忍冬鑒別研究進展

李萌萌 ，王 倩 ，孟 露 ，李佳欣 ，張雅秀 ，張 勇 ，常 明

（1.河北科技大學(xué) 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.石家莊學(xué)院 化工學(xué)院，河北 石家莊 050035）

0 引言

忍冬始載于《名醫(yī)別錄》，《新修本草》和《證類本草》等古籍均有收錄[1]. 忍冬是我國常用的中草藥，其藥用價值高、用途廣泛，是清熱解毒主流的大宗藥材[2]. 忍冬在中國大部分地區(qū)多有分布，不少地區(qū)已栽培生產(chǎn)，其中以河南、山東所產(chǎn)最為聞名. 我國忍冬屬植物共98 種，有藥用價值的僅有14 種. 由于忍冬屬植株外形相似，對其中藥用忍冬的鑒別僅靠形態(tài)進行甄別難以操作和實施. 對無藥用功能的忍冬進行準確的鑒別，避免臨床誤用是一個挑戰(zhàn). 近年來，儀器分析方法對忍冬進行鑒別的報道屢見不鮮.

近代研究表明其花（金銀花）、藤（忍冬藤）、忍冬葉均具有抗病毒、抗炎、抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保肝利膽、抗腫瘤、降糖降脂等藥理作用. 在2005 版《中國藥典》之前，金銀花和山銀花作為同一種藥材收載，從2005 版《中國藥典》開始，正式將金銀花和山銀花進行區(qū)分，兩者并非同種藥材. 金銀花因其含有的活性成分對病毒活性、炎癥因子有抑制作用以及對機體淋巴細胞增殖有促進作用，被廣泛應(yīng)用在臨床抗病毒方面. 其中一些抗流感病毒的中成藥中也含有金銀花，如連花清瘟膠囊、金銀花口服液、雙黃連口服液等. 而且由于近幾年臨床對金銀花需求量劇增，忍冬屬其他產(chǎn)品魚龍混雜，干擾了臨床使用，因此對忍冬屬植物進行鑒別研究困擾著中藥行業(yè)工作者及廣大消費者. 本研究對金銀花、忍冬葉及藤常用鑒別方法進行歸納總結(jié)，以期為我國忍冬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供有意義的科學(xué)借鑒.

1 忍冬的鑒別

1.1 金銀花的鑒別

1.1.1 薄層色譜法對金銀花的鑒別研究

陳永林等[3]采用薄層色譜（TLC）法開展了對金銀花及兩種混偽品（金銀木的花和瑞香科芫花的花）的鑒別研究工作. 其中TLC 法展開劑的條件是VCH3COOC2H5∶VCH3COOH=4∶1. 結(jié)果顯示，金銀木花與忍冬花有兩處斑點的顏色和比移值（Rf）不同，在Rf值0.13 處增加了一個淡藍色斑點，在0.88 處有一個紅色斑點，易于區(qū)分兩者. 芫花與忍冬花差異顯著，更容易鑒別.

王立偉等[4]采用TLC 法對金銀花中摻偽山銀花進行快速鑒別，通過試驗建立了金銀花和山銀花的TLC色譜方法，得出山銀花和金銀花的薄層色譜斑點有差異性，該方法可用于快速鑒別金銀花與山銀花.

丁野等[5]采用TLC 法對忍冬和灰氈毛忍冬進行了鑒別. 其中，TLC 法的展開劑條件為：VCCl3H∶VCH3OH∶VH2O=6∶4∶1，將灰氈毛忍冬皂苷乙作為對照品，結(jié)果顯示，忍冬供試品與對照品相比，兩者在相同位置上未顯示相同斑點，但灰氈毛忍冬供試品與對照品相比，相同位置上則顯示出相同顏色的斑點. 由此看來，該方法可用于忍冬和灰氈毛忍冬的鑒別.

采用TLC 法鑒別金銀花具有簡便、檢測速度快、成本低的優(yōu)點，是目前金銀花鑒別的常見方法，但此方法主要依靠人工視覺觀察TLC 的斑點及相關(guān)Rf值，因此結(jié)果誤差較大，通常只適合于金銀花的一般鑒別.

1.1.2 高效液相色譜法對于金銀花的鑒別研究

王浩兵等[6]建立了超高效液相色譜（UHPLC）法對金銀花和山銀花定性及定量測定方法. 以木犀草苷，異綠原酸A、B、C，新綠原酸，隱綠原酸，灰氈毛忍冬皂苷乙作為對照品，以不同產(chǎn)地的金銀花和山銀花為供試品進行測定. 結(jié)果顯示，該方法中各成分線性良好，回收率為98.71%～100.85%，相對標(biāo)準偏差（RSD）為0.53%～1.87%. 灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙只能在山銀花中被檢出，而在金銀花中未檢出. 故通過此方法可將金銀花和山銀花區(qū)分開來.

向增旭等[7]采用高效液相色譜（HPLC）法開展了道地金銀花和非道地金銀花的鑒別研究工作. 其中以金銀花為對照品，以道地和非道地金銀花藥材為供試品進行測定. 結(jié)果顯示，產(chǎn)區(qū)為山東和河南的道地金銀花共有18 個峰，藥材的相似度均在0.95 以上，而非道地金銀花共有9 個峰，且藥材的相似度均小于0.90. 因此通過此方法可以區(qū)分道地和非道地的金銀花.

UHPLC/HPLC 法可以同時對多組分進行定性、定量分析，具有快速、靈敏、準確的特點，UHPLC/HPLC 法不僅在定量，而且在定性方面優(yōu)于TLC 法，同時為金銀花精確的質(zhì)量控制提供了科學(xué)方法.

1.1.3 中紅外光譜法對金銀花的鑒別研究

張芳等[8]采用三級中紅外（MIR）光譜法對不同種質(zhì)忍冬花蕾進行分析鑒定. 其中不同種質(zhì)忍冬包括：大雞爪、紅雞爪、紅梗子、小毛花、大毛花和九豐1 號. 實驗發(fā)現(xiàn)：一維MIR 光譜上不同種質(zhì)間相似度較大，其紅外吸收模式包括：νOH-忍冬花蕾、νas-CH2-忍冬花蕾、νs-CH2-忍冬花蕾、νC=O-忍冬花蕾、νC=C-忍冬花蕾和 νC-O-忍冬花蕾；不同種質(zhì)忍冬花蕾的二階導(dǎo)數(shù)MIR 及二維MIR 光譜差異明顯.

楊春艷等[9]基于MIR 光譜技術(shù)對金銀花的品種和產(chǎn)地進行鑒別研究，采集并測試了5 個產(chǎn)地的9 個品種（北花一號/山西黎城、大毛花/河南封丘、大毛花/山東平邑、雞爪花/河南封丘、雞爪花/河南原陽、九豐1 號/河南封丘、九豐1 號/山東平邑、四季花/山東平邑、四季花/河南封丘、小草花/山東廣饒、小毛花/河南原陽、豫封1 號/河南封丘、豫封1 號/河南原陽、淮蜜花/山東平邑和淮蜜花/河南原陽）的150 份金銀花樣本的MIR 光譜，并計算了樣品的一階導(dǎo)數(shù)MIR 光譜和二階導(dǎo)數(shù)MIR 光譜. 研究發(fā)現(xiàn)：二階導(dǎo)數(shù)MIR 光譜數(shù)據(jù)為判別變量建立的模型鑒別效果相對較好，對金銀花的品種和產(chǎn)地的鑒別正確率依次達93.20%和96.13%.

MIR 光譜法鑒別金銀花具有快速、準確的優(yōu)點，是金銀花鑒別的常見方法.

1.1.4 近紅外光譜法對金銀花的鑒別研究

陳璐等[10]采用近紅外（NIR）光譜法開展了不同產(chǎn)地（河北省、河南省、重慶市和山東省）金銀花的鑒別研究工作. 利用偏最小二乘判別分析法建立判別模型. 采用二階導(dǎo)數(shù)和標(biāo)準正態(tài)變量預(yù)處理光譜，金銀花產(chǎn)地判別模型正確判別率可達100%.

劉征輝等[11]采用NIR 光譜法，在主成分分析的聚類基礎(chǔ)上通過相似分類法（SIMCA）模式識別原理對金銀花（大毛花和四季花）和山銀花（黃褐毛忍冬、紅腺忍冬、灰氈毛忍冬和華南忍冬）分別建立了類模型，并能夠正確識別. 其中，大毛花的產(chǎn)地包括：山東省平邑縣、山東省費縣、云南省尋甸縣、河北省滿城縣、河北省巨鹿縣、廣西省資源縣、廣東省韶關(guān)市、河南省封丘縣、浙江省永嘉縣；四季花的產(chǎn)地包括：山東省平邑縣；黃褐毛忍冬的產(chǎn)地包括：貴州省興義市；紅腺忍冬的產(chǎn)地包括：浙江省永嘉縣、福建省南平市、廣西省忻城縣、廣西省馬山縣；灰氈毛忍冬的產(chǎn)地包括：重慶市秀山縣、湖南省溆浦縣、湖南省隆回縣；華南忍冬的產(chǎn)地包括：廣東省韶關(guān)市.

NIR 光譜法需要建立龐大的數(shù)據(jù)庫及復(fù)雜的數(shù)學(xué)模型，無疑會影響其在金銀花鑒別領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用.

1.1.5 紫外光譜法對金銀花的鑒別研究

劉來正等[12]采用紫外（UV）光譜法，分別對無水乙醇、水、氯仿和石油醚4 種溶劑的山銀花（灰氈毛忍冬/湖南隆回金銀花科技開發(fā)公司出品）與華西忍冬（產(chǎn)地：山西）的浸出液進行紫外掃描，并測定其吸收峰的數(shù)目及對應(yīng)的頻率. 研究發(fā)現(xiàn)：山銀花與其偽品華西忍冬的UV 光譜線組圖像中最大吸收峰對應(yīng)的吸收頻率和其他吸收峰峰位值在水和石油醚中對應(yīng)的吸收頻率具有較大差異，而山銀花與其偽品華西忍冬在無水乙醇和氯仿中雖然最大吸收峰頻率相同，但其他峰對應(yīng)的吸收頻率有一些差異性.

劉濤等[13]采用紫外可見分光光度計法分別測定10 批金銀花藥材（產(chǎn)地分別為四川省、山東?。┡c10批山銀花藥材（產(chǎn)地分別為四川省、云南省、貴州省、江西省），建立了金銀花藥材的對照紫外-可見指紋圖譜，利用相關(guān)系數(shù)法計算10 批山銀花樣品與金銀花對照品指紋圖譜的相似度，研究發(fā)現(xiàn)：山銀花藥材圖譜與金銀花對照品指紋圖譜的相似度均在0.957 以上，表明金銀花藥材和山銀花藥材的內(nèi)在質(zhì)量有較高的相似性.

徐艷紅等[14]采用UV 光譜法對用50%甲醇處理過的金銀花和金銀忍冬進行紫外掃描，在波長為200～400 nm范圍內(nèi)測定其吸收光譜.結(jié)果表明：金銀花和金銀忍冬在波長為327 nm 左右都有吸收峰出現(xiàn)，該峰為綠原酸吸收峰，而金銀花在234.5 nm 和217.5 nm 處仍有吸收峰，兩者的吸收峰有不同之處，由此可以用此方法來鑒別金銀花和金銀忍冬.

UV 光譜法鑒別金銀花的相關(guān)方法的研究較少，其應(yīng)用廣泛性還需進一步研究.

1.1.6 毛細管電泳指紋圖譜法對金銀花的鑒別研究

孫國祥等[15]采用毛細管電泳指紋圖譜（CEFP）法將13 個不同產(chǎn)地的金銀花藥材（1 號河北省巨鹿縣、2號山東省臨沂市、3 號河南省新鄉(xiāng)市、4 號山東省平邑縣流峪鎮(zhèn)、5 號山東省費縣、6 號河南省商洛市、7 號陜西省寶雞市、8 號陜西省柞水縣、9 號貴州省黔西南州、10 號河南省封丘縣、11 號湖南省隆回縣、12 號新疆省新和縣、13 號市售）供試液的CEFP 進行比較. 研究發(fā)現(xiàn)金銀花的共有指紋峰為18 個.

CEFP 法是一類較為新型的中藥檢測鑒別方法，其具有成本低廉、分離效能高、較好重現(xiàn)性及精密度高的優(yōu)點.

1.1.7 DNA 分子標(biāo)記法對金銀花的鑒別研究

宋雯舒等[16]通過指標(biāo)成分含量測定及DNA 分子標(biāo)記技術(shù)對不同產(chǎn)地（河北省安國一方中藥材有限公司出品和山東省廣東廣弘藥材有限公司出品）金銀花樣品進行鑒別研究. 分別提取對照藥材及河北省和山東省產(chǎn)地金銀花樣品DNA，檢測DNA 濃度和純度，采用基于聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）方法的DNA 分子標(biāo)記技術(shù)鑒別樣品.

DNA 分子鑒定技術(shù)作為常規(guī)鑒別方法的補充，具有準確、重現(xiàn)性高等優(yōu)點，可用于金銀花的鑒定，但對測試儀器及實驗條件有較高的要求.

1.2 忍冬葉的鑒別

1.2.1 HPLC 法對忍冬葉的鑒別研究

童凱等[17]以4 類忍冬葉片（四季金銀花葉/四川省雅安市天全縣、灰氈毛忍冬葉/四川省雅安市天全縣、紅腺忍冬葉/四川省雅安市天全縣、“北花1 號”金銀花葉/四川省雅安市天全縣）為實驗材料，采用HPLC 法構(gòu)建金銀花葉的化學(xué)成分的指紋圖譜，從中提取了特征色譜峰，結(jié)合主成分分析、系統(tǒng)聚類分析等多變量統(tǒng)計分析方法，比較分析了4 種不同品種的金銀花葉的化學(xué)物質(zhì)群差異. 研究發(fā)現(xiàn)：相較于四季金銀花，“北花1號”品種與之具有最相似化學(xué)特征，依次為紅腺忍冬和灰氈毛忍冬.

管雪梅[18]以10 個不同產(chǎn)地忍冬葉為實驗材料，通過對色譜條件的篩選，最終確定以0.3%甲酸水溶液和乙腈為流動相，采用梯度洗脫方式的實驗條件. 研究發(fā)現(xiàn)：10 種忍冬葉的14 個共有峰的相對保留時間基本一致，指紋圖譜的相似度在0.9 以上，但是各色譜峰峰面積在不同樣品間有一定差異，不同樣品忍冬葉50%甲醇提取物中的化學(xué)成分含量具有明顯差異，該研究為忍冬葉的鑒定提供了參考依據(jù)，并建立了全方位的忍冬葉藥材的指紋圖譜.

1.2.2 TCL 法對于忍冬葉的鑒別研究

龍立慧等[19]采用 TLC 法對黔產(chǎn)忍冬葉進行鑒別. 綠原酸以 VCH3COOC2H5∶VCH3COCH3∶VHCOOH∶VH2O=7∶3∶1∶1.2 為展開系統(tǒng)，木犀草苷以 VCH3COOC4H9∶VHCOOH∶VH2O=7∶2.5∶2.5 上層溶液為展開系統(tǒng). 忍冬葉產(chǎn)地包括：P1 龍里縣、P2 安順市、P3 興義市、P4 貴陽市、P5 懷化市、P6 凱里市、P7 遵義市、P8 息峰縣、P9 畢節(jié)市、P10 銅仁市、P11 六盤水市、P12 都勻縣、P13 貞豐縣、P14 修文縣和 P15 織金縣.

1.2.3 電鏡法對忍冬葉的鑒別研究

黃麗華等[20]采用掃描電鏡對忍冬屬8 種不同產(chǎn)地的藥用植物葉（細氈毛忍冬葉/貴州省印江縣、凈花菰腺忍冬葉/貴州省獨山縣、忍冬葉/貴州省凱里市、金銀忍冬葉/貴州省遵義市、黃褐毛忍冬葉/貴州省興義市、紅腺忍冬葉/貴州省凱里市、短柄忍冬葉/貴州省綏陽縣以及異毛忍冬葉/貴州省嘉波縣）表面進行觀察. 研究發(fā)現(xiàn)忍冬屬8 種植物葉表面特征均有一定的差異.

1.2.4 顯微法對忍冬葉的鑒別研究

劉湘丹等[21]采用性狀鑒別和顯微鑒別的方法從葉片外部形態(tài)和內(nèi)部構(gòu)造進行對比研究. 研究發(fā)現(xiàn)：灰氈毛忍冬及其變異株（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園）與忍冬葉（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園）在內(nèi)部構(gòu)造（氣孔指數(shù)、毛茸等）和外部形態(tài)（葉大小、葉形）均有較大的差異.

耿世磊等[22]利用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察比較忍冬屬5 種植物（華南忍冬葉/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物研究中心、忍冬葉/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物研究中心、紅腺忍冬葉/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物研究中心、水忍冬葉/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物研究中心、大花忍冬葉/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物研究中心）的葉表皮特征.研究發(fā)現(xiàn)：在光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下該屬不同植物的葉表皮特征存在顯著差異.

郭慶梅等[23]通過采用直尺測量葉片的長度和寬度，在生物顯微鏡下計數(shù)不同農(nóng)家品種忍冬葉表面非腺毛的密度，測量其長度、壁的厚度等. 該研究觀察忍冬11 個農(nóng)家品種葉，包括：小毛花葉/黏土種植、大毛花葉/砂土種植、小雞爪葉/砂土種植、細毛針葉/砂土種植、紅褲腿葉/砂土種植、大麻葉/砂土種植、麻針葉/砂土種植、大雞爪葉/砂壤土種植、大毛花葉/砂壤土種植、大麻葉/ 牻砂土種植、 牛兒腿葉/砂土種植. 研究發(fā)現(xiàn)：不同農(nóng)家品種間的忍冬葉片的長度、非腺毛的密度、寬度以及長寬比、長度、壁的厚度等均存在著一定的差異性.

1.3 忍冬藤的鑒別

1.3.1 基源-性狀-顯微鑒別法

王兵等[24]采用基源-性狀-顯微鑒別法對忍冬藤（山西省中醫(yī)學(xué)院提供）與其偽品連翹莖（產(chǎn)地：山西省太原市）和金銀忍冬藤（產(chǎn)地：山西省太原市）進行比較和鑒別. 實驗發(fā)現(xiàn)：忍冬藤、連翹莖及金銀忍冬藤在基源、性狀及顯微特征方面均存在一定差異.

1.3.2 性狀-顯微-薄層鑒別法

陳婷等[25]采用性狀-顯微-薄層鑒別法開展了忍冬藤（產(chǎn)地：湖南省及山東?。┡c灰氈毛忍冬藤（產(chǎn)地：湖南?。┑蔫b別研究. 該研究采用性狀鑒別方法觀察忍冬藤與灰氈毛忍冬藤的外觀性狀的差別，采用組織切片顯微鑒別法鑒別忍冬藤與灰氈毛忍冬藤的組織橫切面的不同之處；采用TLC 法對忍冬藤與灰氈毛忍冬藤進行定性鑒別.

1.3.3 顯微-HPLC 法-MIR 光譜-DNA 法

蘇征[26]采用復(fù)雜的顯微-HPLC 法-MIR 光譜-DNA 法對忍冬的新品種（華金6 號/山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園、華金3 號/山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園和華金2 號/山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園）和農(nóng)家品種（雞爪花/山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園）的藤莖進行生藥學(xué)比較研究. 利用生藥學(xué)技術(shù)手段觀察比較原植株形態(tài)、藥材性狀及顯微特征，利用HPLC 法測定藥材活性成分含量，采用主成分分析（PCA）法進行了比較，并初步制定了新品種忍冬藤的指紋圖譜. 利用MIR 光譜法制定了4 種藥材的二級結(jié)構(gòu)MIR 光譜譜圖. 應(yīng)用分子生物學(xué)方法對不同品種的忍冬進行DNA 條形碼的研究，對新品種忍冬進行快速準確鑒別. 生藥學(xué)性狀研究中發(fā)現(xiàn)不同品種忍冬藤在形態(tài)外觀性狀上存在一定差異，顯微鑒別發(fā)現(xiàn)各品種差異不大；利用HPLC 法結(jié)合PCA法對不同品種忍冬藤質(zhì)量進行主成分分析，華金6 號質(zhì)量綜合最佳；HPLC 指紋圖譜對新品種忍冬藤鑒別提供了可能，MIR 光譜法對官能團進行比較，未發(fā)現(xiàn)明顯差異；生物分子學(xué)手段得出華金6 號變異最大，華金3號和華金2 號聚為一類.

2 結(jié)語

中藥材的鑒別研究是一個精密的分析過程. 從簡單活性成分的鑒別到針對中藥材產(chǎn)地的地域鑒別，甚至對地域進行條形碼溯源都離不開精準的鑒別技術(shù). 本研究對近年來忍冬的花蕾、葉及藤的常見鑒別方法進行了綜述. 其中忍冬花蕾（金銀花）的鑒別報道較多，忍冬藤的鑒別報道較少. 鑒別方法主要包括：TLC 法、HPLC 法、MIR 光譜法、NIR 光譜法、UV 光譜法、CEFP 法、DNA 分子標(biāo)記法、顯微法，其中 TLC 法因其操作簡便、設(shè)備簡單、重分離速度快等優(yōu)點被用作中藥鑒別最常用的方法之一. 但隨著HPLC 技術(shù)的發(fā)展，TLC 法應(yīng)用的局限性逐漸凸顯出來，如結(jié)果重復(fù)性差、展開劑具有一定毒性、穩(wěn)定性較差等. HPLC 法在定量定性方面均優(yōu)于TLC 法，并且HPLC 法可以聯(lián)用不同檢測器彌補本身的不足之處，實現(xiàn)了對各類成分的定量和定性檢測，將成為中藥質(zhì)量控制的主要技術(shù)方法之一.