梔子葉乙醇提取物對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞黑色素生成及酪氨酸酶活性的影響

黃 碩 劉 風(fēng)

廈門市第五醫(yī)院麻醉科，福建廈門 361101

近年來，由各種原因引起的色斑、皮膚衰老等問題受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注，而黑色素過度沉著是導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)色斑的主要原因[1]。黑素細(xì)胞中的酪氨酸酶調(diào)控黑色素的生成[2]，同時(shí)也是生物體合成黑色素起始反應(yīng)過程中最重要的限速酶[3]，因此，許多皮膚美白劑通過抑制酪氨酸酶活性抑制黑色素的生成來達(dá)到美白的功能[4]。由于天然產(chǎn)物具有安全、溫和、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)[5]，因而從天然植物中提取功效成分以改善皮膚色素沉積，已成為目前護(hù)膚產(chǎn)品開發(fā)的主要趨勢(shì)[6]。

梔子葉來源于茜草科植物梔子（Fructus Gardeniae）的干燥葉[7]。梔子分布于我國海拔10～1500 m 處的曠野、丘陵、山谷、山坡、溪邊的灌叢或林中[8]，其果實(shí)已收入《中國藥典》并廣泛應(yīng)用于臨床[9]。而其葉在我國廣西、四川等地民間廣泛應(yīng)用于治療燙傷、跌打損傷、血瘀等[10]。有報(bào)道稱，梔子葉含去羥梔子苷、梔子苷[11-12]。但到目前為止，國內(nèi)外對(duì)該屬植物的藥理研究還不夠系統(tǒng)和深入，梔子葉中有效成分的藥理學(xué)作用尚未充分揭示。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)梔子葉70%乙醇提取物對(duì)α-促黑色素細(xì)胞激素（α-MSH）誘導(dǎo)的B16黑色素瘤細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性及黑色素生成的作用，期望為梔子葉美白護(hù)膚功效產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料 梔子葉由廈門鷺燕大藥房有限公司提供，經(jīng)廈門市第五醫(yī)院藥劑科鑒定為茜草科植物梔子（Fructus Gardeniae） 的干燥葉，自然陰干后粉碎，過20 目篩，4℃儲(chǔ)藏備用。曲酸、二甲基亞砜、左旋多巴（L-DOPA）、α-MSH 均購自美國Sigma 公司。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素、胰蛋白酶（含0.02% EDTA）（購于Gibco 公司）。1.1.2 儀器 3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；Spectra Max M5型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)（上海繼譜電子科技有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph 公司）

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

B16黑色素瘤細(xì)胞購自于中科院上海細(xì)胞所。常規(guī)培養(yǎng)于含10% FBS、100 μg/mL 鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM 培養(yǎng)基，在5% CO2及37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞接種在96 孔及6 孔板的細(xì)胞密度分別為1×104cells/孔、2.5×105cells/孔，細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 梔子葉有效成分的提取方法

取梔子葉粉末10 g，晾干后，加入200 mL 70%乙醇，室溫浸泡40 min，采用水?。?5℃）回流提取1 h，過濾，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，回收乙醇，得到粗浸膏，將粗浸膏用冷凍干燥機(jī)干燥至凍干粉末狀，備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)分組：設(shè)置實(shí)驗(yàn)組（樣本為梔子葉70%乙醇提物）和陽性對(duì)照組（樣本為曲酸）。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組：設(shè)置空白組、模型組、陽性對(duì)照組和梔子葉70%乙醇提取物組[低濃度組（100 mg/L）、中濃度組（200 mg/L）、高濃度組（400 mg/L）]。梔子葉70%乙醇提取物組各組的藥物配置方法如下，取“1.3”項(xiàng)下的0.1 mg 提取物粉末溶于1 mL PBS 中，進(jìn)行溶液配制，得低濃度組；取“1.3”項(xiàng)下的0.2 mg 提取粉末溶于1 mL PBS 中，進(jìn)行溶液配制，得中濃度組；取“1.3”項(xiàng)下的0.3 mg 提取粉末溶于1 mL PBS 中，進(jìn)行溶液配制，得高濃度組。

1.5 采用左旋多巴氧化法檢測(cè)酪氨酸酶活性

如“1.4”項(xiàng)中所述，設(shè)置酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)分組，采用200 μL 反應(yīng)體系，將30 μL 蘑菇酪氨酸酶溶液（酶活力100 U/mL）和30 μL“1.3”項(xiàng)中所述的梔子葉70%乙醇提取物、曲酸和PBS分別加入96 孔板中，混合均勻，37℃孵育10 min 后，迅速加入左旋多巴溶液60 μL，混合均勻，連續(xù)30 min 檢測(cè)溶液在475 nm 處的吸光度值。

酪氨酸酶活性抑制率=[1-（T1-T2）/（C1-C2）]×100%。

式中：C1：未加樣品加酪氨酸酶的反應(yīng)液的吸光度；C2：未加樣品且未加酪氨酸酶的反應(yīng)液的吸光度；T1：加樣品和加酪氨酸酶的吸光度；T2：加樣品而未加酪氨酸酶的吸光度。

1.6 MTS 測(cè)定細(xì)胞活力

處于對(duì)數(shù)生長期的B16黑色素瘤細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)，每孔加入200 μL 含2% FBS DMEM 培養(yǎng)基稀釋過的不同濃度（100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg/L）的梔子葉70%乙醇提取物，孵育24 h，加入MTS 試劑，在37℃水浴反應(yīng)10 min，于5%CO2及37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)60 min，在490 nm 波長處測(cè)定吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=測(cè)定孔吸光值/對(duì)照吸光值×100%。

1.7 B16黑色素瘤細(xì)胞黑色素含量的測(cè)定

如“1.4”項(xiàng)中所述，設(shè)置細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組，將B16黑色素瘤細(xì)胞接種于6 孔板（密度為1×105/孔，每孔1.5 mL），于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，分別取 梔 子 葉70%乙 醇 提 取 物100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg/L 濃度然后用低、中、高三個(gè)濃度的梔子葉70%乙醇提取物（如“1.4”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分組所述）孵育B16黑色素瘤細(xì)胞72 h。B16黑色素瘤細(xì)胞黑色素含量的測(cè)定方法，按照文獻(xiàn)報(bào)道[13]進(jìn)行。

1.8 B16黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性

如“1.4”項(xiàng)中所述，設(shè)置細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組，將B16黑色素瘤細(xì)胞接種于6 孔板（密度為1×105/孔，每孔1.5 mL），于5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，然后用低、中、高三個(gè)濃度的梔子葉70%乙醇提取物（如“1.4”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)分組所述）孵育B16黑色素瘤細(xì)胞72 h。B16黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸活性的測(cè)定方法，按照文獻(xiàn)報(bào)道[13]進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prism 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用One way-ANOVA檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)（LSD-t 檢驗(yàn)）；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 梔子葉70%乙醇提取物和曲酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用

采用左旋多巴氧化法檢測(cè)蘑菇酪氨酸酶活性，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的梔子葉70%乙醇提取物對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性具有更強(qiáng)的抑制作用，其對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制作用的IC50為（0.157±0.044）mg/mL，陽性對(duì)照組的曲酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制作用的IC50為（0.054±0.018）mg/mL。

2.2 梔子葉70%乙醇提取物對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞活力的影響

分別取梔子葉70%乙醇提取物100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg/L 濃度，孵育B16黑色素瘤細(xì)胞72 h 后測(cè)定細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，隨梔子葉70%乙醇提取物濃度增高，細(xì)胞存活率逐漸降低，100～600 mg/L 濃度下，細(xì)胞存活率≥80%，視為無細(xì)胞毒性，即對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞無明顯毒性；100～400 mg/L 濃度時(shí)，B16黑色素瘤細(xì)胞的存活率>90%，提示100～400 mg/L 濃度的梔子葉70%乙醇提取物對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞的增殖沒有影響（圖1）。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用低濃度（100 mg/L）、中濃度（200 mg/L）和高濃度（400 mg/L）梔子葉70%乙醇提取物來進(jìn)行各項(xiàng)細(xì)胞學(xué)研究。

表1 梔子葉70%乙醇提取物和曲酸對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用

2.3 不同組別對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞黑色素含量的抑制作用

分別選取模型組、梔子葉70%乙醇提取物中濃度組以及曲酸陽性對(duì)照組，每組兩份平行組進(jìn)行試驗(yàn)，所得作用圖見圖2。

模型組的B16黑色素瘤細(xì)胞黑色素含量明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；梔子葉70%乙醇提物濃度依賴高度性地抑制B16黑色素瘤細(xì)胞黑色素的生成，梔子葉70%乙醇提取物中濃度組和高濃度組的B16黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)黑色素含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；曲酸顯著抑制B16黑色素瘤細(xì)胞黑素的生成，陽性對(duì)照組的B16黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)黑色素含量顯著低于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）（圖3）。

圖2 模型組、梔子葉70%乙醇提取物中濃度組、陽性對(duì)照組對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞黑素含量的作用

圖3 不同組別B16黑色素瘤細(xì)胞黑色素含量的比較

2.4 梔子葉70%乙醇提取物對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性的抑制作用

模型組B16黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸活性高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；梔子葉70%乙醇提物濃度依賴性地抑制B16黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性，梔子葉70%乙醇提取物中濃度組和高濃度組的B16黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；曲酸顯著抑制酪氨酸酶的活性，陽性對(duì)照組的B16黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性顯著低于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）（圖4）。

圖4 不同組別B16黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸活性的比較

3 討論

酪氨酸酶活性的過度增強(qiáng)，是導(dǎo)致黑色素異常積累的主要原因。因而，酪氨酸酶抑制劑的在護(hù)膚產(chǎn)品方面的的研究和開發(fā)受到了人們的廣泛關(guān)注。本研究通過檢測(cè)梔子葉70%乙醇提取物對(duì)底物左旋多巴的催化效果，間接反映酪氨酸酶的活性，結(jié)果顯示，梔子葉醇提物可抑制蘑菇酪氨酸酶活性，IC50為（0.157±0.044）mg/mL。采用MTS 檢測(cè)B16黑色素瘤細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，梔子葉70%乙醇提取物濃度在100～600 mg/L 時(shí)，對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞均無明顯毒性，100～400 mg/L 濃度時(shí)，B16黑色素瘤細(xì)胞的存活率>90%，因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用低濃度（100 mg/L）、中濃度（200 mg/L）和高濃度（400 mg/L）梔子葉70%乙醇提取物來進(jìn)行各項(xiàng)細(xì)胞學(xué)研究。

α-MSH是一種內(nèi)源性的神經(jīng)激素，由其前體激素阿片-黑皮素原（POMC）裂解而成[13]，這種由13個(gè)氨基酸組成的神經(jīng)內(nèi)分泌激素能夠促進(jìn)黑素細(xì)胞的分裂且增強(qiáng)黑素細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶表達(dá)及活性，促進(jìn)黑素生成[14]，已有研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)化細(xì)胞產(chǎn)生的α-MSH在體內(nèi)可能是黑素細(xì)胞的自然生長因子。在皮膚黑素細(xì)胞和毛囊存在多種生長因子和細(xì)胞因子以及它們的受體[15]。在本課題研究中，筆者探究梔子葉70%乙醇提取物對(duì)α-MSH 誘導(dǎo)的B16黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)黑色素生成和酪氨酸酶活性的作用，結(jié)果顯示，梔子葉乙醇提物濃度依賴性地抑制B16黑色素瘤細(xì)胞黑素的生成，梔子葉70%乙醇提取物中濃度組和高濃度組的B16黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)黑色素含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示梔子葉乙醇提物對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞的黑素生成具有抑制活性。同時(shí)，本研究結(jié)果還顯示，梔子葉乙醇提物濃度依賴性地抑制α-MSH 誘導(dǎo)后B16黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶的活性，梔子葉70%乙醇提取物中濃度組和高濃度組的B16黑色素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），由此可推斷梔子葉70%乙醇提取物通過直接抑制酪氨酸酶的活性降低B16黑色素瘤細(xì)胞中黑色素的生成。

綜上所述，梔子葉70%乙醇提取物是一種天然、安全和高效的黑色素合成抑制劑，為將其進(jìn)一步開發(fā)為皮膚美白劑或美白添加劑提供了理論依據(jù)。但仍有諸多疑慮，如梔子葉乙醇提取物的關(guān)鍵活性成分、對(duì)酪氨酸酶的具體抑制類型和結(jié)合方式等，有待進(jìn)一步探究。