妊娠期糖尿病患者胎盤組織中miRNA-508-3p 和HGF 表達水平及其對滋養(yǎng)細胞胰島素抵抗的影響

黃 好, 賈 虹, 王曉霜, 張 鷺, 段亞亭

（1. 重慶市中醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400011；2. 重慶市中醫(yī)院超聲科，重慶 400011）

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）作為常見的妊娠并發(fā)癥，是臨床上孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒發(fā)病率和死亡率升高的重要原因，嚴重威脅母嬰健康。近年來，隨著妊娠平均年齡和肥胖率的增加，GDM 發(fā)生率也逐漸升高［1］。但迄今為止，GDM 發(fā)病機制尚不明確，多數(shù)學(xué)者認為胰島素抵抗（insulin resisitance，IR） 是GDM 發(fā)病的重要病理機制［2］。當GDM 發(fā)生時，滋養(yǎng)細胞作為胎盤組織的主要功能細胞，在結(jié)構(gòu)及功能上均發(fā)生明顯改變，其中大量微小RNA （microRNA，miRNA）及蛋白表達異常，可能均與IR 的發(fā)生有密 切 關(guān) 聯(lián)。 微 小RNA-508-3p （microRNA-508-3p，miR-508-3p）位于X 染色體q27.3，有研究［3］顯示：miR-508-3p 在GDM 患者的胎盤組織中表達水平明顯升高，但其具體作用機制尚不明確。肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF） 是一種具有肝素結(jié)合特性的酸性蛋白質(zhì)，在胎盤組織中含量豐富［4］。最新研究［5］證實： HGF 能夠通過降低抗原遞呈細胞主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ的表達進而減輕IR，改善GDM 患者胎盤組織的病理損傷。應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析已發(fā)現(xiàn)HGF 的3′-UTR 區(qū) 存 在 與miR-508-3p 靶 向 結(jié) 合 位 點。但 關(guān)于兩者在GDM 胎盤組織中的表達及相互作用尚未見相關(guān)報道。本研究旨在通過分析GDM 患者胎盤組織中miR-508-3p 和HGF 的表達及調(diào)控機制，以期進一步闡明GDM 的發(fā)病機制，為臨床診斷及治療GDM 提供新的思路及策略。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2018 年4 月—2019 年4 月本院產(chǎn)科門診就診及住院孕產(chǎn)婦30 例，其中15 例為GDM 組，15 例健康孕產(chǎn)婦為正常對照組。GDM 的診斷按照第9 版《婦產(chǎn)科學(xué)》的診療標準［6］：在妊娠的第24～28周空腹口服75 g葡萄糖進行糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT），當空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）≥5.1 mmol·L－1，或服糖后1 h血糖≥10.0 mmol·L－1，或服糖后2 h 血糖≥8.5 mmol·L－1，即可診斷為GDM。入選標準：所有孕產(chǎn)婦均為單胎妊娠，GDM 患者符合上述診斷標準；排除標準：妊娠并發(fā)心腦血管、肺、肝和腎等疾病者，妊娠并發(fā)甲狀腺等內(nèi)分泌疾病及妊娠前即診斷為糖尿病者。所有產(chǎn)婦分娩后，在胎盤母體面的正中部位取約200 mg 組織（包括胎盤全層，不含羊膜層），并于30 min 內(nèi)送至實驗室，無菌生理鹽水充分漂洗，用于免疫組織化學(xué)染色的胎盤組織置于10%甲醛溶液中進行固定，其余胎盤組織迅速置于液氮中凍存以供后續(xù)其他實驗研究。標本及資料采集均取得研究對象知情同意并簽署知情同意書，并獲得本院倫理委員會批準。

1.2 細胞、主要試劑和儀器人絨毛膜滋養(yǎng)細胞HTR-8/Svneo 購于中國科學(xué)院上海細胞所。RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS） 和0.25%含EDTA 胰蛋白酶（美國Hyclone 公司），TRIzol（美國Thermo 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒（上?？禐槭兰o生物科技有限公司），PCR 引物［生工生物工程（上海）有限公司］，Opti-MEM 培養(yǎng)基及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000（美國Invitrogen 公 司 ） ，miR-508-3p inhibitor、microRNA 無 關(guān) 序 列 （miR-NC）、 miR-508-3p mimic、野生型（WT）及突變型（MUT）HGF 熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pmirGLO 雙熒光素酶報告基因載體）（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），雙熒光素酶系統(tǒng)（美國Promega 公司），HGF 抗體、磷酸化 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶 （phosphorylated phosphatidylinositol 3 kinase，p-PI3K）抗體和磷酸化蛋白激酶B （phosphorylated protein kinase B，p-AKT）抗體（美國Abcam 公司），鼠抗人β-actin抗體、HRP 標記的山羊抗鼠抗體和BCA 蛋白定量試劑盒（廣州晶彩生物科技有限公司），免疫組織化學(xué)EnVison 兩步法試劑盒和二氮基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），葡萄糖檢測試劑盒和胰島素（美國Sigma公司）。超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司），PCR儀、凝膠電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色檢測胎盤組織中HGF 陽性表達率從液氮中取出胎盤組織，于室溫下采用PBS 緩沖液反復(fù)沖洗以去除血跡后經(jīng)10%甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，制成厚度約4 μm 的組織切片，采用EnVison 兩步法檢測胎盤組織中HGF 的表達。HGF 抗體稀釋比例為1∶500，其余操作參考說明書進行。陽性染色結(jié)果判斷：陽性染色細胞率≤5% 為0 分，5%＜陽性染色細胞率≤25% 為1 分，25%＜陽性染色細胞率≤50%為2 分，50%＜陽性染色細胞率≤75%為3 分，陽性染色細胞率＞75%為4 分。染色程度評分：1 分為淡黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色。將陽性染色細胞率與染色程度的乘積作為最終染色結(jié)果評分，其中0 分為表達陰性，≥1 分為表達陽性，計算正常對照組和GDM 組產(chǎn)婦胎盤組織中HGF 陽性表達率。

1.4 細胞培養(yǎng)和HTR-8/Svneo-IR 模型建立及鑒定HTR-8/Svneo 細胞常規(guī)復(fù)蘇后用含10%FBS RPMI 1640 的常規(guī)培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的HTR-8/Svneo細胞，調(diào)整細胞密度至2.5×104mL－1，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，待細胞生長融合至80%～90%時，使用不含F(xiàn)BS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基饑餓細胞8 h 后進行實驗，并將細胞分為正常培養(yǎng)的滋養(yǎng)細胞組（HTR-8/Svneo 組） 和模型組（HTR-8/Svneo-IR組），每組設(shè)定5 個復(fù)孔。根據(jù)參考文獻［7］中的方法建立滋養(yǎng)細胞的IR 模型：在HTR-8/Svneo-IR組細胞不含F(xiàn)BS 的RPMI 1640 培 養(yǎng) 基 中 加 入1×107mmol·L－1的胰島素進行處理；而HTR-8/Svneo 組細胞僅應(yīng)用不含F(xiàn)BS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基的進行培養(yǎng)，并設(shè)置空白對照組（即不含細胞、FBS 及胰島素的RPMI 1640 培養(yǎng)基），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h 后，應(yīng)用葡萄糖-己糖激酶法葡萄糖檢測試劑盒，在酶標儀450 nm 波長處檢測培養(yǎng)液中葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量以鑒定HTR-8/Svneo-IR 模型。計算公式：葡萄糖消耗量=模型組（或正常對照組）細胞上清液葡萄糖含量—空白對照組上清液葡萄糖含量。

1.5 HTR-8/Svneo 細胞轉(zhuǎn)染和分組取處于對數(shù)生長期的HTR-8/Svneo 細胞，用0.25%含EDTA胰蛋白酶常規(guī)消化后，常規(guī)培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至6×105mL－1，取2 mL 細胞懸液接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，待第2天細胞貼壁生長并融合至50%～70%時，更換為Opti-MEM培養(yǎng)基并根據(jù)LipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染，將miR-508-3p inhibitor 或?qū)?yīng)的陰性對照序列（miR-NC） 轉(zhuǎn)染入HTR-8/Svneo-IR 細胞內(nèi)。細胞分組：正常對照組 （HTR-8/Svneo 組），即無任何處理的HTR-8/Svneo 細胞；IR 組（HTR-8/Svneo-IR 組），即方法“1.4”中建立的IR 細胞模型；miR-508-3p 抑制組（miR-508-3p-inhibitor-IR 組），即轉(zhuǎn)染了miR-508-3p inhibitor的HTR-8/Svneo-IR 細胞；miR-NC-IR 組，即轉(zhuǎn)染了miR-NC 的HTR-8/Svneo-IR 細胞。收集轉(zhuǎn)染48 h 后的細胞進行后續(xù)實驗。

1.6 實時定量PCR（RT-PCR）法檢測胎盤組織和HTR-8/Svneo 細胞中miR-508-3p 表達水平Trizol法提取胎盤組織及“1.5”中各組細胞中的總RNA，檢測RNA 濃度及純度后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。在按照RT-PCR 配置體系加樣后，依照試劑說明書與預(yù)實驗設(shè)定的溫度與時間將cDNA 在實時PCR 儀上進行定量。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性6 s，60 ℃退火，延伸35 s，40 個循環(huán)。引物序列：miR-508-3p，上游引物5′-ACACTCCAGCTGGGTA-3′，下游 引 物 5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；GAPDH，上 游 引 物 5′-GGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′，下 游 引 物 5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTAG-3′。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法 計 算 胎 盤 組 織 和HRT8/Svneo 細 胞 中miR-508-3p 表達水平。實驗重復(fù)3 次。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀾?yīng)用miRNA 靶基因在線數(shù)據(jù)庫Targetscan 對miR-508-3p 目標靶基因進行預(yù)測，篩選HGF 進行實驗。取處于對數(shù)生長期的HTR-8/Svneo 細胞，調(diào)整細胞密度至3×105個/孔，接種至6 孔細胞培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，將細胞分為pmirGLO-HGF-WT+miR-508-3p mimic組、pmirGLO-HGF-WT+miR-NC組、pmirGLO-HGF-MUT+miR-508-3p mimic 組 和pmirGLO-HGF-MUT+miR-NC 組，進行細胞共轉(zhuǎn)染，每組設(shè)5 個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h 后，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書進行操作，檢測HGF 啟動子的熒光強度，即為細胞中熒光素酶活性。

1.8 免疫印跡法檢測胎盤組織和HTR-8/Svneo 細胞中HGF、p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達水平將于液氮中碾碎的胎盤組織或各組HTR-8/Svneo 細胞置于冰上，加入RIPA 裂解液冰上裂解30 min，12 000 r·min－1、4 ℃離心15 min后取上清液，BCA法進行蛋白定量，按1∶4 比例向上清液中加入5×蛋白上樣緩沖液，并于沸水中加熱變性10 min。SDS分離膠及濃縮膠配置完成后，加入30 μg 蛋白樣品及3 μL 蛋白Marker 進行聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE） 電泳以分離蛋白條帶。待電泳結(jié)束后，300 mA 電流90 min 進行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h 后，TBST 洗膜3 次，每次5 min。加入稀釋后的一抗HGF（1∶800）、p-PI3K（1∶500）、p-AKT（1∶500）和β-actin（1∶2 000），4 ℃搖床孵育過夜。次日TBST 溶液清洗3 次，每次5 min，置于HRP 標記的山羊抗鼠二抗（1∶5 000） 室溫振蕩1 h，再次TBST 溶液清洗3 次，每次5 min。最后均勻滴加ECL 發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照。Image J 軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin 條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。實驗重復(fù)3 次。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析及繪制相關(guān)圖表。2 組孕產(chǎn)婦年齡、孕周、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、新生兒體質(zhì)量和胎盤質(zhì)量，胎盤組織中miR-508-3p 表達水平和HGF 蛋白表達水平，滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量，各組細 胞 中 miR-508-3p、 HGF、 p-PI3K 和p-AKT蛋白表達水平，經(jīng)正態(tài)性檢驗均符合正態(tài)分布，均以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；2 組產(chǎn)婦胎盤組織中HGF 陽性表達率比較采用χ2檢驗；GDM 患者胎盤組織中miR-508-3p 表達水平與HGF蛋白表達水平相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常對照組和GDM組孕產(chǎn)婦一般資料與正常對照組比較，GDM 組產(chǎn)婦年齡、孕周和BMI差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而新生兒體質(zhì)量和胎盤質(zhì)量均明顯增加（P＜0.05）。見表1。

2.2 2 組產(chǎn)婦胎盤組織中miR-508-3p 表達水平與正常對照組（1.21±0.54）比較，GDM 組產(chǎn)婦胎盤組織中miR-508-3p 表達水平（3.69±0.41）明顯升高（P＜0.05）。

表1 正常對照組和GDM 組孕產(chǎn)婦一般資料Tab. 1 General informations of pregnant women in normal control group and GDM group

表1 正常對照組和GDM 組孕產(chǎn)婦一般資料Tab. 1 General informations of pregnant women in normal control group and GDM group

*P＜0.05 vs normal control group.

Group Placental weight(m/g)550±223 569±287*Age(year)Gestational week Normal control GDM 30.55±2.98 30.17±3.80 37.17±3.13 37.63±2.52 BMI(kg·m－2)21.13±3.31 22.47±2.43 Birthweight(m/kg)3.42±0.36 3.71±0.59*

2.3 2 組產(chǎn)婦胎盤組織中HGF 蛋白表達水平及其與miR-508-3p 表達水平的相關(guān)性免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：HGF 多表達于胎盤組織的滋養(yǎng)細胞胞質(zhì)中，與正常對照組（85.7%）比較，GDM組產(chǎn)婦胎盤組織中HGF 陽性表達率（44.1%）明顯降低（P＜0.05）（圖1）。免疫印跡法檢測結(jié)果：GDM 組產(chǎn)婦胎盤組織中HGF 蛋白表達水平（0.23±0.06）明顯低于正常對照組（0.84±0.09）（P＜0.05）（圖2）。Pearson 相關(guān)性分析顯示：15 例GDM 組產(chǎn)婦胎盤組織中HGF 蛋白表達水平與 miR-508-3p 表達水平呈負相關(guān)關(guān)系（r=－0.542，P＜0.05）（圖3）。

圖1 正常對照組（A）和GDM 組（B）產(chǎn)婦胎盤組織中HGF 陽性表達（免疫組織化學(xué)，×400）Fig. 1 Positive expressions of HGF in maternal placental tissue in normal control group(A) and GDM group(B)(Immunohistochemistry,×400)

圖2 免疫印跡法檢測2 組產(chǎn)婦胎盤組織中HGF 蛋白表達電泳圖Fig. 2 Electrophoregram of expressions of HGF protein in maternal placental tissue in two groups detected by Western blotting method

圖3 GDM 組產(chǎn)婦胎盤組織中HGF 蛋白表達水平與miR-508-3p 表達水平的相關(guān)性Fig. 3 Relationship between HGF protein expression level and miR-508-3p expression level in placenta tissue of pregnant women in GDM group

2.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測HTR-8/Svneo細 胞 中 miR-508-3p 與 HGF 的 靶 向 關(guān) 系TargetScan 預(yù) 測 結(jié) 果 顯 示： HGF mRNA 的3′-UTR 與miR-508-3p 具有結(jié)合位點（圖4A）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示： pmirGLOHGF-WT+miR-508-3p mimic 組細胞熒光素酶活性明 顯 低 于pmirGLO-HGF-WT+miR-NC 組（P＜0.05），而pmirGLO-HGF-MUT+miR-508-3p mimic組與pmirGLO-HGF-MUT+miR-NC 組細胞熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖4B）。

圖4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炛懈鹘MHTR-8/Svneo細胞中熒光素酶活性Fig. 4 Luciferase activities in HTR-8/Svneo cells in various groups in double-luciferase reporter gene assay

2.5 HTR-8/Svneo-IR 模型鑒定1×107mol·L－1胰島素處理HTR-8/SVneo 36 h后，HTR-8/SVneo-IR組細胞葡萄糖消耗量［（1.96±0.31）mmol·L－1］與HTR-8/SVneo 組［（5.73±0.42） mmol·L－1］比較明顯降低（P＜0.01），提示HTR-8/Svneo-IR模型成功建立。

2.6 各組細胞中miR-508-3p 表達水平與HTR-8/Svneo 組 比 較，HTR-8/Svneo-IR 組 和miR-NC-IR 組細胞中miR-508-3p 表達水平明顯升 高（P＜0.05），miR-508-3p-inhibitor-IR 組細胞中miR-508-3p 表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與HTR-8/Svneo-IR 組 比 較，miR-508-3pinhibitor-IR 組細胞中miR-508-3p 表達水平明顯降低（P＜0.05），miR-NC-IR 組細胞中miR-508-3p 表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組細胞中miR-508-3p 表達水平Fig.5 Expression levels of miR-508-3p in cells in various groups

2.7 各組細胞中HGF、p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達水平與HTR-8/Svneo 組比較，HTR-8/Svneo-IR組和miR-NC-IR 組細胞中HGF、p-PI3K 和p-AKT蛋白水平表達明顯降低（P＜0.05），miR-508-3pinhibitor-IR 組細胞中HGF、p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與HTR-8/Svneo-IR 組比較，miR-508-3p-inhibitor-IR組細胞中HGF、p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），miR-NC-IR 組細胞中上述蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見 圖6 和表2。

圖6 各組細胞中HGF、p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達電泳圖Fig. 6 Electrophoregram of HGF, p-PI3K, and p-AKT proteins in cells in various groups

3 討 論

GDM 是妊娠期常見并發(fā)癥，嚴重影響母嬰健康。GDM 除可造成巨大兒、胎兒發(fā)育異常、新生兒低血糖和妊娠期高血壓等不良妊娠結(jié)局外，GDM 患者及其子代發(fā)生代謝性疾病的遠期風險也明顯增加［8］。迄今為止，GDM 的發(fā)病機制尚存在爭議，但國內(nèi)外多數(shù)學(xué)者認為IR 是GDM 發(fā)生的主要病理生理機制。IR 是指在機體內(nèi)，胰島素作用的靶器官或組織對其生物學(xué)效應(yīng)的敏感性出現(xiàn)降低或者喪失的一種狀態(tài)，主要表現(xiàn)為體內(nèi)胰島素介導(dǎo)的葡萄糖利用率降低［9］。因此，積極尋找IR 相關(guān)治療靶點，對于全面認識GDM 的發(fā)病機制和更好地改善臨床治療及預(yù)后均具有十分重要的意義。

表2 各組細胞中HGF、p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of HGF, p-PI3K, and p-AKT proteins in cells in various groups

表2 各組細胞中HGF、p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達水平Tab.2 Expression levels of HGF, p-PI3K, and p-AKT proteins in cells in various groups

*P＜0.05 vs HTR-8/Svneo group；ΔP＜0.05 vs HTR-8/Svneo-IR group.

Group HTR-8/Svneo HTR-8/Svneo-IR miR-NC-IR miR-508-3p-inhibitor-IR HGF 0.54±0.11 0.21±0.02*0.19±0.05*0.81±0.07Δ p-PI3K 0.34±0.09 0.11±0.02*0.09±0.01*0.77±0.10Δ p-AKT 0.13±0.01 0.06±0.02*0.04±0.01*0.51±0.04Δ

miRNA 是一類小非編碼RNA，占基因組1%的miRNA 可參與調(diào)控近30%的生物學(xué)活動［10-11］。在GDM 患者胎盤組織中有多種miRNA 存在差異性表達，miR-508-3p 是其中之一。LI 等［3］分別對15 例GDM 患者和正常健康產(chǎn)婦的胎盤組織進行miRNA 表達譜進行芯片分析后結(jié)果顯示：miR-508-3p 在GDM 患者胎盤組織中表達水平明顯升高。進一步體外實驗［3］結(jié)果顯示：miR-508-3p 可能通過表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）/PI3K/AKT 信號通路調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細胞功能，參與GDM 的發(fā)生發(fā)展。

HGF 是在1986 年首次從大鼠血漿和血小板中分離純化得到的一種多功能生長因子，既往研究［12］顯示：HGF 主要由成纖維細胞及其他基質(zhì)細胞分泌合成，并通過與其受體—間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子 （c-mesenchymal-epithelia transition，c-MET）相互作用，在多種疾病中發(fā)揮重要作用。近年來研究［13-14］表明：HGF 在胎盤組織中表達豐富，其主要由胎盤絨毛間質(zhì)細胞分泌，通過旁分泌的形式與滋養(yǎng)細胞及絨毛血管內(nèi)皮細胞表面的HGF 受體相結(jié)合進行調(diào)控。UEHARA 等［15］報道：特異性敲除HGF 基因的小鼠在妊娠后，胎盤組織中的正常形態(tài)滋養(yǎng)細胞的數(shù)量明顯下降，進而影響胎盤組織的正常功能，最終導(dǎo)致胚胎生長受限甚至胎死宮內(nèi)，提示HGF 對滋養(yǎng)細胞功能、胎盤形成及妊娠的維持具有十分重要的作用。國內(nèi)多數(shù)學(xué)者研究［16-17］證實：HGF 在GDM 患者胎盤組織中的表達較正常妊娠產(chǎn)婦明顯降低，推測其可能參與GDM 的發(fā)生發(fā)展。HGF 是IR 病理生理過程中的關(guān)鍵作用蛋白，參與多種胰島素敏感細胞類型的葡萄糖轉(zhuǎn)運及代謝途徑。在小鼠胰腺β 細胞中過表達HGF 能明顯促進葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2 （glucose transporter-2，GLUT-2） 及葡萄糖激酶的表達，進而促進β 細胞對葡萄糖的攝取和利用［18］；敲除HGF 在成年小鼠體內(nèi)表達，能夠?qū)е滦∈笃咸烟悄土渴軗p并降低胰島素的敏感性［19］。上述研究結(jié)果提示：HGF 在IR 中起關(guān)鍵作用。滋養(yǎng)細胞作為胎盤組織中的主要功能細胞，有研究［20］證實：在GDM 患者中滋養(yǎng)細胞對胰島素的敏感性明顯降低，即出現(xiàn)IR 現(xiàn)象。PI3K 是一種細胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，當細胞受到生長因子、血管內(nèi)皮因子和胰島素等刺激后，可發(fā)生磷酸化而激活，而活化的PI3K可誘導(dǎo)下游的AKT 蛋白與細胞膜表面相應(yīng)受體進行結(jié)合，并使AKT 發(fā)生磷酸化，隨后使其從細胞膜釋放進入細胞質(zhì)內(nèi)傳遞信號。研究［21-23］證實：胰島素主要通過PI3K/AKT 信號通路進行代謝，與葡萄糖轉(zhuǎn)運及IR 等多種活動有密切關(guān)聯(lián)。

本研究結(jié)果顯示：GDM 組患者胎盤組織中miR-508-3p 表達水平明顯高于正常對照組，而HGF 在胎盤中的表達水平與之相反，即HGF 在GDM 患者胎盤組織中的表達較對照組明顯降低；進一步通過相關(guān)性分析顯示：兩者在胎盤組織中的表達水平呈負相關(guān)關(guān)系，結(jié)合本課題組前期利用生物 信 息 學(xué) 技 術(shù) 分 析 結(jié) 果（HGF 的3′UTR 存 在miR-508-3p 的結(jié)合位點），在GDM 中miR-508-3p可能參與調(diào)控HGF 的表達，且兩者均參與GDM的發(fā)生發(fā)展過程。本研究體外實驗結(jié)果顯示：通過人滋養(yǎng)細胞系HTR-8/Sneo 驗證了miR-508-3p 對HGF 具有靶向調(diào)控作用。本研究成功建立HTR-8/Sneo-IR 模型，采用脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)對其進行miR-508-3p-inhibitor 轉(zhuǎn) 染，RT-PCR 檢 測 結(jié) 果 顯示：HTR-8/Sneo-IR 模型細胞中miR-508-3p 表達水平明顯升高，而轉(zhuǎn)染miR-508-3p inhibitor 后其表達水平明顯降低；利用免疫印跡法檢測上述細胞中PI3K/AKT 信號通路相關(guān)蛋白的表達情況，HTR-8/Sneo-IR 細胞中p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達水平均明顯降低，而miR-508-3p-inhibitor-IR 組細胞中p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達水平下調(diào)趨勢被明顯削弱。

綜上所述，GDM 患者胎盤組織中miR-508-3p表達水平明顯升高，其能夠靶向抑制HGF 表達水平，進而通過PI3K/AKT 信號通路促進滋養(yǎng)細胞的IR，參與GDM 的發(fā)生發(fā)展過程。本研究結(jié)果可為探究miR-508-3p 在GDM 中的作用提供新的理論依據(jù)，然而上述機制僅為miR-508-3p 的一個作用方面，關(guān)于其在GDM 中的其他作用機制仍有待進一步研究。