎng)絡(luò)中一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度(degree)表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連接的路線條數(shù)，活性成分度值越高，作用的潛在靶點(diǎn)越多，活性成分的度值越高說明該成分越可能是核心活性成分。該網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)活性成分平均有13.7個(gè)靶點(diǎn)，度值中位數(shù)為9。拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示，15個(gè)活性成分的作用靶點(diǎn)≥10個(gè)，其中麥角胺(8223)、齒孔醇(9803310)、腺嘌呤(190)、去氫齒孔酸(15250826)等四個(gè)活性成分的作用靶點(diǎn)≥30個(gè)，上述15個(gè)高度值活性成分可作為朱茯苓的核心活性成分。圖1為朱茯苓的化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，橙色節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為活性成分，其中深藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為核心活性成分。表2為degree≥10的核心活性成分拓?fù)鋮?shù)表。

表2 核心活性成分拓?fù)鋮?shù)表

圖1 朱茯苓治療失眠的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 The compound-target network of Zhufuling in the treatment of insomnia

2.3 交集靶點(diǎn)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)

從OMIM數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫、CTD數(shù)據(jù)庫和GeneCards數(shù)據(jù)庫共篩選到258個(gè)失眠相關(guān)靶點(diǎn)，朱茯苓的潛在靶點(diǎn)與失眠相關(guān)靶點(diǎn)共存在36個(gè)交集靶點(diǎn)，將36個(gè)交集靶點(diǎn)上傳String數(shù)據(jù)庫，獲得高置信度的靶點(diǎn)間相互作用信息，在Cytoscape中構(gòu)建交集靶點(diǎn)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。使用Network Analyzer進(jìn)行拓?fù)浞治?，結(jié)果為介度中心度(betweenness centrality，BC)中位數(shù)為0.026 338 32，緊密中心度(closeness centrality，CC)中位數(shù)為0.45，度(degree)中位數(shù)為5，表3為核心靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)表，圖2為朱茯苓治療失眠的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，節(jié)點(diǎn)直徑與度值大小成正比，深色節(jié)點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。結(jié)果表明共有13個(gè)靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)滿足上述中位數(shù)卡值，可作為朱茯苓治療失眠的核心靶點(diǎn)。

表3 朱茯苓治療失眠的核心靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)表

圖2 朱茯苓治療失眠的靶點(diǎn)蛋白高置信度交互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The high confidence interaction network of target protein of Zhufuling in the treatment of insomnia

2.4 器官定位結(jié)果

基于BioGps數(shù)據(jù)庫對(duì)朱茯苓治療失眠的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行器官定位分析，結(jié)果見圖3，圖3為朱茯苓治療失眠潛在靶點(diǎn)的器官定位圖，其中深紅色靶點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。結(jié)果表明36個(gè)交集靶點(diǎn)中11個(gè)靶點(diǎn)作用于腦，6個(gè)靶點(diǎn)作用于心，3個(gè)靶點(diǎn)作用于肝，2個(gè)靶點(diǎn)作用于肺，14個(gè)靶點(diǎn)作用于淋巴、小腸等其他器官。說明朱茯苓主要通過對(duì)腦、心及淋巴等器官的共同作用實(shí)現(xiàn)對(duì)失眠的治療效果。

2.5 富集分析結(jié)果

圖4為GO功能富集分析條形圖，GO功能富集分析共富集到P<0.05的GO條目189個(gè)，包括154個(gè)生物過程(biological process，BP)條目、16個(gè)細(xì)胞組分(cell components)條目、19個(gè)分子功能(molecular function)條目。其中GABA信號(hào)通路(gamma-aminobutyric acid signaling pathway)、5-羥色胺(5-HT)信號(hào)通路(serotonin receptor signaling pathway)、多巴胺(DA)突觸傳遞(synaptic transmission，dopaminergic)、GABA-A型受體活動(dòng)(GABA-A receptor activity)等條目P值小且與失眠密切相關(guān)。圖5為KEGG通路富集分析氣泡圖，KEGG通路富集分析共富集到24條與失眠相關(guān)的通路，其中刺激神經(jīng)組織的互動(dòng)(neuroactive ligand-receptor interaction)、DA能神經(jīng)突觸(dopaminergic synapse)、5-HT神經(jīng)突觸(serotonergic synapse)、逆行神經(jīng)信號(hào)(retrograde endocannabinoid signaling)、cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)、GABA受體神經(jīng)突觸(GABAergic synapse)等條目P值最小。

2.6 化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)

在Cytoscape中構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，圖6為朱茯苓治療失眠的化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，其中深綠色節(jié)點(diǎn)為核心活性成分，深藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為核心靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)共有79個(gè)節(jié)點(diǎn)和188條邊，包括24種活性成分，33個(gè)靶點(diǎn)和24條KEGG通路?？梢?，朱茯苓通過多種成分的多個(gè)靶點(diǎn)作用于多條失眠相關(guān)的通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)失眠的治療作用。

圖3 朱茯苓治療失眠潛在靶點(diǎn)的器官定位圖Fig.3 The organ location map of potential target of Zhufuling in the treatment of insomnia

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

選取兩個(gè)核心靶點(diǎn)GABRA1和GABRG2與相應(yīng)核心活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。從PDB數(shù)據(jù)庫篩選的GABRA1受體蛋白PDB-ID為6HUK，Ligand-ID為HOZ；GABRG2受體蛋白PDB-ID為6HUJ，Ligand-ID為NAG。使用分子對(duì)接模擬軟件Autodock_vina對(duì)GABRA1、GABRG2兩個(gè)靶點(diǎn)與10個(gè)核心活性成分及陽性對(duì)照藥物艾司唑侖進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，計(jì)算活性成分、艾司唑侖與受體蛋白間的最低結(jié)合能。

表4為分子對(duì)接最低結(jié)合能計(jì)算結(jié)果，圖7為茯苓酸與兩種受體蛋白的分子對(duì)接可視化結(jié)果。表4結(jié)果表明所有活性成分與受體蛋白的最低結(jié)合能均遠(yuǎn)小于-5.0 kJ/mol，結(jié)合圖7的分子對(duì)接可視化結(jié)果，可以說明，GABRA1、GABRG2兩個(gè)靶點(diǎn)能夠與活性成分自發(fā)結(jié)合并借助氫鍵等分子間作用力形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象。

圖4 GO生物功能富集條形圖Fig.4 The bar chart of GO biological function enrichment

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.5 The bubble chart of KEGG pathway enrichment analysis

圖6 朱茯苓治療失眠的化合物-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.6 The compound-target-pathway network of Zhufuling in the treatment of insomnia

表4 活性成分與受體蛋白的最低結(jié)合能

圖7 茯苓酸(5484385)與兩種受體蛋白的分子對(duì)接可視化結(jié)果Fig.7 The visualization results of molecular docking between pachymic acid (5484385) and two receptor proteins

2.8 朱茯苓對(duì)小鼠腦組織 GABRA1和GABRG2蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果見圖8和圖9。與生理鹽水組比較，朱茯苓中、高劑量組小鼠腦組織中GABRA1和GABRG2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)可以說明朱茯苓在一定劑量時(shí)可以促進(jìn)GABRA1和GABRG2蛋白的表達(dá)。

圖8 各組小鼠腦組織中GABRA1和GABRG2蛋白表達(dá)電泳Fig.8 The expression electrophoresis of GABRA1 and GABRG2 in brain tissue of mice in each group注：1～5分別為生理鹽水、艾司唑侖、朱茯苓水煎液低、中、高劑量組。Note:1-5 are saline,estazolam,Zhufuling water decoction low,medium and high dose groups,respectively.

3 討論

朱茯苓具有鎮(zhèn)靜安神的功效，是治療失眠不寐的常用中藥，臨床上應(yīng)用廣泛且療效顯著。本研究基于多成分、多靶點(diǎn)作用的研究思路，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，分析朱茯苓治療失眠的靶點(diǎn)，闡述朱茯苓治療失眠的機(jī)制，為朱茯苓的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

茯苓主要含三萜類和多糖類兩種化合物，此外還含有其他成分如甾體類、氨基酸、揮發(fā)油、膽堿、腺嘌呤及鉀鹽等微量元素[10]。在化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中高度值、含有多個(gè)作用靶點(diǎn)的核心活性成分多為三萜類化合物及其衍生物，如茯苓酸(5484385)、土莫酸(12314446)、齒孔酸(73402)、去氫齒孔酸(15250826)等。三萜類化合物具有廣泛的藥理活性，如利尿、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)靜等[11]。有研究表明，茯苓總?cè)颇軐?duì)抗電休克及戊四唑驚厥發(fā)作，其機(jī)制與降低海馬區(qū)門冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)含量有關(guān)，具有鎮(zhèn)靜興奮性神經(jīng)元和抗驚厥等作用[12]。Gao等[13]研究發(fā)現(xiàn)茯苓總?cè)凭哂酗@著的鎮(zhèn)靜作用，并能調(diào)節(jié)大腦中GABA和Glu的含量。朱砂是一種礦物藥，歸心經(jīng)，中醫(yī)以其為安神要藥，臨床上主要用于失眠多夢(mèng)，心悸易驚，小兒驚風(fēng)等，具有解毒安神、清心鎮(zhèn)驚的功效，效果較好。Li等[14]對(duì)朱砂進(jìn)行的研究結(jié)果顯示，朱砂的抗心律失常作用可能是其鎮(zhèn)心安神功效的主要基礎(chǔ)之一。朱砂含有HgS、MgS、Bi、Fe、Ba、Mn、Sb、As、Hg2+、HgCl2等[15]，HgS 不溶于水，在機(jī)體內(nèi)很難吸收，但它是朱砂的主要活性成分，可在人體內(nèi)酸效應(yīng)及絡(luò)合效應(yīng)的作用下發(fā)生解離，并與體內(nèi)的氨基酸等生物分子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)后生成具有強(qiáng)烈生理活性及毒性較小的絡(luò)合物從而發(fā)揮藥效[16]。朱砂所含的可溶性汞鹽溶于水，游離汞和微量金屬元素不溶于水，朱砂的主要毒性成分是可溶性汞鹽[17]，由于朱砂有毒，因此臨床上使用朱砂時(shí)一般需將其采用水飛法炮制后再使用，水飛可降低朱砂中的可溶性汞鹽含量，從而達(dá)到減毒增效的作用。朱茯苓，其實(shí)就是朱砂均勻拌于茯苓的表面而制得的，因此朱茯苓含有朱砂和茯苓兩種中藥，其中朱砂用量較少，因此筆者猜測(cè)朱茯苓發(fā)揮鎮(zhèn)靜安神作用的成分主要來源于茯苓，而朱砂可能是通過與茯苓相協(xié)同，達(dá)到增強(qiáng)寧心安神的效果。在進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究時(shí)，朱茯苓同時(shí)具有朱砂和茯苓兩種中藥的化學(xué)成分，然而TCMID和BATMAN-TCM等數(shù)據(jù)庫中所對(duì)應(yīng)的朱砂的成分只提供了HgS的信息，因此在活性成分的選擇上，選取了茯苓的比較常用的活性成分和朱砂中的主要成分HgS。在活性成分篩選時(shí)考慮活性成分的OB值和DL值，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，納入某些OB和DL值很低但文獻(xiàn)報(bào)道其活性較好的活性成分。

圖9 朱茯苓水煎液不同劑量對(duì)小鼠腦組織GABRA1和GABRG2 蛋白表達(dá)的影響(n=3)Fig.9 Effect of Zhufuling decoction on protein expression of GABRA1 and GABRG2 in brain tissue of mice (n = 3)注：與生理鹽水組比較，**P<0.01。Note:Compared with the normal saline group,**P<0.01.

基于BioGPS數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的交集靶點(diǎn)器官定位分析結(jié)果顯示，朱茯苓主要通過作用于腦、心、肺、肝、淋巴等器官實(shí)現(xiàn)對(duì)失眠的干預(yù)效果。中醫(yī)認(rèn)為腦為“元神之府”，主生命活動(dòng)、精神意識(shí)及感覺運(yùn)動(dòng)，臟象學(xué)說將腦的生理病理統(tǒng)歸于心而分屬于五臟中。心為“君主之官”，主藏神，與腦協(xié)同作用調(diào)控人的精神、意識(shí)、思維等；主血脈，將血上供于腦，血足則腦髓充盈。心腦相通，則神志活動(dòng)正常，睡眠良好。同時(shí)朱茯苓潛在靶點(diǎn)的多器官分布體現(xiàn)了中醫(yī)理論的整體觀，即各臟器間互相影響、互相聯(lián)系、協(xié)同作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)機(jī)體的調(diào)節(jié)[18]。

利用Autodock_Vina對(duì)GABRA1和GABRG2兩個(gè)靶點(diǎn)與10個(gè)核心活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果顯示上述兩個(gè)靶點(diǎn)的受體蛋白均能與核心活性成分較穩(wěn)定的自發(fā)結(jié)合，而且大部分活性成分與靶點(diǎn)蛋白的最低結(jié)合能高于陽性對(duì)照的最低結(jié)合能。由此可以推測(cè)，朱茯苓可能通過茯苓酸等活性成分作用于GABA受體，從而達(dá)到治療失眠的效果。

在Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證部分結(jié)果顯示，相對(duì)于空白組，艾司唑侖組、朱茯苓中、高劑量組小鼠腦組織中GABRA1和GABRG2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)，說明朱茯苓能夠提高腦內(nèi)GABRA1和GABRG2兩種受體蛋白的表達(dá)，證實(shí)了朱茯苓是通過對(duì)GABRA1、GABRG2兩個(gè)核心靶點(diǎn)的基因及蛋白的直接作用，從而發(fā)揮其藥理作用的。同時(shí)，Shah等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，茯苓酸可通過介導(dǎo)GABA能系統(tǒng)增強(qiáng)戊巴比妥的催眠作用，茯苓酸可以改變GABA-A受體各亞基的水平從而達(dá)到鎮(zhèn)靜催眠的效果，與Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同印證了分子對(duì)接結(jié)果的合理性。

GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果中，GABA信號(hào)通路、5-HT信號(hào)通路、5-HT神經(jīng)突觸、GABA受體神經(jīng)突觸、DA突觸傳遞等條目P值較小且富集基因較多。GABA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有催眠、鎮(zhèn)靜和抗焦慮等功能。GABA的調(diào)控通過GABA受體發(fā)揮作用，α1與β2和γ2組成的GABA-A受體亞型在腦內(nèi)數(shù)量最多，約占全部GABA-A受體的43%[20]。Jiang等[21]發(fā)現(xiàn)內(nèi)因性失眠癥患者中樞重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA顯著降低。Winkelman等[22]從質(zhì)子磁共振譜得出，原發(fā)性失眠患者GABA水平較對(duì)照組低30%。大多數(shù)鎮(zhèn)靜催眠藥物共有的主要藥理作用機(jī)制是通過神經(jīng)遞質(zhì)GABA或通過刺激GABA-A受體、抑制5-HT的1A受體發(fā)揮鎮(zhèn)靜作用，GABRA等基因所參與的神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路與神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞在失眠的治療過程中發(fā)揮著重要的作用[23]。5-HT和DA是大腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT的各受體亞型具有調(diào)節(jié)睡眠、覺醒周期的作用，激動(dòng)突觸前5-HT1A自身受體，可延長慢波睡眠，減少覺醒；激動(dòng)突觸后5-HT1A受體，可抑制睡眠并促進(jìn)覺醒[24]。DA起著維持覺醒和行為興奮的作用。當(dāng)各種原因使其維持覺醒和行為興奮的作用受到抑制時(shí)，亦可影響睡眠、覺醒周期。相關(guān)研究證明[25]，失眠患者的5-HT、DA水平與健康人群存在明顯差異，而通過藥物改善患者的5-HT、DA水平，可以有效地改善患者的失眠癥狀。由此可見，朱茯苓對(duì)GABA、5-HT和DA等神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)可能是朱茯苓治療失眠的重要機(jī)制。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)朱茯苓治療失眠的靶點(diǎn)進(jìn)行了分析，對(duì)36個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行了器官定位分析，對(duì)GABRA1和GABRG2兩個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行了分子對(duì)接模擬，驗(yàn)證了GABA能系統(tǒng)機(jī)制的重要作用及核心活性成分篩選的合理性，為實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供依據(jù)?；衔?靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)體現(xiàn)了朱茯苓多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)。富集分析結(jié)果提示GABA信號(hào)通路、5-HT信號(hào)通路、DA突觸傳遞等通路和生物過程的重要作用。本研究為朱茯苓治療失眠機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了新思路和新方法，為朱茯苓的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。