接種松材線蟲對樟子松生理指標(biāo)的影響

尹大川，鄧玉俠，祁金玉，陳鳳毛，郝德君，談家金，孫守慧

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，沈陽110161；2.遼寧生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)林場，遼寧 撫順113300；3.南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，南京210018）

松材線蟲病（Pine wilt disease）又稱松樹萎蔫病，是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）侵染松科植物所引發(fā)的一種以整株枯死為典型癥狀的毀滅性森林病害[1]。自1982 年我國在南京中山陵首次發(fā)現(xiàn)以來，該病不斷擴(kuò)展蔓延，造成松樹（Pinus spp.）的大量死亡，成為近幾十年來我國發(fā)生最嚴(yán)重、危害面積最廣的重大林業(yè)病害[2]。該病蔓延速度極快，染病后松樹的死亡率極高，因此被稱為“松樹的癌癥”[3]。 現(xiàn)已成為我國林業(yè)生產(chǎn)的巨大威脅，嚴(yán)重危害著森林生態(tài)安全，是我國當(dāng)前林業(yè)生產(chǎn)的頭號大敵[4-6]。

到目前為止，松材線蟲病在我國自然感染的松樹種類有16 種。 其中，遼寧地區(qū)的寄主以油松（P.tabuliformis）、紅松（P.koraiensis）、落葉松（Larix spp.）和樟子松（P.sylvestris var.mongolica）為主[7]。 樟子松作為我國北方的主要造林樹種，其在我國北方地區(qū)，尤其在遼寧西北地區(qū)的防風(fēng)固沙中發(fā)揮著重要作用[8-9]。 有研究表明，3 年生樟子松苗木在人工接種松材線蟲后可在25d 死亡[10]。 但其在感染松材線蟲之后的相關(guān)指標(biāo)變化規(guī)律，相關(guān)研究尚未報(bào)道。 因此，對于遼西北地區(qū)樟子松在接種松材線蟲后，相關(guān)抗病性指標(biāo)的變化規(guī)律研究十分必要。

活性氧（ROS）是一種重要的信號分子，具有細(xì)胞毒性。 當(dāng)植物體遭遇外來生物和非生物脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的ROS 分子[11]。 不同的環(huán)境脅迫同時(shí)也會(huì)影響植物的生長過程，進(jìn)而使植物產(chǎn)生一定的應(yīng)激響應(yīng)[12]。 在眾多響應(yīng)機(jī)制中，抗氧化酶系統(tǒng)（包括過氧化氫酶CAT、過氧化物酶POD 和超氧化物歧化酶SOD），抗病相關(guān)代謝產(chǎn)物（如黃酮類化合物），光合色素等物質(zhì)的變化既能表明植物對病原物的抵抗能力，也能評價(jià)該植物的抗病性強(qiáng)弱[13]。

本研究以遼寧西部地區(qū)4 年生樟子松為研究對象，通過對其進(jìn)行松材線蟲接種，并觀測其光合色素含量、抗氧化酶活性、抗逆性相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，解析各指標(biāo)在防御反應(yīng)中的動(dòng)態(tài)變化特征，以期為闡明遼西地區(qū)樟子松對松材線蟲的抗性機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植株和接種

松材線蟲分離自遼寧省沈陽市沈河區(qū)東陵公園感病油松，現(xiàn)保存于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室。 4 年生樟子松實(shí)生苗購自遼寧省沙地治理與利用研究所。在天氣晴好、氣溫維持在30℃時(shí)接種，接種時(shí)間為2019 年6月15 日。接種時(shí)采用斜切接種法:在當(dāng)年生枝條結(jié)節(jié)5cm 處，沿枝干斜切入木質(zhì)部，切口深2mm、長3cm。迅速將線蟲懸浮液200μL（含10000 頭線蟲）均勻注入切口處。對照組注入等量蒸餾水，每種處理10 株。接種后進(jìn)行正常管理。

1.2 取樣及檢測方法

為檢測不同時(shí)間松材線蟲侵染后樟子松的生理響應(yīng)，在接種后第0，10，20，30 天時(shí)，取距離接種口位置相同位置的當(dāng)年生嫩枝針葉，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取同一植株的3 處作為重復(fù)。 采集的嫩葉立即投入液氮中置于-80℃冰箱中保存。第30 天時(shí)，在接種口上、下方各2～5cm 的莖段，剪碎后利用貝爾曼漏斗法分離松材線蟲[14]，統(tǒng)計(jì)該時(shí)間點(diǎn)的松材線蟲數(shù)量。

1.3 相關(guān)指標(biāo)測定

光合色素采用丙酮-乙醇研磨法[15]。 抗氧化酶活性采用南京建成公司的酶活檢測試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作。黃酮類化合物采用紫外分光光度計(jì)法[15]?？扇苄缘鞍撞捎每捡R斯亮藍(lán)G-250 法[16]。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用Graphpad Prism 7.0 進(jìn)行雙因素方差分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟子松梁病癥狀觀察

對接種后苗木進(jìn)行正常管理。在第10 天時(shí)接種苗木開始出現(xiàn)針葉枯黃、干枯等癥狀，少數(shù)苗木出現(xiàn)梢部倒頭（圖1A）。 針葉圍繞接種部位開始逐漸變黃、干枯（圖1B）。 隨著時(shí)間的推移，針葉枯萎面積逐漸擴(kuò)大，并逐步向全株擴(kuò)展，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，樹木尚未完全死亡。

接種松材線蟲第30 天，圍繞在接種部位的上部和下部均分離檢測到松材線蟲。 不同部位的松材線蟲數(shù)量存在一定的差異, 其中，接種口下方莖段中松材線蟲多于上部，但無顯著差異（圖2）。

圖1 樟子松苗木發(fā)病癥狀（第10 天）Figure 1 Symptom of seedling of P.sylvestris var.mongolica seedlings (Day 10)

2.2 接種松材線蟲后樟子松針葉內(nèi)光合色素的動(dòng)態(tài)變化

由圖3A 可知，接種后，葉綠素a 含量開始下降，對同一時(shí)間點(diǎn)不同處理間樟子松針葉內(nèi)葉綠素a 含量進(jìn)行方差分析，發(fā)現(xiàn)第30 天，葉綠素a 的含量與對照組達(dá)到極顯著差異水平（p＜0.01），接種處理比對照低38.6%。雙因素方差分析結(jié)果表明，時(shí)間[F(1,16)=11.21]和接種[F(3,16)=5.854]對試驗(yàn)結(jié)果均有顯著影響，但二者無交互影響[F(3，16)=3.002]（表1）。 由圖3B 可知，接種后，葉綠素b 含量開始下降，在第10 天，葉綠素b 的含量與對照組達(dá)到極顯著差異（p＜0.01）；到第30 天，接種處理與對照組達(dá)到極顯著差異水平（p＜0.01），接種處理比對照降低50.9%。 雙因素方差分析結(jié)果表明，時(shí)間[F(1,16)=70.69]和接種[F(3,16)=46.72]對試驗(yàn)結(jié)果均有顯著影響，而且二者交互影響顯著[F(3,16)=9.307]（表1）。 該結(jié)果表明接種松材線蟲對樟子松的生長產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。

圖2 樟子松苗木線蟲數(shù)量（第30 天）Figure 2 The number of nematodes in P.sylvestris var.mongolica seedlings (Day 30)

2.3 接種松材線蟲后樟子松針葉內(nèi)抗氧化酶的動(dòng)態(tài)變化

圖3 樟子松苗木光合色素含量變化Figure 3 Content of photosynthetic pigment in P.sylvestris var.mongolica seedlings

表1 樟子松苗木光合色素含量方差分析Table 1 Variance analysis of photosynthetic pigment content in P.sylvestris var.mongolica seedlings

由圖4 可知，接種線蟲后，苗木CAT 活性即開始上升，對同一時(shí)間點(diǎn)不同處理間樟子松針葉內(nèi)CAT 活性進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，第10 天即與對照組相比達(dá)到顯著差異水平（p＜0.01），隨著時(shí)間的推移，繼續(xù)上升，第20 天時(shí)達(dá)到最大，與對照組相比達(dá)到極顯著差異水平（p＜0.01），此時(shí)接種處理比對照組CAT 活性提高890%。第30 天時(shí)，酶活性下降，但仍然達(dá)到極顯著差異水平（p＜0.01）。對照組CAT 活性無顯著變化（圖4A）。雙因素方差分析結(jié)果表明，時(shí)間[F(1，16)=1074]和接種[F(3，16)=554.6]對試驗(yàn)結(jié)果均有極顯著影響，二者交互影響也極顯著[F(3，16)=597.5]（表2）。與CAT 變化規(guī)律類似，接種線蟲后，苗木POD 活性即開始上升，對同一時(shí)間點(diǎn)不同處理間樟子松針葉內(nèi)POD 活性進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，在第10 天即上升至最高點(diǎn)，酶活性比對照組高373%，且與對照組相比達(dá)到極顯著差異水平（p＜0.01）。 隨著時(shí)間的推移，POD 活性開始下降，在第30 天下降至最低，但與對照組仍然存在顯著差異（p＜0.01）。對照組POD 活性無明顯的變化（圖4B）。雙因素方差分析表明，時(shí)間[F(1,16)=527.9]和接種[F(3,16)=160.6]對試驗(yàn)結(jié)果均有極顯著影響，二者交互影響也極其顯著[F(3,16)=193.7]（表2）。 SOD 變化規(guī)律與的變化規(guī)律略有不同，接種線蟲之后，SOD 活性開始上升，隨后下降，但下降幅度不明顯，且在整個(gè)試驗(yàn)過程中，接種處理與對照相比SOD 活性均達(dá)到極顯著差異水平（p＜0.01）（圖4C）。 雙因素方差分析結(jié)果表明，時(shí)間[F(1,16)=780.7]和接種[F(3,16)=125.4]對試驗(yàn)結(jié)果均有極顯著影響，二者交互影響也極顯著[F(3,16)=110.6]（表2）。

圖4 樟子松苗木抗氧化酶活性變化Figure 4 Activities of antioxidant enzyme in P.sylvestris var.mongolica seedlings

表2 樟子松苗木抗氧化酶活性方差分析Table 2 Variance analysis of antioxidant enzymeactivities in P.sylvestris var.mongolica seedlings

2.4 接種松材線蟲后樟子松針葉內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化

接種線蟲后，苗木可溶性蛋白含量開始上升，方差分析表明， 第10 天即與對照組相比達(dá)到極顯著差異水平（p＜0.01），隨著時(shí)間的推移，開始下降，第30 天時(shí)下降到最低，但與對照組相比未達(dá)到顯著差異（p＞0.05）（圖5）。雙因素方差分析結(jié)果表明，時(shí)間[F(1,16)=0.1687]對試驗(yàn)結(jié)果無顯著影響，但接種線蟲[F(3,16)=10.4]對試驗(yàn)結(jié)果均有顯著影響， 二者交互影響顯著[F (3,16)=10.36]（表3）。

接種線蟲后，苗木MDA 含量開始上升，表明松材線蟲脅迫對樟子松細(xì)胞造成了較大的破壞（圖6）。 對同一時(shí)間點(diǎn)不同處理間樟子松針葉內(nèi)MDA 含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，在第10 天即與對照組相比達(dá)到極顯著差異水平（p＜0.01），隨著時(shí)間的推移，在第20 天達(dá)到最高，此時(shí)比對照組高449%，達(dá)到極顯著差異水平（p＜0.01）。 隨后開始下降，在第30 天時(shí)下降到最低，但與對照組相比依然存在極顯著差異（p＜0.01）（圖6）。 雙因素方差分析結(jié)果表明，時(shí)間[F(1,16)=663.6]和接種[F(3,16)=124]均對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，二者交互影響顯著[F(3,16)=122.9]（表3）。

圖5 樟子松苗木可溶性蛋白含量變化Figure 5 Content of soluble proteinin P.sylvestris var.mongolica seedlings

表3 樟子松苗木滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和黃酮方差分析Table 3 Variance analysis of osmotic adjustment substances and flavone in P.sylvestris var.mongolica seedlings

接種線蟲后，苗木黃酮含量開始上升，表明松材線蟲脅迫后樟子松苗木出現(xiàn)較大的應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量的黃酮類化合物來抵御病原入侵， 先上升后下降的變化趨勢可能的原因?yàn)槊缒驹谠囼?yàn)后期生命活動(dòng)降低所造成黃酮含量下降（圖7）。 對同一時(shí)間點(diǎn)不同處理間樟子松針葉內(nèi)黃酮含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，在第10，20和30 天與對照組相比均達(dá)到極顯著差異水平（p＜0.01），隨著時(shí)間的推移，在第20 天達(dá)到最高，此時(shí)比對照組升高450%。 隨后開始下降，在第30 天時(shí)仍與對照組相比依然存在極顯著差異（p＜0.01）（圖7）。 雙因素方差分析結(jié)果表明，時(shí)間[F(1,16)=3657]和接種[F(3,16)=1176]均對試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響，且二者交互影響顯著[F(3,16)=904.8]（表3）。

3 討論與結(jié)論

松材線蟲病是目前林業(yè)發(fā)展所面臨的頭等大敵。松材線蟲入侵后，一般會(huì)對松樹的生長產(chǎn)生極其不良的影響，導(dǎo)致松樹萎蔫甚至死亡[18-19]。樟子松作為東北地區(qū)的主要防風(fēng)固沙樹種，在東北地區(qū)尤其是遼寧西部地區(qū)的生態(tài)安全和環(huán)境保護(hù)中發(fā)揮著重要作用，其安全性直接關(guān)乎遼寧西部的國土安全。 目前，已有報(bào)道樟子松發(fā)生自然感病[7]，但對于其在人工接種條件的發(fā)病癥狀及生理響應(yīng)的研究仍然具有十分重要的意義。有研究表明，病原體脅迫會(huì)對植物的葉綠素含量產(chǎn)生消極地影響。 本研究中，接種松材線蟲可以抑制葉片中葉綠素合成。 樟子松接種后，葉綠素a 和葉綠素b 的含量隨著時(shí)間的推移均呈下降趨勢，這個(gè)結(jié)果與整個(gè)發(fā)病過程中針葉逐步出現(xiàn)枯黃的葉色變化一致。 這一現(xiàn)象與何龍喜等[20]不同松樹感染松材線蟲研究的結(jié)果一致。

圖6 樟子松苗木MDA 含量變化Figure 6 Content of MDAin P.sylvestris var.mongolica seedlings

圖7 樟子松苗木黃酮含量變化Figure 7 Content of flavonein P.sylvestris var.mongolica seedlings

植物在受到病原物脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，ROS 積累造成細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生大量H2O2，進(jìn)而毒害細(xì)胞。 俞祿珍等[21]研究表明，黑松受到松材線蟲侵染后，體內(nèi)產(chǎn)生大量的H2O2，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 何龍喜等[22]對不同抗性樹種感染松材線蟲后針葉內(nèi)H2O2含量進(jìn)行分析， 發(fā)現(xiàn)感病樹種后針葉內(nèi)H2O2含量顯著高于高度抗病樹種，說明松樹抗線蟲能力越強(qiáng)，其ROS 的去除能力也越強(qiáng)，也就是說其抗氧化酶活性越強(qiáng)。 CAT、POD 和SOD是植物體內(nèi)主要的抗氧化環(huán)境脅迫的酶系，通過它們的變化程度可以反映植物的抗逆性強(qiáng)弱[23]。MDA 是細(xì)胞膜質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，該物質(zhì)的含量變化情況可以衡量細(xì)胞膜系統(tǒng)被破壞的程度[24-25]。很多研究發(fā)現(xiàn)，在生物脅迫條件下，植物細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性有所升高，MDA 含量上升[26]。 本研究中，3 種抗氧化酶活性均出現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，MDA 含量呈現(xiàn)上升-平穩(wěn)-下降的趨勢。此結(jié)果表明，松材線蟲對樟子松苗木造成了脅迫，產(chǎn)生大量的ROS，致使苗木抗氧化酶活性升高用以去除多余的ROS。 但隨著時(shí)間的推移，苗木受松材線蟲脅迫致使生長勢逐漸下降，致使酶活性和MDA 含量降低。 保護(hù)酶活性和MDA 的變化，表明樟子松受松材線蟲脅迫后，顯著加劇了樟子松針葉細(xì)胞膜過氧化程度，導(dǎo)致細(xì)胞膜被破壞，針葉內(nèi)細(xì)胞內(nèi)容物外露、崩解，使植株趨于死亡。

可溶性蛋白是植物細(xì)胞內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，它的變化可以反映細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、變性及降解等多方面信息[27-28]。 有研究表明，在外界環(huán)境脅迫條件下，植物體可以降低可溶性蛋白含量以應(yīng)對環(huán)境脅迫[24]。 本研究中，隨著處理時(shí)間的延長，樟子松針葉內(nèi)的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，可能是由于松材線蟲脅迫致使樟子松出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，可溶性蛋白含量陡然升高，用以增加細(xì)胞的滲透勢來抵御不良環(huán)境。然而，隨著樟子松被脅迫程度的加深，細(xì)胞活性降低，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，致使細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白被沉淀、降解或者變性，呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。黃酮類化合物是植物抗逆性的重要代謝物，與植物抗病性有直接的關(guān)系。本研究中，松材線蟲接種則直接誘導(dǎo)了樟子松黃酮化合物的合成，促使黃酮化合物含量顯著升高。 苗木在受到松材線蟲脅迫時(shí)出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，隨著生長勢的降低，黃酮含量下降。

綜上，松材線蟲侵染使樟子松體內(nèi)各項(xiàng)抗性生理指標(biāo)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，但隨著病情的加重，樟子松生長勢衰弱，枯黃萎蔫，光合色素含量下降。 接種松材線蟲后，樟子松抗氧化酶系統(tǒng)變化較為明顯，均呈先升高后降低的變化趨勢，其中SOD 表現(xiàn)較為平穩(wěn)。 樟子松受松材線蟲脅迫細(xì)胞受損程度較大，MDA 含量在接種后即上升至較高的水平。 可溶性蛋白和黃酮化合物含量均表現(xiàn)出與抗氧化酶相似的趨勢，即先升高后降低，表明樟子松對松材線蟲脅迫具有一定的應(yīng)激反應(yīng)。