青貯添加劑對微生物多樣性影響的研究進展

辛亞芬 陳晨 曾泰儒 杜昭昌 倪浩然 鐘怡豪 譚小平 閆艷紅

（四川農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科技學院，成都 611130）

青貯飼料是在厭氧條件下，通過乳酸菌的發(fā)酵作用而得到的一種營養(yǎng)豐富、適口性好、消化率高且能長期貯存的優(yōu)質(zhì)飼料。青貯是一個非常復(fù)雜的微生物活動和生物化學變化的過程，是飼草非常重要的保存方式之一。青貯飼料的質(zhì)量既取決于青貯原料附著的微生物群落，也取決于其在發(fā)酵過程中的演替［1］。飼草青貯發(fā)酵過程中的主要微生物有乳酸菌、乙酸菌、梭菌、酵母菌、霉菌等，其中乳酸菌的數(shù)量和活性是影響發(fā)酵質(zhì)量的重要因素。大多牧草自身附著的有活性乳酸菌數(shù)量有限［2］，自然發(fā)酵時乳酸菌難以成為優(yōu)勢菌種，導(dǎo)致青貯失敗。為保證青貯盡快進入乳酸菌主導(dǎo)的發(fā)酵階段，常通過添加乳酸菌的方式來增加青貯飼料中的乳酸菌數(shù)量，抑制不良微生物的生長繁殖［3］。青貯添加劑除了傳統(tǒng)的乳酸菌制劑等發(fā)酵促進劑外，還包括發(fā)酵抑制劑、好氣性變質(zhì)抑制劑、營養(yǎng)性添加劑4大類。本文從實際生產(chǎn)應(yīng)用角度出發(fā)，重點從乳酸菌制劑、化學添加劑、酶制劑、營養(yǎng)性添加劑4個方面來討論添加劑對青貯微生物多樣性的調(diào)控，進而對青貯品質(zhì)的影響。

1 乳酸菌制劑

乳酸菌是影響青飼料發(fā)酵的主要有益微生物，屬于兼性厭氧型、革蘭氏陽性的無芽孢細菌，能利用糖分發(fā)酵形成以乳酸為主的有機酸，并降低pH［3］，抑制腐敗微生物的生長，減少發(fā)酵過程中的蛋白水解和干物質(zhì)損失［4］。根據(jù)乳酸菌對葡萄糖的發(fā)酵形式，可分為同型乳酸菌和異型乳酸菌兩大類。同型乳酸菌是制作青貯飼料最古老和最常見的青貯接種劑，其發(fā)酵己糖，幾乎只產(chǎn)生乳酸［5］。接種這類乳酸菌后，青貯飼料中的乳酸含量和干物質(zhì)回收率（DMR）較高，乙酸、丁酸、氨態(tài)氮含量和pH較低［6］。異型乳酸菌可增加青貯飼料中的乙酸含量，抑制好氧腐敗菌的繁殖，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性［7-9］?？梢姡樗峋苿┰谀敛萸噘A料的發(fā)酵和貯藏過程中起著關(guān)鍵作用。

1.1 同型乳酸菌制劑

同型乳酸菌制劑主要作用是促進青貯早期發(fā)酵，提高發(fā)酵效率，快速降低pH，抑制有害微生物的活性，使飼草成功青貯［10］。通常用于促進青貯發(fā)酵的同型乳酸菌有Lactobacillus、Streptococcus、Pediococcus等［11-12］。

接種同型乳酸菌對青貯發(fā)酵中微生物多樣性及豐富度會產(chǎn)生不同影響。Keshri等［1］對小麥的細菌測序數(shù)據(jù)表明，添加同型乳酸菌青貯90 d后細菌多樣性較低，Pantoea、Pseudomonas等有害微生物相對豐度減小，乳酸菌在青貯中占主要優(yōu)勢，通過PICRUSt分析表明，有氧暴露后，添加同型乳酸菌與CK處理之間有7條途徑顯著不同，乙苯降解、D-丙氨酸代謝、萜類骨架合成和離子通道系統(tǒng)的途徑在CK處理中更豐富，而添加同型乳酸菌后，硅氧烷雙組分系統(tǒng)中新生霉素生物合成更高，這類抗生素的產(chǎn)生可能會限制細菌群落的繁殖。自選耐高溫植物乳桿菌LP694可提高青貯飼料中Lactobacillus plantarum及異型乳酸菌Lactobacillus hammesii、Lactobacillus brevis的相對豐度，生產(chǎn)較多乳酸和乙酸，有效提高青貯飼料品質(zhì)，且添加同型乳酸菌制劑牛鞭草的發(fā)酵效果優(yōu)于異型乳酸菌制劑［13-14］。Yang等［15］研究結(jié)果表明，接種植物乳桿菌降低了細菌的多樣性，顯著提高乳桿菌相對豐度和乳酸含量，抑制腐敗梭菌屬和致病性李斯特菌屬微生物的生長，延緩了高溫高濕條件下苜蓿青貯飼料的腐敗，提高了苜蓿青貯飼料的發(fā)酵質(zhì)量。王媛等［16］研究結(jié)果表明，添加植物乳桿菌青貯后微生物菌群多樣性降低，Garciella屬和Weissella屬的相對豐度較低，Lactobacillus屬的相對豐度較高，表明植物乳桿菌作為青貯添加劑可以改變細菌菌群組成。Garciella是一種厭氧嗜熱菌屬于Clostridiales門、Clostridia屬，存在于青貯環(huán)境中將會增加青貯難度［17］。Yan等［14］研究結(jié)果表明，西南濕熱地區(qū)多花黑麥草和玉米秸稈混合青貯時，添加添加自選耐高溫植物乳桿菌LP149顯著降低了青貯原料中的Carnobacterium、Stenotrophomonas、Vagococcus等 不良微生物豐度，增加乳酸菌屬相對豐度，且存在較高豐度的L. hammesii和L. brevis的異型發(fā)酵菌株，說明植物乳桿菌的添加可以抑制不良微生物的繁殖，改善濕熱地區(qū)高水分牧草青貯發(fā)酵效果；且較高的青貯溫度通常會導(dǎo)致青貯過程中乳酸菌從同型發(fā)酵向異型發(fā)酵轉(zhuǎn)變，一定程度上可以延緩青貯飼料的有氧腐敗。

綜上，接種同型乳酸菌可調(diào)控青貯環(huán)境中微生物多樣性，在青貯發(fā)酵中普遍觀察到較多的乳酸菌種類及較高的相對豐度，迅速降低環(huán)境pH，抑制酵母菌、霉菌、梭狀芽胞桿菌等微生物的生長繁殖，從而提高青貯的發(fā)酵品質(zhì)，解決青貯原料乳酸菌不足，高溫高濕等特殊環(huán)境下青貯飼料品質(zhì)較差的問題。因此，在青貯發(fā)酵前期，為了保證快速、有力的發(fā)酵，抑制有害微生物的生長，接種同型乳酸菌是提高青貯品質(zhì)的有效方法。

1.2 異型乳酸菌

異型發(fā)酵乳酸菌屬于乳桿菌科，分屬于Lactobacillus、Leuconostoc和Weissella屬［7］，常見布氏乳桿菌、希氏乳桿菌、短乳桿菌等異型乳酸菌制劑主要應(yīng)用于青貯發(fā)酵研究［18］。異型發(fā)酵乳酸菌可以在青貯后期，通過產(chǎn)生高濃度的乙酸來抑制酵母菌、霉菌等不良微生物的生長，提高青貯有氧穩(wěn)定性［19-20］；此外，一些布氏乳桿菌能夠在青貯中產(chǎn)生阿魏酸酯酶，在抗菌和提高纖維的消化率等方面表現(xiàn)出優(yōu)勢［16］，然而，其對青貯飼料的發(fā)酵效果表現(xiàn)不一［21-23］。

布氏乳桿菌是專性異型青貯添加劑中的優(yōu)勢菌種，接種異型乳酸菌制劑對青貯發(fā)酵中微生物多樣性及豐富度有較大影響。Wambacq等［24］研究表明，布氏乳桿菌能有效抑制青貯過程中酵母菌等真菌的生長，改善青貯發(fā)酵的有氧穩(wěn)定性。萬江春等［25］研究表明，布氏乳桿菌處理有效抑制了酵母菌的增長速率，且有氧暴露后酵母菌的種類也僅有Zygosaccharomyces bailii、Candida tropicalis、Candida ethanolica和Candida rugosa四類，而Z. bailii可能是引起蘇丹草青貯飼料有氧變質(zhì)的主要酵母菌。Si等［26］研究表明，布氏乳桿菌的添加通過抑制紫花苜蓿原料上附著的Enterobacter ludwigii豐度，降低了蛋白質(zhì)在青貯過程中的降解，改善了青貯發(fā)酵的品質(zhì)。Pascal等［27］研究了異型乳酸菌接種處理對玉米青貯飼料中微生物群落動態(tài)變化的影響，結(jié)果表明經(jīng)布氏乳桿菌處理的青貯飼料細菌豐富度在青貯后下降，但含有較高的乳酸菌多樣性，主要是專性異發(fā)酵菌種，包括Lactobacillus brevis-和Lactobacillus ingluviei相關(guān)的OTUs，有助于乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸［28］，而乙酸可以很容易地進入微生物細胞，分解并降低細胞內(nèi)的pH，并消耗大量能量來維持其生理pH，最終殺死無法適應(yīng)的微生物，從而提高了青貯飼料的穩(wěn)定性［28］。雖然布氏乳桿菌在發(fā)酵過程中會消耗青貯飼料的營養(yǎng)物質(zhì)，但對真菌的抑制方面表現(xiàn)出更強的抗性作用，在青貯發(fā)酵和動物生產(chǎn)效率方面的優(yōu)勢能夠彌補營養(yǎng)物質(zhì)的損失［29］。添加布氏乳桿菌可改變牧草青貯發(fā)酵的微生物多樣性及豐富度，顯著提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。

可見，接種異型乳桿菌可調(diào)控青貯環(huán)境中微生物多樣性，通過將青貯發(fā)酵系統(tǒng)中的乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸，抑制Z. bailii、C. tropicalis等酵母菌的活性和Pantoea、霉菌等微生物的繁殖，提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性。因此，為了抑制腐敗微生物的繁殖生長，解決青貯飼料開窖后的腐敗變質(zhì)問題，接種異型乳酸菌是提高青貯飼料貯藏的有效途徑。

同型和異型發(fā)酵的乳酸菌以不同的方式調(diào)節(jié)青貯飼料的發(fā)酵，發(fā)酵中各種微生物群落演替規(guī)律和代謝物也存在很大差異。外源乳酸菌制劑通常對青貯飼料的發(fā)酵具有積極作用，了解乳酸菌添加劑種類、微生物演替規(guī)律及青貯飼料發(fā)酵過程中二者的相互作用，將有助于改進青貯發(fā)酵過程，生產(chǎn)高質(zhì)量的青貯飼料。

2 化學添加劑

化學添加劑也是青貯發(fā)酵中常用的添加劑［30］，包括無機酸、有機酸等。添加無機酸（如硫酸、鹽酸）可迅速制造酸性環(huán)境，殺死不良微生物，促進青貯飼料的有利發(fā)酵，但研究表明無機酸對青貯設(shè)備腐蝕性大、環(huán)境污染嚴重，且易引起動物體內(nèi)酸堿度失衡、采食量降低、生產(chǎn)性能下降等不利影響，目前無機酸在青貯中使用較少。有機酸（鹽）雖不能直接促進乳酸菌的增殖，但可以有效抑制酵母菌、霉菌等不良微生物的生長繁殖，有效提高青貯的有氧穩(wěn)定性，降低飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的損失［31-35］。

接種有機酸制劑顯著影響微生物菌群動態(tài)。Jiang等［36］的研究表明，有機酸處理降低了青貯飼料中微生物多樣性，提高了乳酸桿菌的相對豐度，抑制了Klebsiella、Paenibacillus和Enterobacter等微生物的生長，有效提高了玉米青貯飼料的品質(zhì)。陸永祥等［37］的研究表明，添加甲酸后，青貯飼料中不良微生物如酵母菌數(shù)量以及微生物多樣性指數(shù)降低，有益微生物如乳酸菌數(shù)量增加，并且能提高燕麥青貯飼料中乳酸菌的豐度，從而改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。然而，也有報道指出，甲酸可迅速滲透到乳酸菌細胞膜上，破壞其生物活性，導(dǎo)致乳酸菌活性降低，青貯發(fā)酵受到抑制，對有益微生物乳酸菌產(chǎn)生不利影響［38］。李曉紅等［39］測定了有機酸鹽不同復(fù)配比對牧草青貯發(fā)酵有害菌的抑制效果，結(jié)果表明雙乙酸鈉處理顯著抑制了大腸桿菌、青霉菌和酵母菌3種有害菌的生長，苯甲酸鈉處理對大腸桿菌和青霉菌的抑制作用較為顯著，山梨酸鉀處理僅對青霉菌的抑制較為顯著，復(fù)配使用對有害菌的抑制效果更為顯著。雙乙酸鈉對酵母的抑制更有效，且化學添加劑進行復(fù)配使用對減少青貯飼料發(fā)酵過程中有害微生物的數(shù)量，確保乳酸菌群的優(yōu)勢地位有很大的積極作用，可以有效提高青貯發(fā)酵的成功率和青貯品質(zhì)。

化學添加劑可迅速制造酸性環(huán)境，降低青貯飼料的pH，抑制Klebsiella、Paenibacillus和大腸桿菌等有害微生物的生長繁殖，減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失，提高青貯飼料的品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性。因此，了解有機酸添加劑種類、復(fù)配劑量等對牧草青貯的細菌和真菌群落組成影響，有助于解釋有機酸制劑如何提高青貯飼料的品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性。

3 酶制劑

青貯中添加的酶制劑主要是多種細胞壁分解酶，包括纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶及復(fù)合酶等，可將原料細胞壁的纖維素和半纖維素分解為能被乳酸菌利用的單糖及雙糖，為乳酸菌的繁殖發(fā)酵提供充足的底物，有利于抑制腐敗菌的滋生，提高青貯品質(zhì)和飼料的利用率。然而，Lynch等［40］的研究表明，添加酶制劑使得酵母菌數(shù)量增加，青貯飼料品質(zhì)未得到提高。

接種酶制劑對青貯發(fā)酵中微生物多樣性及豐富度會產(chǎn)生不同影響。纖維素酶和α-半乳糖苷酶聯(lián)合使用增加了乳酸菌的相對豐度［41］；纖維素酶和木聚糖酶聯(lián)合使用抑制了酵母菌、霉菌和大腸桿菌的滋生［42］。黃媛等［43］的研究結(jié)果表明，在添加糖蜜的基礎(chǔ)上添加纖維素酶可增加Enterococcus及Lactobacillus的相對豐度，降低了Weissella的相對豐度，同時減少Proteobacteria的相對豐度，引起微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，提高構(gòu)樹的青貯飼料品質(zhì)。劉菲菲［44］研究了纖維素酶、木聚糖酶及二者復(fù)合酶制劑對酒糟與麥麩混貯微生物菌群的影響，結(jié)果表明，F(xiàn)irmicutes和Lactobacillus相對豐度隨著青貯時間延長逐漸升高，Proteobacteria相對豐度降低，且纖維素酶和木聚糖酶復(fù)配使用青貯效果更優(yōu)。Firmicutes是革蘭氏陽性菌，能降解多種大分子化合物，Proteobacteria包括大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌，會與乳酸菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生生物胺，對混貯發(fā)酵品質(zhì)產(chǎn)生負面影響?？梢?，添加酶制劑有利于青貯品質(zhì)的提升，且聯(lián)合添加酶制劑時對發(fā)酵品質(zhì)的提高作用影響要優(yōu)于單獨添加。盡管酶制劑已經(jīng)使用了很多年，但直到最近才有關(guān)于蛋白酶水解玉米籽粒中淀粉顆粒周圍的蛋白質(zhì)基質(zhì)以改善淀粉消化率方面的研究［45-46］，這種添加劑可以改善較短青貯時間的高水分玉米淀粉消化率，但在開發(fā)添加劑方面仍需進一步研究［7］。

酶制劑通過纖維素的分解對乳酸菌提供充足的發(fā)酵底物，抑制霉菌等腐敗微生物的繁殖，提高青貯品質(zhì)，且酶制劑的復(fù)配使用對發(fā)酵品質(zhì)的效果更優(yōu)。因此，建議在纖維含量較高、WSC含量較低的飼草青貯時添加適量的酶制劑促進青貯品質(zhì)的提升。

4 營養(yǎng)性添加劑

營養(yǎng)性添加劑包括葡萄糖、糖蜜飼料、谷類等［47］，可為乳酸菌提供更多的發(fā)酵底物，使乳酸發(fā)酵迅速占據(jù)主導(dǎo)地位，另外，營養(yǎng)性添加劑中還含有天門冬氨酸和谷氨酸等呈味物質(zhì)，可在青貯中明顯改善發(fā)酵品質(zhì)，已作為一種綠色、安全的發(fā)酵促進劑被廣泛使用。

營養(yǎng)性添加劑可以改變牧草青貯中的微生物群落結(jié)構(gòu)。Luo等［48］研究了添加糖蜜對苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)、微生物群落的影響，發(fā)現(xiàn)添加糖蜜后Enterococcus和Lactobacillus在苜蓿青貯中占優(yōu)勢地位，梭狀芽胞桿菌、酵母菌、霉菌等不良微生物被抑制，且乳酸/乙酸隨著糖蜜添加量的增加而顯著增加?？梢?，糖蜜的添加為青貯提供額外的發(fā)酵基質(zhì)，促進青貯發(fā)酵系統(tǒng)中有益微生物的主導(dǎo)地位，為青貯飼料的發(fā)酵和長期保存提供良好的條件。Wu等［49］研究表明，補糖提高了青貯飼料中Lactobacillus相對豐度，降低Pediococcus相對豐度；糖蜜處理顯著提高有益乳酸菌相對豐度，降低Citrobacter和Enterobacter的相對豐度，進而提高了苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)，且微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化為減少脂肪酸的損失提供了思路。由此可見，營養(yǎng)性添加劑通過為青貯外源補充發(fā)酵底物，促進乳酸菌等有益菌的快速發(fā)酵，降低pH，抑制梭狀芽胞桿菌、酵母菌、霉菌等有害微生物，進而提高青貯發(fā)酵品質(zhì)。

5 小結(jié)與展望

牧草青貯發(fā)酵是多種微生物共同作用的結(jié)果，青貯品質(zhì)與微生物群落結(jié)構(gòu)之間有著錯綜復(fù)雜的關(guān)系。乳酸菌制劑主要通過提高乳酸菌的相對豐度，降低pH，抑制好氧微生物的生長，提高青貯品質(zhì)；化學添加劑通過迅速制造酸性環(huán)境，抑制有害微生物的生長繁殖，減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失，提高有氧穩(wěn)定性；酶制劑和營養(yǎng)性添加劑通過為乳酸菌提供充足的發(fā)酵底物，促進乳酸菌等優(yōu)勢菌的快速發(fā)酵，降低pH，改善青貯品質(zhì)。4種青貯添加劑通過調(diào)節(jié)微生物種類及數(shù)量，使乳酸菌等有益微生物占據(jù)主導(dǎo)地位，抑制酵母菌、霉菌等微生物的生長繁殖，為青貯發(fā)酵品質(zhì)和牧草長期保存提供條件，同時，還可以滿足在多種環(huán)境下對青貯品質(zhì)的提升。

因此，了解飼草表面附著微生物特性是決定是否需要添加劑的重要依據(jù)，以此為基礎(chǔ)，針對青貯的不同需要，將多種優(yōu)質(zhì)菌劑聯(lián)合使用，充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢才能全面提升青貯飼料的品質(zhì)以及牲畜生產(chǎn)性能。在該過程中，通過篩選提高菌劑資源庫的多樣性、定向研發(fā)具有特定功能的優(yōu)質(zhì)菌劑，結(jié)合現(xiàn)代分子生物技術(shù)，進一步揭示微生物群落結(jié)構(gòu)及功能與青貯品質(zhì)之間的關(guān)系，將為青貯系統(tǒng)中完整的微生物群落提供有價值的生物學信息。