桔綠木霉Snef1910 聯(lián)合噻唑膦防治根結(jié)線蟲減施增效研究

劉曉宇，王媛媛，范海燕，段玉璽

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/北方線蟲研究所，沈陽110161）

根結(jié)線蟲病是設(shè)施蔬菜的主要土傳病害之一[1]，東北地區(qū)設(shè)施蔬菜的種植環(huán)境非常適合根結(jié)線蟲的生存，因此隨著種植面積的逐年增加，根結(jié)線蟲病害也日趨嚴(yán)重。 東北地區(qū)溫室蔬菜根結(jié)線蟲的一般發(fā)病率在65%以上，嚴(yán)重地區(qū)發(fā)病率可達(dá)到100%[2]，給農(nóng)戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。 生產(chǎn)上蔬菜根結(jié)線蟲病的防治仍以化學(xué)農(nóng)藥為主，化學(xué)農(nóng)藥因高效價廉和施用簡單等優(yōu)點(diǎn)而備受農(nóng)戶青睞，但同時化學(xué)農(nóng)藥的高毒和高殘留又不可避免地危害著人的生存環(huán)境和食品安全。推進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展是農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革的主攻方向，加快農(nóng)藥減量增效是促進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的重要措施。 減藥增效的常用措施包括：合理選擇用藥、適時用藥、嚴(yán)格掌握用藥量、堅(jiān)持輪換用藥和合理復(fù)配混用農(nóng)藥。 近幾年，生防菌劑與化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配混用成為研究熱點(diǎn)[3-5]。 生防菌劑在有機(jī)農(nóng)業(yè)使用的整合害蟲管理系統(tǒng)(IPM)中扮演重要的角色。 它具有選擇性強(qiáng)和對環(huán)境安全性高等優(yōu)點(diǎn)，但是生物菌劑不具廣效性、見效慢、有效期短和成本高等缺點(diǎn)卻限制了它取代化學(xué)農(nóng)藥的進(jìn)程。那么，兩者的聯(lián)合應(yīng)用研究就是期望能夠揚(yáng)長避短，從而實(shí)現(xiàn)病害防治的高效和低殘留的目標(biāo)。

本課題組前期從土壤中篩選獲得一株高效殺線蟲生防菌Snef1910，經(jīng)鑒定為桔綠木霉（T.citrinovirid），其次生代謝物對甘薯莖線蟲(Ditylenchus destructor)、大豆孢囊線蟲(Heterodera glycines)、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)的致死率均可達(dá)到80%以上，具有很好的生防潛力[6-7]。 國際上已經(jīng)認(rèn)定木霉菌(Trichoderma spp.)為重要生物防治菌，在病害防治過程中還具有促進(jìn)植物生長和誘導(dǎo)抗性的能力[8-9]。 本研究利用桔綠木霉Snef1910聯(lián)合噻唑膦共同防治根結(jié)線蟲病害，通過測定兩者的施用次數(shù)和施用順序?qū)χ仓甑纳L、土壤中線蟲2 齡幼蟲的數(shù)量（J2）和藥物對病害的防效等指標(biāo)的影響，探究桔綠木霉Snef1910 與噻唑膦的聯(lián)合施用是否可以實(shí)現(xiàn)化學(xué)農(nóng)藥噻唑膦的減量增效，為線蟲病害的綠色防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試75%噻唑膦乳油為河北三農(nóng)農(nóng)用化工有限公司生產(chǎn)。 供試桔綠木霉snef1910 由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)北方線蟲研究所-20℃下保存；中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存編號：CGMCC No.13569。 供試番茄 （Lycopersicon esculentum Mill） 品種為谷雨天賜1 號。 試驗(yàn)在遼寧省鐵嶺市李千戶鎮(zhèn)營盤村的日光溫室（123.92E，42.18N）進(jìn)行。 定植前，每100g 土中含成蟲量約8000 條，分布均一，屬于嚴(yán)重病害大棚。

1.2 方法

溫室田間試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每壟長6m，壟寬0.5m，壟間距0.3m，每壟28 株。試驗(yàn)共設(shè)6 個處理組：snef1910 僅在定植期灌根施用1 次（snef1910-1）；噻唑膦僅在定植期灌根施用1 次（F-1）；snef1910 在定植期和30d 后各施用1 次（snef1910-2）；噻唑膦在定植期和30d 后各施用1 次（F-2）；snef1910 在定植期施用1次，30d 之后施用噻唑膦1 次 （snef1910+F）； 噻唑膦在定植期施用1 次，30d 之后施用1 次snef1910 （F+snef1910）。 每個處理3 次重復(fù)， 另設(shè)清水對照。 藥后90d 取樣測定各相關(guān)數(shù)據(jù)。 藥劑用量：75%的噻唑膦EC 200mL·hm-2，稀釋6000 倍，每株灌根施用200 mL；snef1910 發(fā)酵液稀釋30 倍，每株灌根施用200mL[12]。

1.2.1 桔綠木霉發(fā)酵液的制備[10]取活化的桔綠木霉Snef1910 置于平板培養(yǎng)形成菌落，利用5mm 打孔器獲得菌餅，置于150mL 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，28℃，120r·min-1恒溫培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)5d，得到Snef1910 種子液。 將種子液接種于30L 發(fā)酵罐的PDB 培養(yǎng)液中，28℃，220r·min-1發(fā)酵培養(yǎng)5d，得到Snef1910 菌株發(fā)酵液，稀釋30 倍備用。

1.2.2 噻唑膦對桔綠木霉菌snef1910 的生長抑制測試[11]依據(jù)噻唑膦田間使用量作為中間濃度，配制含有噻唑膦5 種梯度濃度的PDA 培養(yǎng)基：以9cm 培養(yǎng)皿中倒入10mL 培養(yǎng)基計(jì)算，每皿分別加入田間試驗(yàn)施用濃度0.6，0.8，1.0，1.2 和1.4 倍濃度的農(nóng)藥稀釋液。 在培養(yǎng)皿中央接入直徑為0.5cm 的桔綠木霉菌餅，每種處理濃度均有3 次重復(fù)，以不加農(nóng)藥的平板作為對照（CK），25℃培養(yǎng)，分別于48h 和72h 使用十字交叉法測量菌落直徑增長。

1.2.3 各處理對番茄植株根部生長的影響 移栽后90d，每個處理隨機(jī)取5 株番茄植株連根挖出，保持根系完整，流水除去根部的泥沙，測量番茄植株的根長、根鮮重和根干重[12-13]。

1.2.4 各處理對溫室番茄根結(jié)線蟲的防治效果測定 取20cm 深根際土壤100mL， 采用蔗糖懸浮離心法分離根結(jié)線蟲2 齡幼蟲（J2）并在顯微鏡下計(jì)數(shù)，每處理重復(fù)3 次[14]。

根系鮮樣用于根結(jié)指數(shù)和防效計(jì)算分析[15]。

根結(jié)指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)：0 級，沒有根結(jié)；1 級，根結(jié)占整個根系的1%～15%；2 級，根結(jié)占整個根系的16%～25%；3級，根結(jié)占整個根系的26%～50%；4 級，根結(jié)占整個根系的51%～75%；5 級，根結(jié)占整個根系的76%以上[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)結(jié)果采用Microsoft Office Excel 2016 軟件和SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 噻唑膦對桔綠木霉菌snef1910 的生長抑制測試

由圖1 可知，桔綠木霉Snef1910 在48h 已經(jīng)長滿平板，72h 產(chǎn)孢量增加。 說明噻唑膦在田間試驗(yàn)的用量范圍不會抑制桔綠木霉Snef1910 的生長，兩者無論混用或者順序施用都不會影響彼此的防治效果。

圖1 噻唑膦對桔綠木霉Snef1910 的生長抑制Figure 1 The inhibition assay of fosthiazate to T.citrinovirid Snef1910

2.2 各處理對番茄植株根部生長的影響

試驗(yàn)地溫室大棚屬于嚴(yán)重病害，移栽90 d 取樣時，清水對照（CK）的植株根結(jié)嚴(yán)重，根部發(fā)育受損，分級均為5 級。 由圖2 可知，相對于對照，施用藥劑處理的植株根長顯著增長。 其中，經(jīng)2 次噻唑膦灌根處理（F-2）的根最長29.82 cm，比對照增長37.93%；F+Snef1910 處理的根長增長率為32.38%，與F-2 相近。 Snef1910+F 相比F+Snef1910 對根長的影響并不顯著，即噻唑膦和木霉的施用順序?qū)ΩL的影響并不顯著（圖2A）。 由圖2B 可知，CK 布滿根結(jié)導(dǎo)致根鮮重和根干重數(shù)值最大。經(jīng)藥劑處理，根結(jié)減少，健康的須根增多，根干重和根鮮重的數(shù)值均顯著降低。 Snef1910-1、F-1、Snef1910-2、F-2、Snef1910+F 和F+Snef1910 處理的根鮮重的降低率分別為45.57%、63.98%、28.37%、49.50%、43.69%和58.04%； 對于根干重的減少率分別為31.91%、35.65%、14.86%、40.24%、30.26%和47.45%。 根部的重量變化需要結(jié)合圖3 和圖4 中根的實(shí)際狀態(tài)來分析。

由圖3 可知，CK 根結(jié)嚴(yán)重，6 個處理組根結(jié)顯著減少，須根明顯增多。 但Snef1910-1 和F-1 只施用1 次藥劑根區(qū)根結(jié)比對照減少，有少量須根；經(jīng)Snef1910-2、F-2、Snef1910+F 和F+Snef1910 處理的根部根結(jié)較少，出現(xiàn)更多健康的須根（圖4），結(jié)合圖2B 的數(shù)據(jù)，根的重量受到兩個因素的影響：根結(jié)數(shù)量和須根的數(shù)量。 目測觀察，F(xiàn)+Snef1910 的根結(jié)最少，須根最多，外觀與F-2 相似。 Snef1910+F 的根結(jié)和須根的情況與F-1 相似。

圖2 田間試驗(yàn)中不同處理對番茄生長的影響Figure 2 Influence of different treatments on the tomato growth

圖3 溫室田間試驗(yàn)中不同處理后受根結(jié)線蟲侵染番茄的癥狀表現(xiàn)（90d）Figure 3 Symptom performance of the tomato plants infested with Meloidogyne incognita on 90 days after different treatments in field experiment

圖4 溫室田間試驗(yàn)中2 次用藥處理后受根結(jié)線蟲侵染番茄的癥狀表現(xiàn)（90d）Figure 4 Symptom performance of the tomato plants infested with Meloidogyne incognita on 90 days after using nematicide twice in field experiment

綜合圖2、圖3 和圖4 的結(jié)果，F(xiàn)-2 和F+Snef1910 對番茄根部生長的影響效果相似，說明定植期施用噻唑膦，定植期后再施用Snef1910 有利于番茄根部的生長發(fā)育。

2.3 各處理對溫室番茄根結(jié)線蟲的防治效果

由表1 可知，F(xiàn)+Snef1910 和F-2 的防效最高為68.00%，與F-1 和Snef1910+F 的防效差異性不顯著，但與Snef1910-1 和Snef1910-2 的防效差異顯著。 經(jīng)Snef1910-1、F-1、Snef1910-2、F-2、Snef1910+F 和F+Snef1910處理的每100mL 土中的J2 數(shù)量比對照分別降低46.04%、48.52%、53.19%、66.32%、48.84%和58.76%。 無論從防效還是對土壤中J2 數(shù)量的控制能力方面，F(xiàn)-2 都是最好的。 其次是F+Snef1910。 但是，F(xiàn)+Snef1910 的增產(chǎn)率是最高的76.50%，遠(yuǎn)高于F-2 的59.68%和Snef1910+F 的58.18%。

表1 不同處理對南方根結(jié)線蟲的溫室田間防效Table 1 Control efficiency of different treatments on Meloidogyne incognita in the field experiments

3 討論與結(jié)論

木霉菌（Trichoderma spp.）是一種很重要的生防資源，具有適應(yīng)廣、代謝物多樣和環(huán)境友好等特點(diǎn)。1932 年WEINDLING 發(fā)現(xiàn)木霉可以通過寄生而導(dǎo)致病原微生物的死亡[18]，由此開啟了木霉在植物病害防治方面的深入研究。 已報道的木霉可防治的病害包括番茄立枯病[19]、辣椒疫病[20]、楊樹葉枯病[21]、玉米秸稈腐病[22]、炭疽病[23]和各種土傳病害[24]。 根結(jié)線蟲病害是土傳病害之一，王貽蓮等[25]利用木霉菌LTR-2 和T11-W 形成組合菌劑和營養(yǎng)基質(zhì)防治黃瓜根結(jié)線蟲；翟明娟等[26]篩選獲得了綠色木霉Tvir-6 的發(fā)酵液對根結(jié)線蟲2 齡幼蟲具有極高毒力，田間防效可以達(dá)到64.9%；李登輝[27]測試了鉤狀木霉T21 誘導(dǎo)番茄抗根結(jié)線蟲的能力，菌株處理的番茄相比對照根結(jié)數(shù)量減退67.23%；張樹武等[28]研究長枝木霉T6 菌株在黃瓜根際具有較強(qiáng)的定殖作用，對被南方根結(jié)線蟲侵染的植株具有很好的促生作用。 此外，還有康寧木霉[29]和哈茨木霉[30]等都被報道了具有防治根結(jié)線蟲病害的作用。近年來，化學(xué)農(nóng)藥結(jié)合生物農(nóng)藥防治土傳病害成為研究熱點(diǎn)。眾多研究均采取兩者混用的方式，在有效控制病害的同時降低化學(xué)農(nóng)藥使用量[31-32]。但是，通過混用的方式實(shí)現(xiàn)兩者對病害的協(xié)同控制，必須在生防菌與化學(xué)農(nóng)藥相容的前提下進(jìn)行，高濃度的化學(xué)藥劑對生防菌生長一般都有抑制作用，而不同菌株忍受藥劑的種類和濃度也不同。 因此，通過生防菌與化學(xué)農(nóng)藥混用的方式減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，實(shí)現(xiàn)化學(xué)農(nóng)藥的減施增效受到多方面的限制，也使這種混合模式的應(yīng)用難以推廣。本研究將生防菌和化學(xué)農(nóng)藥在作物生長期分階段單獨(dú)施用，通過減少化學(xué)農(nóng)藥的施用次數(shù)實(shí)現(xiàn)減施的效果，利用藥劑不同的防病機(jī)制在作物生長的不同階段發(fā)揮作用，實(shí)現(xiàn)增效，由此可以避免生防菌與化學(xué)農(nóng)藥混用的拮抗問題。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)線蟲病害嚴(yán)重時，僅利用生防菌無法有效防治病害，必須利用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行干預(yù)。種植期增加噻唑膦的施用次數(shù)可以提高防效，但過量施用噻唑膦可能會造成藥物殘留和燒根現(xiàn)象。兩者施用順序會對防效和產(chǎn)量有較大影響，這種結(jié)果可能與兩者的作用機(jī)理有關(guān)。 噻唑膦具有較強(qiáng)的觸殺能力，在定植期施用噻唑膦可以快速降低線蟲2 齡幼蟲的數(shù)量，降低侵染率，同時它還可內(nèi)息傳導(dǎo)至植物體內(nèi)，殺滅根系中的線蟲，施藥1 次的有效期為30～40d；30d 后施用木霉菌Snef1910 可以鞏固噻唑膦的防控效果，木霉活菌對于線蟲的防控機(jī)理比較復(fù)雜，通過觸殺、誘導(dǎo)抗性和增厚根部組織結(jié)構(gòu)等多種方式幫助植株防控線蟲侵染，最重要的是木霉發(fā)酵液中含有大量營養(yǎng)物質(zhì)，給生長期和結(jié)果期的植株提供大量養(yǎng)分，從而起到增加產(chǎn)量的作用。相反，在定植期施用木霉Snef1910，病害嚴(yán)重的土壤中，2 齡幼蟲密度高，活菌制劑對線蟲的觸殺能力很難超越化學(xué)農(nóng)藥，前期會出現(xiàn)較高侵染而降低總體聯(lián)合防治效果。 本研究結(jié)果可為木霉聯(lián)合其他化學(xué)殺線劑實(shí)現(xiàn)減施增效提供參考。