木脂素的生物合成及其微生物法生產(chǎn)的研究進(jìn)展

王煉，吳迪，周景文

（江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

引 言

木脂素是一類由兩分子苯丙素單元氧化聚合而成的植物次級代謝產(chǎn)物。木脂素主要功能是保護(hù)植物避免遭受食草動(dòng)物和微生物的侵害，多具有抗細(xì)菌、抗病毒和抗真菌活性[1]。木脂素能抵御活性氧，保護(hù)種子中的油脂不被氧化。木脂素在月桂科植物中含量豐富，特別是潤楠屬、樟桂屬和甘蜜樹屬[2]。然而，植物天然產(chǎn)物通過植物生物質(zhì)加工獲得，需要持續(xù)的土地、水和時(shí)間投入。蟲害或極端天氣造成木脂素含量的不確定性影響了植物天然產(chǎn)物的加工提取[3]。

代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展，為微生物合成木脂素奠定了良好的基礎(chǔ)，如在大腸桿菌中合成木脂素的重要前體物松柏醇[4-5]和松脂素[6]，在釀酒酵母中合成松柏醇[7]和芝麻素[8]等。隨著木脂素在植物中的合成路徑不斷被解析，越來越多的人們關(guān)注采用微生物法合成木脂素的可行性。本文基于木脂素類化合物的結(jié)構(gòu)和生物合成路徑的解析，總結(jié)了當(dāng)前微生物法生產(chǎn)木脂素的研究進(jìn)展，并對如何進(jìn)一步提升微生物法合成木脂素類化合物的效率進(jìn)行了展望。

1 典型的木脂素類化合物

木脂素類化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)類型分為8種(圖1)：芳基萘(arylnaphthalene)、芳基四氫萘(aryltetralin)、雙并四氫呋喃(furofuran)、二芐基丁內(nèi)酯(dibenzylbutyrolactone)、二苯并環(huán)辛二烯(dibenzocyclooctadiene)、二芳基丁烷(dibenzylbutane)、二芐基丁酸乳酯(dibenzylbutyrolactol)、呋喃(furan)[9]。木脂素類化合物還能根據(jù)苯環(huán)和丙基側(cè)鏈的氧化程度分為3類：帶有C9(C9′)-氧的木脂素、無C9(C9′)-氧的木脂素和二羧酸木脂素。帶有C9(C9′)-氧的木脂素類研究最為廣泛，包括落葉松脂素(lariciresinol)、開環(huán)異落葉松脂素(secoisolaricisiresinol，SECO)、羅漢松脂素(matairesinol)等[10]。

1.1 芳基萘和芳基四氫萘類木脂素

芳基萘和芳基四氫萘類木脂素都具有顯著的生物活性，受到制藥工業(yè)的關(guān)注。其中，芳基萘木脂素是傳統(tǒng)中藥的成分，具有抗病毒、抗真菌、抗原生動(dòng)物和抗血小板等活性[11]，典型的芳基萘類木脂素包括山荷葉素和賽菊芋黃素；芳基四氫萘類木脂素在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被廣泛用于各種疾病的治療[12]，鬼臼毒素和南燭木樹脂酚是芳基四氫萘類木脂素的研究熱點(diǎn)。

山荷葉素(diphyllin，圖2)來源于丘生閉花木(Cleistanthus collinus)，可以作為新型V-ATPase 抑制劑來治療胃癌，并且抑制Wnt/β-catenin 信號傳導(dǎo)中LRP6 的磷酸化[13]。山荷葉素能抑制食道癌細(xì)胞系TE-1和ECA-109的增殖和誘導(dǎo)S期阻滯；其還能通過調(diào)控mTORC1/HIF-1α-/VEGF 途徑阻礙血液轉(zhuǎn)移[14]。此外，山荷葉素還能誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生來破壞沙門氏菌的生物膜[15]。

賽菊芋黃素(helioxanthin)從臺(tái)灣杉(Taiwania cryptomerioides Hayata)中分離得到。賽菊芋黃素能下調(diào)EGFR/ERK/c-fos 信號通路抑制COX-2表達(dá),激活p27誘導(dǎo)G2/M 細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖[16]。賽菊芋黃素還能抑制腦腫瘤轉(zhuǎn)移，阻止黑色素瘤和腦內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[17]。

鬼 臼 毒 素（podophyllotoxin）從 桃 兒 七(Podophyllum emodi Wall) 和足葉草(Podophyllum peltatum L.)等鬼臼類植物中分離得到[18]。它被用作很多著名的抗腫瘤藥物的合成前體，包括依托泊苷(etoposide)、依 托 泊 福(etopophos) 和 替 尼 泊 甙(teniposide)[19]。Bala 等[20]發(fā)現(xiàn)鬼臼毒素在釀酒酵母中能抗輻射，為其他生物的抗輻射研究奠定了基礎(chǔ)。Casey 等[21]利用亞砜構(gòu)建了簡短的立體選擇性鬼臼毒素全合成路徑，利用一鍋串聯(lián)共軛加成/醛醇/親電子芳族取代反應(yīng)合成四氫化萘。Huang等[22]從桃兒七的根莖分離得到的內(nèi)生菌TW5，發(fā)酵7 d后鬼臼毒素產(chǎn)量達(dá)到49.3 μg/g菌絲體干重。

圖1 木脂素的基本骨架Fig.1 Basic skeletons of lignans

圖2 典型木脂素的結(jié)構(gòu)Fig.2 The structures of typical lignans

南燭木樹脂酚(lyoniresinol)具有抗氧化和抗突變活性，能通過減少酪氨酸酶的蛋白表達(dá)和活性抑制黑色素生成[23]。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均表明南燭木樹脂酚可以在臨床皮膚治療中用作皮膚美白劑。南燭木樹脂酚可以從一些植物中提取，小果南燭提取出的產(chǎn)物的旋光性最高[24]。除了從植物提取外，還能通過纖維素酶水解南燭木樹脂酚糖苷合成。Takemoto 等[25]結(jié)合合成化學(xué)和植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法合成南燭木樹脂酚。

芳基四氫萘衍生物例如鬼臼毒素目前只能依靠植物提取，芳基四氫萘木脂素需求量的持續(xù)增加使得自然資源消耗殆盡。由于生物合成路徑尚未被完全解析，依靠化學(xué)合成法生產(chǎn)具有生物活性和對映體選擇性的產(chǎn)物成為主要的合成方式。

1.2 雙并四氫呋喃類木脂素

雙并四氫呋喃類木脂素含有2,6-二芳基-3,7-二氧雜雙環(huán)辛烷骨架，又被稱為雙環(huán)氧木脂素[26]。連接方式、取代基和構(gòu)型的不同造成雙并四氫呋喃類木脂素的種類十分豐富。結(jié)構(gòu)上的變化賦予了雙并四氫呋喃類木脂素抗氧化、抗炎和抗菌活性，具有代表性的化合物包括松脂素和芝麻素。

松脂素(pinoresinol)屬于雙并四氫呋喃類木脂素，在木本植物和纖維植物中含量較多。松脂素通過改變細(xì)胞的生理和形態(tài)，抑制大腸桿菌(Escherichia coli)、 綠 膿 桿 菌 (Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)的生長[27]。從接骨木屬植物(Sambucus williamsii)中分離出的松脂素表現(xiàn)出抗真菌特性，對人類紅細(xì)胞不會(huì)造成影響[28]。松脂素還能改善記憶障礙并促進(jìn)海馬LTP 的誘導(dǎo)，這可能和松脂素對AChE和鈣內(nèi)流的影響有關(guān)[29]。

芝麻素(sesamin)以松脂素為前體合成，是芝麻種子主要的雙并四氫呋喃木脂素。芝麻油中的木脂素主要包括芝麻素(0.1%～0.6%)、芝麻林素(sesamolin，0.25%～0.3%)、芝麻酚(sesamol)和芝麻素酚(sesaminol)，這些成分可以幫助細(xì)胞抵抗酸敗[30]。長期服用芝麻素酚被認(rèn)為可以抑制和阿爾茲海默癥相關(guān)的致病的胞外β-淀粉樣蛋白聚集[31]。它還可以被用作針對細(xì)胞周期蛋白D1 過表達(dá)癌癥的可能的抗癌藥物[32]。

在過去二十年里，很多天然來源的雙并四氫呋喃類木脂素被分離并鑒定出結(jié)構(gòu)。雖然雙并四氫呋喃類木脂素，例如松脂素可以從谷物、豆類、水果和蔬菜中分離，但是分離產(chǎn)物的效率和產(chǎn)量較低。在含有6%的蔗糖的培養(yǎng)基中，金鐘連翹(Forsythia x intermedia)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)(12±2)d 后，(+)-松脂素的對映體含量達(dá)到75%±5%[33]。隨著芝麻素及其衍生物的路徑被完全解析，人們可以嘗試在微生物細(xì)胞工廠中異源合成芝麻素。

1.3 二芐基丁內(nèi)酯類木脂素

二芐基丁內(nèi)酯類木脂素及其糖苷類化合物和它們的生理特性密切相關(guān)，其具有抗腫瘤、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)和抗炎等重要作用。羅漢松脂素和牛蒡酚是重要的二芐基丁內(nèi)酯類木脂素，均對癌細(xì)胞系表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性[34]。

羅漢松脂素（matairesinol）屬于二芐基丁內(nèi)酯類木脂素，存在于多種種子、蔬菜和水果中，具有抗氧化、抗雌激素、抗骨質(zhì)疏松等活性，能減少激素依賴型癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[35]。Choi 等[36]發(fā)現(xiàn)羅漢松脂素的抗骨質(zhì)疏松活性主要通過p38/ERK-NFATc1信號通路表現(xiàn)，而不是抗吸收行為。在大鼠和人的尿液中，羅漢松脂素被腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)化為腸二醇和腸內(nèi)酯。羅漢松脂素通過細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，對急性淋巴細(xì)胞白血病CCRF-CEM 細(xì)胞系產(chǎn)生細(xì)胞毒性[37]。瑞香和芫花被證實(shí)是通過開環(huán)異落葉松脂素脫氫酶(SDH)催化合成(+)-羅漢松脂素[38]。傳統(tǒng)的阿魏酸的氧化偶聯(lián)反應(yīng)合成羅漢松脂素產(chǎn)量較低，Zhu等[39]利用區(qū)域選擇性氧化偶聯(lián)，以5-(叔丁基)-阿魏酸為前體合成羅漢松脂素，轉(zhuǎn)化率高達(dá)91%。

牛蒡酚(arctigenin)屬于二芐基丁內(nèi)酯類木脂素，分布于巴丹果、雪蓮花、香榧和椰菜等，是牛蒡(Arctium lappa L.)種子的主要生物活性成分。利用牛蒡酚對原發(fā)性高血壓大鼠進(jìn)行長期治療，可以明顯降低收縮血壓，改善大鼠的內(nèi)皮功能障礙[40]。牛蒡酚通過STAT3 抑制作用增強(qiáng)癌細(xì)胞對順鉑的敏感性，促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的癌細(xì)胞死亡[41]。此外，牛蒡酚還可以穿過血腦屏障，在大腦中與海藻酸鹽敏感的離子型谷氨酸受體相互作用[42]。因此，牛蒡酚還能作為抑制谷氨酸誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)的潛在藥物。

羅漢松脂素被證實(shí)通過開環(huán)異落葉松脂素脫氫酶催化SECO 的合成[38]；然而，牛蒡酚的生物合成路徑尚未解析，主要依賴于植物提取。天然的二芐基丁內(nèi)酯類木脂素化合物及其衍生物為抗癌藥物的研發(fā)和篩選提供了豐富的資源庫。

1.4 其他木脂素類化合物

除了前面討論的芳基萘和芳基四氫萘類木脂素、雙并四氫呋喃類木脂素和二芐基丁內(nèi)酯類木脂素(表1)，還有很多其他木脂素類化合物同樣具有重要的藥用價(jià)值。本文分別以五加胡前素、葉下珠脂素、蓽澄茄素和落葉松脂素介紹二苯并環(huán)辛二烯木脂素、二芳基丁烷類木脂素、二芐基丁酸乳酯類木脂素和呋喃類木脂素的基本性質(zhì)、來源及藥用價(jià)值。

五加前胡素(steganacin)屬于天然的二苯并環(huán)辛二烯木脂素，于1973 年從劍葉菊(Steganotaenia araliacea)中分離。與微管蛋白中的秋水仙堿位點(diǎn)結(jié)合后，五加前胡素在體內(nèi)表現(xiàn)弱的抗腫瘤活性[43]。五加前胡素的研究鮮有報(bào)道，目前尚未用于藥物治療。這可能是由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、合成難度大導(dǎo)致五加前胡素的產(chǎn)量極低。Augros 等[44]報(bào)道了五加前胡素中間產(chǎn)物的無過渡金屬的合成方式。五加前胡素的功能研究和藥物應(yīng)用有待于其生物合成路徑的解析和化學(xué)合成法的探索。

葉下珠脂素(phyllanthin)屬于二芳基丁烷類木脂素，從大戟科植物葉下珠(Phyllanthus amarus)中分離。Ooi 等[45]發(fā)現(xiàn)葉下珠脂素通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制HepG2 的細(xì)胞增殖。Lam 等[46]構(gòu)建了殼聚糖基微膠囊包裹葉下珠脂素，含有葉下珠脂素的微膠囊分別對人成纖維細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞、金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出更高的抗氧化能力和生長抑制效果。Dunkoksung 等[47]探究了葉下珠脂素穿過極化Caco-2 的吸收能力和P-糖蛋白(P-gp)介導(dǎo)的藥物互作中的潛在作用；葉下珠脂素能通過跨細(xì)胞途徑被動(dòng)擴(kuò)散，干擾其他共同運(yùn)輸?shù)乃幬锏霓D(zhuǎn)運(yùn)。

表1 木脂素的種類及其典型化合物的基本性質(zhì)Table 1 The categories of lignans and the basic characters of typical compounds

蓽澄茄素(cubebin)屬于二芐基丁酸乳酯類木脂素，分布在部分植物的木材、根和樹脂，具有鎮(zhèn)痛、消炎、抗錐蟲的活性[48]。蓽澄茄素及其內(nèi)酯和酰胺基衍生物具有顯著的抗癌活性，Rajalekshmi 等[49]通過體外實(shí)驗(yàn)檢測了蓽澄茄來源的(-)-蓽澄茄素及其衍生物對6 種人類癌細(xì)胞系(A549、K562、SiHa、KB、HCT116 和HT29)的抗癌活性。在部分被測試細(xì)胞系中，酰胺基衍生物表現(xiàn)出更高的抗癌活性。Niwa等[50]研究了(-)-蓽澄茄素對人肝癌細(xì)胞系的細(xì)胞毒性、致突變性和p38 MAP 激酶與GSTa2 的表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)只有高濃度的蓽澄茄素導(dǎo)致明顯的細(xì)胞毒性。

落葉松脂素（lariciresinol）屬于呋喃類木脂素，具有抗菌、抗氧化、抗炎和抗雌激素等生物活性[51]。Bajpai等[52]從菲律賓茜草(Rubia philippinensis)分離出落葉松脂素，檢測其針對食源性病原體金黃色葡萄球菌KCTC1621 和大腸桿菌O157∶H7 的抗菌能力。通過最低抑菌濃度(MIC)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過落葉松脂素處理的金黃色葡萄球菌KCTC1621 和大腸桿菌O157∶H7 的細(xì)胞壁形態(tài)遭到破壞。落葉松脂素還能破壞真菌質(zhì)膜，抑制人類病原性真菌[53]。此外，落葉松脂素可能通過激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑抑制肝癌HepG2細(xì)胞[54]。

除了落葉松脂素，其他木脂素類化合物的研究主要限制于植物來源的低豐度。目前，已經(jīng)篩選到一些菌株可以實(shí)現(xiàn)木脂素的轉(zhuǎn)化，例如(-)-蓽澄茄素還能通過土曲霉(Aspergillus terreus)和黑曲霉(Aspergillus niger)轉(zhuǎn)化為(-)-扁柏脂素和(-)-parabenzlactone，能顯著抑制口腔病原菌[55]；Xie 等[56]從人的糞便中篩選得到糞腸球菌(Enterococcus faecalis)PDG-1，可以將(+)-松脂素轉(zhuǎn)變?yōu)?+)-落葉松脂素。微生物合成法相比植物提取法，生產(chǎn)周期更短、產(chǎn)物濃度更高，是一種高效的生產(chǎn)替代方式。然而，大部分木脂素化合物的合成路徑尚未解析，限制了微生物合成法的應(yīng)用。

2 木脂素類化合物的生物合成途徑

木脂素的生物合成引起了廣泛關(guān)注，其原因包括：(1)木脂素的生物合成涉及獨(dú)特的立體化學(xué)性質(zhì)；(2)木脂素具有很多重要的臨床生物活性；(3)木脂素及其衍生物，如去甲木脂素通過生物合成大量積累在樹的心材區(qū)域[10]。苯丙氨酸和酪氨酸是單寧、木質(zhì)素和木脂素合成的前體。苯丙氨酸通過苯丙氨酸解氨酶生成肉桂酸(圖3)，接著經(jīng)過肉桂酸-4-羥化酶催化生成對香豆酸，或者以酪氨酸為底物通過酪氨酸解氨酶生成對香豆酸；再通過連續(xù)的羥基化、甲基化和還原反應(yīng)生成咖啡酸、阿魏酸、松柏醇，最終得到松脂素[30]。由于其他木脂素類化合物的合成路線目前尚未被報(bào)道，本節(jié)主要介紹芝麻素及其衍生物、亞麻木酚素的生物合成路徑。

2.1 芝麻素及其衍生物的生物合成路徑

圖3 植物松脂素合成途徑Fig.3 The synthesis pathway of pinoresinol in plants

芝麻(胡麻科，芝麻屬)富含各種生物活性物質(zhì)，包括木脂素、生育酚類似物、植物甾醇等。在芝麻種子里，兩分子松脂素之間形成亞甲基二氧橋合成(+)-胡椒醇，再以相同的方式合成(+)-芝麻素。Ono等[8]發(fā)現(xiàn)芝麻中(+)-芝麻素和(+)-胡椒醇的合成(圖4)都是經(jīng)過CYP81Q1 催化。經(jīng)比較，CYP81Q1 和同樣催化亞甲二氧橋形成的CYP719A1的氨基酸序列一致性只有24%。CYP81Q1 在芝麻中還存在兩種同源蛋白，分別是S.radiatum 來源的CYP81Q2 和S.alatum 來源的CYP81Q3。兩種蛋白和CYP81Q1 的結(jié)構(gòu)相似，只有CYP81Q2 和CYP81Q1 表現(xiàn)出相同的NADPH 依賴型胡椒醇合成酶活性。利用LC-MS檢測S. alatum 的木脂素組成，主要有(+)-2-episesalatin、(+)-alatumin 和(+)-新木脂體柄果脂素[57]。共表達(dá)CYP81Q3和細(xì)胞色素還原酶(CPR1)的酵母細(xì)胞，加入(+)-表松脂素，被徹底轉(zhuǎn)化為(+)-新木脂體柄果脂素[57]。

圖4 芝麻素及其衍生物的天然合成路徑Fig.4 The native biosynthesis of sesamin and derivatives

芝麻林素的合成需要在呋喃和苯環(huán)之間插入非典型氧[58]，這個(gè)反應(yīng)只在橢苞爵床(Justicia simplex)[59]和透骨草(Phryma leptostachya)中觀察到[60]。人們推測芝麻林素酚(sesamolinol)形成亞甲基二氧橋后轉(zhuǎn)化為芝麻林素。收集表達(dá)CYP81Q1 釀酒酵母的微粒體，與芝麻林素酚和NADPH 混合，產(chǎn)物中沒有檢測到芝麻林素。Murata 等[58]綜合遺傳、組學(xué)等方法鑒定了P450 單加氧酶CYP92B14 負(fù)責(zé)芝麻素加氧形成芝麻林素和芝麻素酚。以7R,7′S-samin為起始材料合成的呋喃木酚素和黃酮木酚素具有β-糖苷酶和自由基抑制活性。Tsai等[61]以芝麻林素為底物，通過酸催化合成了7R,7′S-samin；加入H2O2后，7R,7′S-samin轉(zhuǎn)化為7R,7′R-samin。

芝麻素酚三糖苷合成的關(guān)鍵酶的鑒定過程困難，影響因素包括：(1)芝麻的遺傳和基因組信息缺少；(2)大多數(shù)種子植物中的尿苷二磷酸(uridine diphosphate，UDP)-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞色素P450的同源基因較多；(3)很多底物或者中間產(chǎn)物含量低，缺乏用于體外實(shí)驗(yàn)的商業(yè)化產(chǎn)品。Ono 等[62]通過多維組學(xué)的方法找到了一種新的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，UGT94AG1 可以催化芝麻素酚三糖苷的形成。通過酵母雙雜實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，UGT71A9、UGT94AG1 和UGT94AA2 與膜結(jié)合蛋白CYP81G1相互作用，完成三糖苷的合成。

2.2 亞麻木酚素的生物合成路徑

大部分木脂素以糖基化形式存在于植物中，比如前面提及的芝麻素酚三糖苷。亞麻木酚素，又稱開環(huán)異落葉松脂素二葡萄糖苷(secoisolariciresinol diglucoside，SDG)，屬于亞麻籽中的糖基化木脂素。SDG 具有保護(hù)機(jī)體免受心血管疾病、糖尿病、癌癥和精神壓力的影響的特性[63]。SDG 還能被轉(zhuǎn)化為哺乳動(dòng)物木脂素，具有作為抗癌藥物的潛力[64]。

松脂素首先通過雙功能的NADPH 依賴型松脂素/落葉松脂素還原酶(PLR)轉(zhuǎn)化為落葉松脂素和SECO(圖5)。von Heimendahl 等[65]從L.album 中分離出編碼PLR 的基因，通過異源表達(dá)證明其具備催化(+)-松脂素轉(zhuǎn)化為(-)-SECO 的能力。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和代謝產(chǎn)物分析發(fā)現(xiàn)菘藍(lán)(Isatis indigotica)中l(wèi)iPLR1對落葉松脂素的合成至關(guān)重要，而且通過RNA 干擾抑制liPLR1的表達(dá)顯著影響落葉松脂素合成[51]。擬南芥中的AtPLR 對松脂素表現(xiàn)出嚴(yán)格的偏好性，而對落葉松脂素的偏好性較低甚至無活性，這和其他植物來源的PLR 差異較大[10]。底物偏好性分析表明，擬南芥松脂素還原酶1(AtPrR1)可以利用(±)-松脂素為底物，AtPrR2只能利用(-)-松脂素。此外，來源于亞麻的轉(zhuǎn)錄因子LuWRKY36 通過其N 端的WRKY域和LuPLR1 啟動(dòng)子的W 盒結(jié)合，上調(diào)LuPLR1 的表達(dá)[66]。

亞麻籽中的木脂素主要以糖基化形式存在，表明體內(nèi)存在有關(guān)的酶負(fù)責(zé)SECO 的糖基化[67]。植物的糖基轉(zhuǎn)移酶是尿苷糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)，屬于家族1糖基轉(zhuǎn)移酶[68]。Barvkar 等[69]證明亞麻中存在137 種UGT，并認(rèn)為UGT74S1 是催化種皮中SDG 合成的SECO 糖基轉(zhuǎn)移酶。Ghose 等[70]發(fā)現(xiàn)只有UGT74S1才能和UDP-葡萄糖反應(yīng)合成開環(huán)異落葉松脂素單葡萄糖苷和SDG。Li等[71]從脫脂亞麻籽中分離和鑒定了可以在非嚴(yán)格厭氧條件下利用SDG 合成SECO的菌株，轉(zhuǎn)化效率超過80%。

3 木脂素類化合物的微生物法生產(chǎn)

微生物法生產(chǎn)植物天然產(chǎn)物具有很多優(yōu)點(diǎn)，包括：(1)根據(jù)微生物細(xì)胞合成能力按需合成產(chǎn)品；(2)發(fā)酵工藝可以放大并且易于控制；(3)能合成比天然植物宿主純度和產(chǎn)量更高的植物天然產(chǎn)物及其中間代謝產(chǎn)物[3]。近年來，天然產(chǎn)物合成得到迅猛發(fā)展，比如利用釀酒酵母實(shí)現(xiàn)了大麻素和非天然結(jié)構(gòu)類似物的從頭合成[72]，利用大腸桿菌成功合成紫杉醇前體紫杉二烯[73]和紫杉二烯氧化產(chǎn)物[74]。目前，松柏醇和松脂素的微生物法生產(chǎn)為復(fù)雜的木脂素化合物的生物合成奠定了良好的基礎(chǔ)。

3.1 木脂素前體物質(zhì)合成的強(qiáng)化

松柏醇是一種天然的木質(zhì)素單體，參與木質(zhì)素、木脂素和黃酮木脂素的合成。松柏醇目前有兩種生產(chǎn)方式：化學(xué)合成法和微生物合成法。還原阿魏酸乙酯生產(chǎn)松柏醇是最常見的合成方式，這種方法原料和催化劑昂貴，反應(yīng)條件苛刻，總收率低。此外，化學(xué)合成法還包括以阿魏酸、香草醛和乙酰阿魏酸為底物的合成方式，低產(chǎn)率和收率嚴(yán)重限制應(yīng)用。

利用微生物法生產(chǎn)松柏醇反應(yīng)條件溫和，合成產(chǎn)物的專一性高，具體方法包括酶法合成和從頭合成。Lv 等[4]以廉價(jià)的丁香酚為底物，在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)簡青霉來源的香草醇氧化酶PsVAO 合成松柏醇。PsVAO 在催化過程釋放有害副產(chǎn)物H2O2，過量的H2O2積累會(huì)導(dǎo)致PsVAO 的活性受到抑制和細(xì)胞毒性。因?yàn)檫^氧化氫酶具備高過氧化氫酶活性和低過氧化物酶活性，所以選擇將不同來源的過氧化氫酶引入生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。通過過氧化氫酶原位消除H2O2能解除H2O2對PsVAO 的限制、提高松柏醇產(chǎn)量和防止松柏醇過度氧化。最終，松柏醇的產(chǎn)量為22.9 g/L，轉(zhuǎn)化率為78.7%。Aschenbrenner 等[75]在大腸桿菌體內(nèi)構(gòu)建了木質(zhì)素單體的合成路徑，加入2.5 mmol/L阿魏酸后，可以得到1.82 mmol/L松柏醇，遠(yuǎn)高于其他肉桂酸衍生物的轉(zhuǎn)化效率。Chen 等[5]根據(jù)植物體內(nèi)松柏醇合成路徑在大腸桿菌體內(nèi)組合表達(dá)了TAL、4CL1、CCR 和ADH 實(shí)現(xiàn)對香豆醇的合成。然后，采用活性更高的HpaBC 替代植物來源的C3H 催化對香豆醇向咖啡醇的轉(zhuǎn)化?？紤]到HpaBC 偏好以對香豆醇為底物，在發(fā)酵過程中優(yōu)先積累對香豆醇。最終采用微生物共培養(yǎng)在大腸桿菌中重構(gòu)松柏醇的從頭合成路徑，在2.5 L生物反應(yīng)器上放大生產(chǎn)得到(124.9 ± 5.1) mg/L 松柏醇和(232.9±15.1)mg/L 咖啡醇。Yang 等[7]在釀酒酵母中從頭合成松柏醇時(shí)，選擇首先合成阿魏酸，通過將AtCOMT1、PaHpaB 和EcHpaC 整合到Ty4 位點(diǎn)后，再共表達(dá)At4CL5、AtCAD5 和AtCCR1，并結(jié)合NADPH的強(qiáng)化過表達(dá)zwf1和TYR1，松柏醇在搖瓶水平的積累量46.6 mg/L。在5 L 生物反應(yīng)器中放大生產(chǎn)，釀酒酵母最終積累201.1 mg/L 松柏醇。酶法合成能夠獲得較高的松柏醇產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化效率；從頭合成為工程菌株工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能性。

圖5 亞麻木酚素和鬼臼毒素的生物合成路徑Fig.5 The biosynthetic pathway of secoisolariciresinol diglucoside and podophyllotoxin

在植物體內(nèi)，兩分子松柏醇通過同化蛋白的催化生成松脂素。松柏醇的高效微生物合成為松脂素合成奠定了基礎(chǔ)。目前，松脂素的合成以酶法生產(chǎn)為主。酶催化中通過級聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的一步合成具有很多優(yōu)勢，包括省時(shí)、省力、簡化多步反應(yīng)，避免中間產(chǎn)物的分離和純化。Ricklefs 等[76]構(gòu)建了香草醇氧化酶和漆酶偶聯(lián)的兩步一鍋法，利用丁香酚通過以松柏醇為中間產(chǎn)物合成松脂素。首先通過簡青霉來源的香草醇氧化酶PsVAO 和不同類型的細(xì)菌來源的漆酶共表達(dá)篩選最佳的合成松脂素的組合。再通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，松脂素最高產(chǎn)量達(dá)到1.6 g/L。在前期酶催化的基礎(chǔ)上，Ricklefs等[77]構(gòu)建了三步一鍋法，利用全細(xì)胞催化合成了ee值高達(dá)98%的(+)-松脂素，通過表達(dá)金鐘連翹來源的松脂素/落葉松脂素還原酶(FiPLR)獲得了ee 值高達(dá)97%的(+)-松脂素。Lv 等[6]在體內(nèi)構(gòu)建了PsVAO和過氧化物酶共表達(dá)的體內(nèi)H2O2自消除的松柏醇合成體系。為了平衡代謝流，PsVAO 和過氧化物酶采用不同的連接方式進(jìn)行表達(dá)。通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，松脂素的產(chǎn)量達(dá)到11.29 g/L，轉(zhuǎn)化率為52.77%。在大腸桿菌中表達(dá)的過氧化物酶大部分屬于apo-蛋白，培養(yǎng)基中添加適量的5-氨基乙酰丙酸可以增加全蛋白的合成[78]。因此，增加大腸桿菌胞內(nèi)血紅素合成可以提高過氧化物酶的活性。令人意外的是，在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)不同拷貝數(shù)的hemA 和hemL 基因時(shí)，松脂素的產(chǎn)量均下降。利用過氧化物酶偶聯(lián)PsVAO 合成松脂素的過程還需要考慮從其他角度優(yōu)化代謝過程，比如阻斷血紅素降解途徑[79]增加血紅素和過氧化物酶的結(jié)合，進(jìn)一步提高丁香酚向松脂素的轉(zhuǎn)化效率。

3.2 芝麻素的酶法合成

木脂素化合物的合成主要通過植物提取法，微生物法生產(chǎn)鮮有報(bào)道。木脂素化合物的研究集中在木脂素化合物的衍生化、藥用價(jià)值和代謝路徑的解析。芝麻素及其衍生物的關(guān)鍵酶在釀酒酵母和大腸桿菌中的功能鑒定為木脂素的微生物法生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。 Ono 等[8]在酵母INVsc 中表達(dá)CYP81Q1 后收集微粒體，并加入輔因子NADPH 和(+)-松脂素，反應(yīng)結(jié)束后通過HPLC 檢測到(+)-胡椒醇和(+)-芝麻素的生成。Murata 等[58]從表達(dá)CYP92B14 和CPR1酵母細(xì)胞提取的微粒體，可以將芝麻素轉(zhuǎn)化為芝麻林素和芝麻素酚。通過比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CYP92B14 和CPR1 共表達(dá)時(shí)，催化活性會(huì)顯著提高；當(dāng)CYP92B14 單獨(dú)表達(dá)時(shí)，只有微量的芝麻林素合成。以芝麻素為底物時(shí)，共表達(dá)CYP81Q1、CYP92B14和CPR1的酵母比單獨(dú)表達(dá)CYP92B14和CPR1 的細(xì)胞積累更多的芝麻林素和芝麻素酚，而且底物被完全消耗。另一方面，CYP81Q1 不能單獨(dú)作用于芝麻素，CYP92B14 不能單獨(dú)作用于松脂素和胡椒醇。CYP92B14和CYP81Q1在功能上的聯(lián)系說明功能互作的酶類存在新的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。Chandra 等[80]在大腸桿菌中表達(dá)純化CYP81Q1 和CPR1 用于芝麻素的體外合成。在CPR1 存在的條件下，CYP81Q1 催化松脂素合成芝麻素的能力大幅度提升?？紤]到PLR 或者是其他合成木脂素相關(guān)的細(xì)胞色素P450 基因?qū)儆贜ADPH 依賴型，還需要進(jìn)一步提高細(xì)胞內(nèi)NADPH/NADP+的比例[81-83]，兼顧細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的平衡關(guān)系。此外，表達(dá)細(xì)胞色素P450 時(shí)還需要篩選合適的CPR 優(yōu)化蛋白的表達(dá)水平[84]。

3.3 鬼臼毒素的微生物合成

目前，能用于植物法提取鬼臼毒素的植物種類稀少，包括桃兒七、足葉草的根莖。由于植物生長緩慢，而鬼臼毒素的需求量大，人們嘗試通過多種化學(xué)合成的方法生產(chǎn)鬼臼毒素。但是，化學(xué)合成法的產(chǎn)量低、成本高，不足以實(shí)現(xiàn)鬼臼毒素的商業(yè)化生產(chǎn)。鬼臼毒素的生物合成路徑未被完全解析，無法在微生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)鬼臼毒素的異源合成。在植物體內(nèi)，松脂素通過PLR 催化連續(xù)轉(zhuǎn)化為落葉松脂素和SECO，SECO 通過SDH 催化生成羅漢松脂素，羅漢松脂素經(jīng)過一些尚未鑒定的步驟最終合成鬼臼毒素。Kuo 等[85]通過構(gòu)建PLR 和SDH 的融合蛋白并在大腸桿菌中表達(dá)，以松脂素為底物合成羅漢松脂素(圖5)的轉(zhuǎn)化率能達(dá)到49.8%。從足葉草的根莖中分離出的內(nèi)生真菌Phialocephala podophylli(菌株P(guān)PE7)在肉湯培養(yǎng)基中生長，能積累可檢測的鬼臼毒素。Arneaud 等[86]從PPE7基因組中克隆得到編碼SDH 的基因，在畢赤酵母(Pichia pastoris)體內(nèi)成功實(shí)現(xiàn)SDH 的異源表達(dá)，并檢測到羅漢松脂素的生成。Marques 等[87]對桃兒七和足葉草進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析，分別篩選到了負(fù)責(zé)催化pluviatolide 生成的CYP719A23 和CYP719A24。這種策略有利于鬼臼毒素后續(xù)反應(yīng)的關(guān)鍵酶的鑒定，也為其他復(fù)雜木脂素化合物合成路徑的解析提供參考。

4 結(jié)論與展望

木脂素在植物界廣泛存在，在藥物和食物中應(yīng)用較多，富含木脂素的食物可以降低患癌的風(fēng)險(xiǎn)。木脂素及其衍生物的有機(jī)合成已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注。遺憾的是，大部分木脂素的合成路徑解析尚未完成。例如，鬼臼毒素的合成路徑解析目前停留在(-)-pluviatolide。克隆和表征復(fù)雜木脂素的關(guān)鍵合成酶是實(shí)現(xiàn)微生物高效合成木脂素的基礎(chǔ)。目前，基因組測序發(fā)展到了納米孔測序，測序長度和速度進(jìn)一步提升，為木脂素合成路徑的解析提供了更有力的支持。

利用酶法合成木脂素前體物的催化效率，能結(jié)合代謝工程和合成生物學(xué)的策略進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)優(yōu)化。以廉價(jià)的丁香酚為底物，利用PsVAO 分別偶聯(lián)過氧化氫酶和過氧化物酶催化生成木脂素前體物松柏醇或松脂素產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到較高水平，但是轉(zhuǎn)化效率依然受到限制。一方面，催化體系的酶活可能限制了丁香酚的轉(zhuǎn)化效率；另一方面，不同酶的表達(dá)強(qiáng)度的比例可能沒有達(dá)到最佳水平。松柏醇的從頭合成路徑需要篩選更加高效的甲基轉(zhuǎn)移酶，表達(dá)S-腺苷甲硫氨酸合成酶編碼基因metK 促進(jìn)胞內(nèi)甲基供體的合成來提高中間產(chǎn)物阿魏酸的合成速率。

通過大腸桿菌實(shí)現(xiàn)松脂素向羅漢松脂素在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化效率依然受到明顯的限制，還需要進(jìn)一步優(yōu)化代謝路徑，比如挖掘更高效的PLR 和SDH提高羅漢松脂素的產(chǎn)率，選擇合適的連接肽[88]優(yōu)化PLR 和SDH 的表達(dá)水平。目前，基因片段的高效組裝[89]、模式微生物的啟動(dòng)子文庫的構(gòu)建和篩選[90-92]、高效的基因組編輯[93]和蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)等為微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建提供了優(yōu)良的條件。木脂素合成代謝路徑的解析和微生物細(xì)胞工廠的優(yōu)化，勢必為木脂素在微生物中的合成開啟新的時(shí)代。