多配體蛋白聚糖1 對舌鱗狀細胞癌CAL27 細胞遷移、侵襲和細胞周期的調控作用

劉 璐, 張?zhí)旆? 王曉峰, 孔晨飛

（1. 吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院口腔科, 吉林 長春 130033；2. 吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院科研中心, 吉林 長春 130033）

研究［1-2］顯示：口腔癌作為頭頸部好發(fā)腫瘤，2018 年全球統(tǒng)計共有約354 864 例新發(fā)病例和177 384 例死亡病例。病例呈聚集性分布，其中以美拉尼西亞、中南亞和東亞發(fā)病率最高。在口腔惡性腫瘤亞型中，90% 為口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma ，OSCC）［3］。盡管現(xiàn)代化治療方法不斷更新，但在過去十年中OSCC 患者術后復發(fā)率并未出現(xiàn)降低趨勢，5 年存活率也無明顯提高。舌鱗狀細胞癌作為口腔癌中占比高達41%的腫瘤，其侵襲性不容忽視［4］，局部復發(fā)和第二原發(fā)腫瘤的發(fā)生和轉移是其不良預后的主要原因［5］。因此，舌鱗狀細胞癌的早期診斷、病情監(jiān)控和預后判斷是其治療的關鍵。

多配體蛋白聚糖1（syndecan-1，SDC1）屬于Ⅰ型跨膜硫酸肝素類蛋白聚糖，是重要的細胞表面黏附分子，可調節(jié)細胞和細胞外基質黏附和細胞遷移，同時也參與腫瘤細胞的增殖和轉移［6］。大量研究［7-10］表明：頭頸癌、胰腺癌、乳腺癌和結直腸癌中均出現(xiàn)SDC1 的表達失調。浸潤性OSCC 組織中SDC1 表達水平明顯降低是導致腫瘤進展的關鍵，但口腔上皮異常增生和OSCC 組織中SDC1 表達水平降低與OSCC 患者臨床轉歸并無密切關聯(lián)［11］。同時，SDC1 表達也與唇鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展有關聯(lián)［11］。目前，SDC1 在舌鱗狀細胞癌中的調控作用及其機制尚不明確。本研究利用前期實驗中成功構建的SDC1 重組過表達載體穩(wěn)定轉染CAL27 細胞，探討SDC1 與CAL27 細胞遷移、侵襲和細胞周期的關系，以期為OSCC 的臨床干預治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人舌鱗狀細胞癌CAL27 細胞（美國ATCC 細胞庫）。DMEM 培養(yǎng)基（美國Corning 公司），青霉素、鏈霉素和胎牛血清（美國Gibco 公司），抗Syndecan-1 抗體（英國Abcam 公司），抗β-actin 抗體［美國Proteintech（中國）公司）］，RIPA 裂解液和活性氧（reactive oxygen species ，ROS）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），Matrigel 基質膠（美國BD 公司），碘化丙啶（propidium iodide，PI） 和RNase（美國Sigma 公司）。Odyssey 紅外成像系統(tǒng)（美國Licor Odyssey 公 司），Transwell 小 室 （美 國Corning 公司），流式細胞儀（FC 500MCL，美國Beckman 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)和分組前期實驗中成功構建的穩(wěn)定高表達ptt5-SDC1 的人舌鱗狀細胞癌CAL27 細胞作為實驗組，穩(wěn)定轉染ptt5 空載體的CAL27 細胞作為對照組。將細胞置于含有10%胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Western blotting 法檢測細胞中SDC1 蛋白表達水平收集2 組細胞，RIPA 裂解液處理得到蛋白裂解物，通過SDS-PAGE 分離，轉移到PVDF膜 上，在4℃條 件 下，SDC1 和β -actin 抗 體（1 ∶1 000 稀 釋） 孵 育 過 夜，TBST 洗 滌，Odyssey 紅外成像系統(tǒng)掃描結果。使用Image J 軟件進行灰度分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin 蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。

1.4 細胞劃痕實驗檢測細胞劃痕愈合率收集細胞，分別以5×105/孔密度接種至6 孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，細胞貼壁生長匯合率接近100%時，用20 μL 槍頭在6 孔細胞培養(yǎng)板底部畫一條直線，寬度保持一致，PBS 緩沖液沖洗3 次，以去除漂浮細胞，每孔加入無血清培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0、12 和24 h 在顯微鏡下觀察，采用Image J 軟件對劃痕愈合面積進行分析，計算12 和24 h 細胞劃痕愈合率。劃痕愈合率=（0 h 劃痕寬度—12 h 或24 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%。

1.5 Transwell 小室實驗檢測遷移和侵襲細胞數(shù)①細胞遷移實驗：將細胞按5×105個/孔接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 至細胞完全貼壁。PBS 緩沖液沖洗3 次后用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。消化細胞，將2.5×104的細胞懸液加入Transwell上室，下室加入750 μL 含10% FBS 的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。取出小室，吸去上室培養(yǎng)基，PBS 緩沖液洗滌，棉簽拭去上室細胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，干燥，0.1% 結晶紫染色10 min，PBS 緩沖液洗滌，靜置晾干，于顯微鏡下隨機選取視野，拍照計數(shù)遷移細胞數(shù)。②細胞侵襲實驗：預先用無血清DMEM 培養(yǎng)基按4∶1 比例稀釋Matrigel 基質膠，包被Transwell 小室底膜，并呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)，其余步驟同細胞遷移實驗。

1.6 流式細胞術檢測不同細胞周期CAL27 細胞百分率將細胞按5×105個/孔密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 至細胞完全貼壁。預冷PBS緩沖液沖洗3 次，胰酶消化貼壁細胞并收集，離心后PBS 緩沖液中洗2 次，加入預冷70%乙醇，固定30 min。PBS 緩沖液沖洗2 次，加入PI（RNase）溶液，緩慢充分重懸細胞沉淀，4℃避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測不同細胞周期細胞百分率。

1.7 流式細胞術檢測細胞中ROS 水平收集細胞，無血清培養(yǎng)液1∶1 000 稀釋2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA），將細胞懸浮于稀釋后的DCFH-DA 中，37 ℃、5% CO2培 養(yǎng) 箱 中 孵 育20 min。每5 min 顛倒混勻細胞液，使細胞充分接觸探針。無血清培養(yǎng)液洗滌細胞3 次，去除未進入細胞內的DCFH-DA。流式細胞儀檢測細胞熒光強度，并以強熒光強度細胞百分率表示細胞中ROS水平。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。細胞中SDC1 蛋白表達水平、細胞劃痕愈合率、遷移和侵襲細胞數(shù)、不同細胞周期細胞百分率及細胞中ROS 水平，均以表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SDC1 過表達細胞系的驗證Western blotting法檢測實驗組過表達ptt5-SDC1 的人舌鱗狀細胞癌CAL27 細胞中SDC1 蛋白表達水平，結果顯示：與對照組比較，實驗組細胞中SDC1 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 2 組CAL27 細胞中SDC1 蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B)Fig. 1 Electrophoregram (A) and histogram(B) of SDC1 protein in CAL27 cells in two groups

2.2 2 組CAL27 細胞劃痕愈合率對照組12 和24 h 細胞劃痕愈合率分別為20.88%±9.88%和58.24%±11.05%，實驗組12 和24 h 細胞劃痕愈合率分別為8.79%±2.87%和27.58%±6.19%。與對照組比較，實驗組12 和24 h 細胞劃痕 愈 合 率 明 顯 降 低（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖2。

2.3 2 組CAL27 細胞中遷移和侵襲細胞數(shù)與對照組（299.00±73.51）比較，實驗組CAL27 細胞中遷移細胞數(shù) （96.67±20.82） 明顯減少（P＜0.01）。與對照組（35.33±9.07） 比較，實驗組CAL27 細胞中侵襲細胞數(shù)（22.33±9.29）明顯減少（P＜0.05）。見圖3。

圖2 2 組CAL27 細胞劃痕愈合實驗結果(×200)Fig.2 Results of cell scratch healing test of CA127 cells in two groups(×200)

圖3 Transwell 小室實驗檢測2 組CAL27 細胞中遷移（A，B）和侵襲（C，D）情況(×200)Fig.3 Migration(A,B)and invasion(C,D)of CAL27 cells in two groups detected with Transwell chamber assay(×200)

2.4 2 組不同細胞周期CAL27 細胞百分率與對照組比較，實驗組G0/G1期CAL27 細胞百分率明顯升高（P＜0.05），S 期CAL27 細胞百分率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），G2/M 期CAL27 細胞百分率明顯降低（P＜0.05）。見表1 和圖4。

2.5 2 組CAL27 細胞中ROS 水平與對照組（57.8%±8.51%） 比較，實 驗 組CAL27 細 胞中 ROS 水 平 （93.5%±2.70%） 明 顯 升 高（P＜0.05）。

表1 2 組不同細胞周期CAL27 細胞百分率Tab.1 Percentages of CAL27 cells in different cell cycles in two groups

圖4 流式細胞術檢測2 組不同細胞周期CAL27 細胞百分率Fig.4 Percentages of CAL27 cells in different cell cycles in two groups detected by flow cytometry

3 討 論

口腔癌在世界常見的惡性腫瘤中位于第11 位，雖然全球口腔癌發(fā)病率略有下降，但舌癌的發(fā)病率卻逐漸升高。在最近10 年中，口腔癌年輕患者（尤其是舌癌患者）所占百分率有所增加［12］，且目前常規(guī)治療策略（外科手術切除為主，放化療為輔）未能明顯提高其生存率。不僅如此，在經(jīng)過治療后，患者還須面對嚴重的不良反應，其中包括面部美觀、口腔功能及放療后全身狀況的改變［13］。因此，深入探究舌鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的相關機制，可以為其早期診斷、早期治療和病情監(jiān)測提供有效方案。

細胞表面黏附受體SDC1 是上皮細胞基底外側表面上的跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，參與細胞增殖、遷移和細胞外基質的相互作用［14］。在浸潤性皮膚癌、結腸癌和前列腺癌中，SDC1 的表達水平明顯降低［15-16］。本課題組在前期研究［17］中發(fā)現(xiàn)：SDC1 敲低后的舌鱗狀細胞癌CAL27 細胞具有更加明顯的遷移和侵襲特性，而SDC1 過表達可誘導CAL27 細胞凋亡，敲除SDC1 則未表現(xiàn)出明顯的細胞凋亡，由此推斷，SDC1 可能參與了舌鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展過程。

本研究中劃痕實驗和Transwell 小室實驗結果顯示：過表達SDC1 使CAL27 細胞的遷移和侵襲能力明顯減弱，推測SDC1 與口腔鱗狀細胞癌的轉移和侵襲呈負相關關系。AHMED 等［18］研究顯示：OSCC 組織的浸潤前沿，細胞膜SDC1 表達降低，且癌細胞中SDC1 的表達也與腫瘤浸潤深度呈負相關關系?？谇话┘毎慕櫤娃D移擴散被認為與SDC1 表達下調有關，其機制在于細胞膜SDC1的丟失會減少上皮細胞的黏附，使其與細胞外基質的連接松弛，細胞間凝聚力降低，從而促進腫瘤細胞的遷移和侵襲［19］。同時，本研究結果顯示：SDC1 過表達后，CAL27 細胞分裂間期受到阻滯，在G0/G1期DNA 合成和復制相對減少，細胞在這一階段受到損傷，可觸發(fā)細胞內一系列修復反應，但G2期（分裂期） CAL27 細胞百分率明顯降低，則說明其修復機制未能完成，最終導致細胞死亡。細胞周期蛋白（Cyclin）和細胞周期蛋白依賴激酶（cyclin dependent kinase，CDK） 被認為是細胞周期調控的關鍵，Cyclin D 和CDK4/6 在細胞分裂間期即G0/G1期中發(fā)揮重要作用［20］，與食道癌、乳腺癌、肺癌和膀胱癌等的發(fā)生關系密切［21-24］。Cyclin D與CDK 4/6 結合，通過磷酸化抑癌蛋白RB 及激活釋放轉錄因子E2F1 進而促進細胞由G0/G1期進入S 期［25-26］。由此可以推測，SDC1 與舌鱗狀細胞癌細胞中Cyclin D 和CDK4/6 的調節(jié)存在關聯(lián)，但尚未明確其抑制細胞周期所涉及的機制，這也將成為接下來的研究重點。細胞死亡不僅可以通過阻滯細胞周期，也可以通過誘導細胞凋亡的方式，細胞中ROS 水平升高被認為是誘導細胞凋亡的途徑之一［27-29］。本研究中，SDC1 過表達的CAL27 細胞產(chǎn)生的ROS 量明顯增加。ROS 是一組高活性氧自由基及其衍生物［30］，其介導的主要凋亡途徑分為外部途徑（細胞表面死亡受體） 和內部途徑（線粒體）［31］。外部途徑中，ROS 在轉錄后對細胞型含死亡域的Fas 結合蛋白樣細胞白介素1β 轉換酶抑制蛋白 （cellular FADD-like interleukin-1β converting enzyme inhibitory protein，c-FLIP） 產(chǎn) 生 負 調 控，從而促進細胞凋亡［32］。在內部途徑中，升高的ROS 可降低線粒體膜電位，改變線粒體通透性，導致Cyt-C 和其他促凋亡分子釋放到細胞質中，繼而含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，caspase-3）級聯(lián)反應和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly ADP-ribose polymerase，PARP） 被激活，產(chǎn)生細胞凋亡［30］。線粒體作為ROS 產(chǎn)生的主要來源，被認為在介導細胞凋亡中起到更重要的作用［33］。也有研究［34］結果顯示：腫瘤細胞通過線粒體途徑發(fā)生凋亡，與ROS 的產(chǎn)生無關。此外，靶向治療可能會觸發(fā)細胞產(chǎn)生ROS，從而降低膜電位觸發(fā)線粒體介導的細胞凋亡，也可能通過ROS 獨立介導的線粒體途徑誘導凋亡［31］?？谇击[狀細胞癌中SDC1 與線粒體誘導的細胞凋亡存在何種關聯(lián)，目前尚無報道，ROS 在細胞凋亡的內外途徑中所起的作用有待進一步深入探討。

綜上所述，SDC1 過表達能夠抑制舌鱗狀細胞癌CAL27 細胞的侵襲和轉移，阻滯CAL27 細胞周期于G0/G1期，同時增加細胞中ROS 水平。本研究結果為靶向SDC1 治療口腔鱗狀癌提供了依據(jù)，同時為闡明SDC1 在口腔鱗狀細胞癌中的調控機制奠定了基礎。