墓頭回提取物對急性髓系白血病完全緩解期患者骨髓源性樹突狀細(xì)胞功能的影響

王玉虹 夏小軍 崔 杰 姜俊峰 段 赟

甘肅省腫瘤醫(yī)院血液腫瘤科，甘肅蘭州 730050

微小殘留病灶（minor residual disease，MRD）是導(dǎo)致白血病復(fù)發(fā)的根本原因，而免疫療法已成為清除白血病微小病變的主要手段之一。白血?。╨eukemia）在獲得完全緩解后進(jìn)行免疫治療可提高療效[1]。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）的發(fā)生過程中，其可彌補(bǔ)AML 細(xì)胞的缺陷，產(chǎn)生抗AML特異性的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞。一些中藥作為免疫調(diào)節(jié)劑，能夠促進(jìn)DC 的成熟，提高其抗腫瘤活性[2]。中藥墓頭回（Mutouhui，MTH）具有清熱解毒、消癰散結(jié)之功效，可用于治療腸道腫瘤、白血病等[3-5]，但MTH免疫治療白血病的作用機(jī)制還不清楚。因此，本研究將MTH 提取物體外作用于AML患者來源的DC，探討MTH 對促DC 成熟及功能的機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016～2018年甘肅省腫瘤醫(yī)院血液腫瘤科的15例AML 完全緩解患者，其中男8例，女7例；中位年齡29（15，43）歲；3例M2a，2例M2b，3例M3，1例M4，5例M5，1例M6。研究對象均簽署知情同意書，研究程序報(bào)甘肅省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離

抽取AML 完全緩解患者的骨髓10～20 mL（40 U/mL肝素抗凝），使用Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液（美國Sigma公司）梯度離心法分離骨髓單核細(xì)胞（bone marrow monocytes，BMC），收集BMC 于10 mL 離心管中，離心棄上清，加入含10%滅活胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）的RPMI1640 完全培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）重懸細(xì)胞，調(diào)整密度濃度為5×106/mL。

1.3 樹突細(xì)胞的培養(yǎng)與MTH 的成熟誘導(dǎo)

將BMC 加入培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，加入含1000 U/mL 集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）和500 U/mL rh IL-4的RPMI1640 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，隔日半量換液。其中1例AML 完全緩解患者BMC 在第6 天時(shí)收獲未成熟DC，以4×106/mL 密度接種48 孔板（1 mL/孔，共15 孔）。將未成熟DC分為對照組（control）、LPS 組（陽性對照，加入10 μg/mL LPS）、MTH（上海同田生物技術(shù)有限公司）多糖組、MTH 皂苷類組、MTH 萜類組，后三組又分0.001、0.010、0.100 μg/mL 亞組，對照組、LPS 組和各亞組分別設(shè)三個(gè)平行對照；繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察并收獲DC；同時(shí)收集培養(yǎng)上清，待測。

1.4 DC 的形態(tài)及免疫表型檢測

瑞氏-吉姆薩染色DC，倒置顯微鏡觀察DC。將待測細(xì)胞調(diào)至1×106/mL，取細(xì)胞懸液100 μL/管，分別加入15 μL PE 標(biāo)記鼠抗人單克隆抗體CD1a、CD86 及FITC 標(biāo)記鼠抗人單克隆抗體HLA-DR、CD80、CD83（購自美國Caltag 公司），混勻后置避光室溫下孵育30 min，用PBS 緩沖液洗滌2次，1000 r/min，5 min 離心洗滌后，1%多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀（FACS，美國Becton Dicknson 公司）檢測，數(shù)據(jù)用Cell Quest 軟件分析。

1.5 檢測DC 的IL-12（p70）分泌

按IL-12（p70）ELISA檢測試劑盒（美國Biosource公司）說明書檢測DC 上清液中IL-12 的含量，顯色后即刻用酶標(biāo)儀（Wellscan Mk3，美國Labsystems Dragon 公司）在450 nm 波長處檢測光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定IL-12 的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（美國IBM 公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M（P25，P75）]表示，或者經(jīng)過變量轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布后行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTH 對DC 形態(tài)的影響

將AML 完全緩解患者BMC 成功誘導(dǎo)為DC。分離的BMC 經(jīng)培養(yǎng)3 h 后，呈貼壁生長。在培養(yǎng)誘導(dǎo)1 d后，細(xì)胞較前略微增大。培養(yǎng)4 d 后，細(xì)胞聚集成簇，并向周圍伸出細(xì)小的樹突樣偽足。培養(yǎng)第7 天時(shí)，多數(shù)BMC 細(xì)胞已成為DC（圖1，封四）。加入MTH 培養(yǎng)2 d后，誘導(dǎo)的DC 發(fā)育成熟，懸浮在培養(yǎng)液中，可見細(xì)胞體積明顯變大，細(xì)胞周圍有明顯的絲狀樹突樣偽足（圖1，封四）。

2.2 DC 細(xì)胞膜表面標(biāo)志物的表達(dá)

LPS 組、MTH 多糖組和萜類組的表面標(biāo)志陽性表達(dá)率均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MTH多糖組0.100 μg/mL 亞組各DC 表面標(biāo)志物的陽性表達(dá)率與LPS 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；MTH萜類組各DC 表面標(biāo)志物的陽性表達(dá)率低于LPS 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MTH 皂苷類DC 表面標(biāo)志物的陽性表達(dá)率與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但低于LPS 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MTH 多糖組0.010 μg/mL 亞組的CD80、CD83、CD1a低于LPS 組，且低于0.100 μg/mL 亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），MTH 多糖組0.001 μg/mL 亞組的CD80、CD83、CD86、CD1a 低于LPS 組，且低于0.100 μg/mL亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；MTH 萜類組0.010 μg/mL亞組的CD86 低于0.100 μg/mL 亞組，0.001 μg/mL 亞組 的CD80、CD83、CD86、CD1a 低 于0.100 μ/mL 亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3 MTH 促進(jìn)DC 分泌IL-12

MTH 多糖、萜類組和LPS 組的促進(jìn)DC 分泌IL-12水平高于對照組（P<0.05），其中MTH 多糖和萜類組0.100 μg/mL 劑量亞組的分泌IL-12 水平高于0.001和0.010 μg/mL 劑量亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）；而皂苷組促進(jìn)DC 分泌IL-12 不顯著，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖2）。

3 討論

墓頭回別名腳汗草、擺子草、虎牙草，為敗醬屬植物異葉敗醬或糙葉敗醬的根莖和根，性涼，味苦，微酸澀。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載主治火熱、火瘡、熱毒、疥癬、瘙癢、癰疽、痔瘡、瘰疬[6]。MTH 墓頭回提取物主要有皂甙、多糖、萜類和揮發(fā)油等，其主要化學(xué)成分是環(huán)烯醚萜類、單環(huán)降倍半萜苷類、三萜皂苷類、單萜類龍腦苷、黃酮類等[7]。MTH 對移植性肝癌和艾氏癌具有抑制效應(yīng)[8]，并對分化型甲狀腺癌外周血多態(tài)性上皮黏蛋白1 陽性表達(dá)細(xì)胞具有抑制作用[9]，能抑制U14 移植瘤瘤體血管形成[10]。在MTH 誘導(dǎo)臍血基質(zhì)細(xì)胞形成及分泌GM-CSF 的研究表明，MTH 不僅是強(qiáng)抗癌物質(zhì)，也是造血祖細(xì)胞促進(jìn)劑[11]。

表1 各組DC 表面標(biāo)志物的陽性表達(dá)率（%，±s）

與對照組比較，*P<0.05；與LPS 組比較，▲P<0.05；與0.100 μg/mL MTH 同組劑量亞組比較，△P<0.05

組別 HLA-DR CD80 CD83 CD86 CD1a對照組LPS MTH 多糖（μg/mL）0.100 0.010 0.001 MTH 萜類（μg/mL）0.100 0.010 0.001 MTH 皂苷（μg/mL）0.100 0.010 0.001 20.17±13.36 75.09±13.32*13.43±10.23 70.35±12.24*12.37±11.27 80.14±17.49*19.34±16.21 79.53±21.46*14.03±10.39 74.46±20.67*78.08±15.34*68.34±26.19*57.40±25.21*72.23±15.54*43.19±17.23*▲△35.27±15.67*▲△77.34±26.13*46.17±15.80*▲△33.42±17.08*▲△82.25±17.46*66.57±16.54*53.26±23.15*▲△73.13±16.27*44.51±16.34*▲△35.13±17.54*▲△48.54±17.57*▲40.31±16.22*▲33.40±13.27*▲41.13±17.21*▲33.45±14.27*▲24.44±12.43*▲△43.33±16.18*▲31.17±13.34*▲23.11±11.32*▲△50.15±21.43*▲38.67±14.37*▲△35.17±13.45*▲△45.25±15.12*▲30.51±13.35*▲27.14±10.28*▲△20.18±13.12▲19.35±14.54▲19.12±14.44▲15.45±12.46▲16.09±13.43▲14.09±11.13▲16.37±14.13▲12.77±11.26▲12.46±10.38▲21.34±12.31▲19.26±15.16▲18.42±13.44▲14.49±10.67▲15.21±12.03▲16.45±12.31▲

圖2 MTH 各組DC 分泌IL-12 的水平（MTH：μg/mL）

AML 屬于髓系造血干細(xì)胞惡性腫瘤，由于腫瘤生長T 細(xì)胞克隆對AML 不應(yīng)答及T 細(xì)胞的殺傷活性低于AML 細(xì)胞增生，當(dāng)AML 在誘導(dǎo)緩解后進(jìn)行免疫治療可減少其復(fù)發(fā)[12]。已有研究報(bào)道，AML 細(xì)胞能分泌血管內(nèi)皮生長因子，抑制DC 的成熟，從而抑制其抗腫瘤效應(yīng)[13]。DC 作為抗原提呈細(xì)胞具有顯著抑制腫瘤的生長效應(yīng)，因此如何激活腫瘤發(fā)生過程中DC的功能，是當(dāng)前腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)[14-16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，MTH 多糖、萜類能明顯誘導(dǎo)DC 成熟，上調(diào)DC 細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)，刺激DC 分泌高水平的IL-12[17]。IL-12 能增加IFN-γ 的生產(chǎn)和刺激NK細(xì)胞、T 細(xì)胞的活化，也能增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞毒性對腫瘤細(xì)胞的作用[18-20]。DC 表面有Toll 樣受體、熱休克蛋白等受體；Dectin-1是DC 表面特異性受體，可識別具有β-1，3 與β-1，6 連接的葡聚糖，并與Toll樣受體有協(xié)同作用[21]。CD80、CD83、CD86 及CD1a 等是DC 細(xì)胞表面協(xié)同分子，能夠刺激CD4+T 淋巴細(xì)胞分化為Th1 細(xì)胞或Th2 細(xì)胞，并協(xié)同MHC-Ⅱ分子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用[22]。本研究顯示，MTH 能促進(jìn)DC細(xì)胞表面標(biāo)志物的CD80、CD83、CD86 及CD1a 表達(dá)陽性率上調(diào)，進(jìn)一步活化T 細(xì)胞，并促進(jìn)MHC-Ⅱ分子HLA-DR 的上調(diào)，促進(jìn)抗原遞呈。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MTH 多糖和萜類均可增強(qiáng)DC 的功能，增加IL-12 的產(chǎn)生，但本實(shí)驗(yàn)研究僅是體外實(shí)驗(yàn)，還需要進(jìn)一步通過動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)驗(yàn)證MTH 的臨床應(yīng)用價(jià)值。