谷物和飼料中真菌毒素的危害、降解及其檢測技術(shù)*

蘇紅梅，滕安然，李力

（福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350117）

真菌毒素是由絲狀真菌產(chǎn)生的一系列次生代謝天然產(chǎn)物，人體、動物、農(nóng)作物及飼料都深受真菌毒素的污染，真菌毒素已經(jīng)嚴(yán)重地影響了我們的生活。目前已被科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)的真菌毒素有400多種，雖然它們都表現(xiàn)出不同的生理生化性質(zhì)，但是都有毒性，具有致癌、致突變等性質(zhì)，據(jù)了解人和動物免疫系統(tǒng)的紊亂與真菌毒素有一定的關(guān)系[1]。第一次發(fā)現(xiàn)真菌毒素是在二十世紀(jì)六十年代，英國10萬多只火雞死于“火雞X病”，當(dāng)時(shí)用“真菌毒素”來表示這種物質(zhì)，后來證明黃曲霉毒素B1是導(dǎo)致火雞得“火雞X病”的主要原因?，F(xiàn)在，真菌毒素并不只指黃曲霉毒素B1，而是指真菌產(chǎn)生的有害作用的全部次級代謝產(chǎn)物，統(tǒng)稱為“真菌毒素”。真菌毒素不僅對人和動物的健康造成威脅，同時(shí)給農(nóng)業(yè)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展也造成了嚴(yán)重的影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，真菌毒素每年污染的農(nóng)作物達(dá)到了全球的25%，給農(nóng)業(yè)和各國的經(jīng)濟(jì)都帶來了很大的壓力[2]。由于真菌毒素污染我國每年糧食減產(chǎn)3%～7%，糧食在生產(chǎn)、運(yùn)輸、銷售等過程中都可能被真菌毒素所污染，并且嚴(yán)重的年份會導(dǎo)致糧食大量減產(chǎn)[3]。所以，控制和降低真菌毒素對人類和動物的影響，是科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)，也是一直努力在做的事情。

1 谷物和飼料中常見的真菌毒素及危害

谷物和飼料中常見的真菌毒素主要有霉菌毒素，包括玉米赤霉烯醇、赭曲霉毒素、黃曲霉毒3種，另外，本文還介紹2種常見的真菌毒素——伏馬毒素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。這5種真菌毒素是目前發(fā)現(xiàn)的對谷物、飼料、動物和人類危害最大的真菌毒素。

1.1 玉米赤霉烯醇

玉米赤霉烯醇（zearalenone，ZEN）是由鐮刀霉菌屬產(chǎn)生的具有一系列衍生物的真菌毒素。是目前發(fā)現(xiàn)的分布最廣泛的真菌毒素，常見于玉米、高粱、小麥中。ZEN是一種具強(qiáng)耐熱性的真菌毒素，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)要使得其完全破壞需在110 ℃高溫處理1 h。ZEN的污染就像食物鏈一樣，從谷物、飼料到動物，從動物到人類，嚴(yán)重威脅人和動物健康。ZEN導(dǎo)致雌激素在體內(nèi)積累進(jìn)而影響動物的生長繁殖[4]。 1962年Stob等[5]從發(fā)霉的玉米中第一次純化了出ZEN，1966年Urry等[6]確定了酚的二羥基苯酸內(nèi)酯是ZEN的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分子式為C18H23O5，結(jié)構(gòu)式見圖1。ZEN經(jīng)代謝可產(chǎn)生α-ZOL、β-ZOL、ZAN、α-ZAL、β-ZAL等一系列衍生物，這些衍生物與ZEN一樣也會對人體和動物的健康造成威脅，是最危險(xiǎn)的食品污染源之一，也是強(qiáng)致癌性真菌毒素。我國在食品中對ZEN含量都做了相關(guān)規(guī)定，為小于60μg/kg[7]。

圖1 玉米赤霉烯醇ZEN結(jié)構(gòu)式

1.2 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素（ochratoxin，OT）是由曲霉屬和青霉屬產(chǎn)生的系列化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的衍生物，分別有OTA、OTB、OTC、OTα，其中在自然界分布最廣且最具毒性的是OTA，它的結(jié)構(gòu)式如圖2。

1965年Vandermerwe課題組便從赭曲霉菌純化得到，幾種類似物里OTA對農(nóng)作物最具有傷害性，農(nóng)作物包括花生、玉米小麥等都會被赭曲霉毒素污染。赭曲霉毒素進(jìn)入人體后與肝微粒體混合功能氧化酶反應(yīng)，進(jìn)而損害人體腎臟與肝臟。赭曲霉毒素還是一種致癌物質(zhì)、強(qiáng)致畸性[8]。我國國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定OTA在谷物及其制品、豆類及其制品、堅(jiān)果及籽類、烘焙咖啡豆等要求不超過5.0μg/kg，葡萄酒為2.0μg/kg，速溶咖啡可以達(dá)到10.0μg/kg［7］。

圖2 赭曲霉毒素OTA結(jié)構(gòu)式

1.3 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）也是一類霉菌類真菌毒素。主要分為紫黃曲霉毒素B、黃曲霉毒素G和黃曲霉毒素M，它們可在紫外燈下發(fā)出不同的熒光［9］。人們現(xiàn)在可分離到的有B1、B2、G1、G2、B2a、M1、M2、P1等共18 種。據(jù)研究表明AFB1的毒素最強(qiáng)，屬于一類致癌物，直腸癌、乳腺癌、肝癌和骨癌等的發(fā)生都與AFB1有關(guān)，它的結(jié)構(gòu)式如圖3。

花生和玉米最容易被AFB1所污染[10]。食品安全標(biāo)準(zhǔn)中對AFB1的限制量為 0.5μg/kg[7]。

圖3 黃曲霉毒素AFB1結(jié)構(gòu)式

1.4 伏馬毒素

輪枝鐮刀菌、串珠鐮刀菌、層出鐮刀菌等有害真菌感染農(nóng)作物產(chǎn)生的真菌毒素為伏馬毒素。是一類可以溶于水的真菌毒素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，類似結(jié)構(gòu)物有FA1、FA2、FB1和 FB2等共28種，其中FB1的毒性最大。伏馬毒素是一種B類致癌物，與食道癌的高發(fā)有直接的關(guān)系，玉米及或玉米為原料的食品最易被污染，會對人體的肝腎造成損害，使豬肺水腫，馬腦白質(zhì)軟化[11]。FB1的結(jié)構(gòu)式圖4。

圖4 伏馬毒素FB1結(jié)構(gòu)式

1.5 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌等真菌污染小麥或其他農(nóng)作物后所產(chǎn)生的次生代謝物。DON是一種單端孢霉烯族類化合物，化學(xué)名稱為3α,7α,15-三羥基-12,13-環(huán)氧單端孢霉-9烯-8酮[12]，因?yàn)镈ON會使豬發(fā)生嘔吐，所以又叫做“嘔吐毒素”。C-3 位的·OH基團(tuán)、C-9，10 位的雙鍵及C-12，13位的環(huán)氧基是引起中毒的主要基團(tuán)。

大麥、玉米、小麥、飼料都會被DON污染，DON 在胃腸道吸收后經(jīng)過肝臟、腎臟最后隨尿液排出，對各種器官都造成了一定的損害。長期攝入會影響免疫抑制、出現(xiàn)不想吃飯、腹瀉、嘔吐等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響人和動物的健康[13]。中國衛(wèi)生部規(guī)定谷物及其制品（玉米、 玉米面 、 大麥、 小麥、 麥片、小麥粉）嘔吐毒素的含量不能超過1000μg/kg[7]，結(jié)構(gòu)式見圖5。

圖5 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇DON結(jié)構(gòu)式

2 真菌毒素的降解

2.1 生物方法降解真菌毒素

利用生物方法降解真菌毒素具有快速、安全、無污染的特點(diǎn)，是目前降解真菌毒素的主要方法，生物降解法包括微生物降解菌株、生物酶法。本文主要介紹微生物降解菌株的篩選與生物酶法降解真菌毒素。

一些微生物菌株能夠使真菌毒素的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變轉(zhuǎn)化為無毒的物質(zhì)，通常我們從自然界或被污染的土地和食品中篩選得到降解菌。1997年Jun Shima[14]從土壤中分離得到的菌株E3-39，能夠降解小鼠淋巴細(xì)胞中的DON，使毒性僅為原來的十分之一，脫毒原理是氧化改變了DON的結(jié)構(gòu)。在選擇培養(yǎng)基中添加毒素或毒素類似物作為唯一碳源也是篩選降解相應(yīng)毒素的菌株的一種常用的方法。2018[15]年王悅利用ZEN作為唯一碳源和能源及高溫處理后在霉變的飼料中分離出50株芽孢桿菌，利用ELISA分析，得到的7號菌株對ZEN的降解達(dá)到90.4%。

通過物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變等也是篩選真菌毒素降解菌株的有效方法之一，其中最常用的為紫外誘變。2017年張曉雪[16]利用紫外線誘變得到的新型黑曲霉FS-UV1，對AFB1的降解率高達(dá)到87.3%。陳藝[17]等從不動桿菌Acinetobacter sp.SM04培養(yǎng)上清液中分離純化得到對ZEA具有降解能力的Peak 2組分及組分中的A4-Oxa蛋白，并將A4-Oxa在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，得到的重組A4-Oxa蛋白，對ZEA的降解率可達(dá)32%。這是利用基因定向改造篩選表達(dá)特定蛋白（具有降解特定真菌毒素的能力）的微生物的方法，是現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。

生物酶法降解真菌毒素具有操作簡便、降解徹底等優(yōu)點(diǎn)而受到了人們廣泛的關(guān)注。可以降解玉米赤霉烯酮的酶有過氧化物酶、內(nèi)酯水解酶等。Yu Y[18]課題組從土壤分離得到不動桿菌Acinetobacter sp.SM04所產(chǎn)生的過氧化物酶Prx可將ZEN降解為低活性的物質(zhì)分子；2015年鐘鳳[19]等利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建成的過氧化物酶 A4-Pr的工程菌，可以降解63%的ZEN。 2002年Takahashi-Ando[20]等分離得到的一種編碼內(nèi)酯水解酶的基因zdh101，是目前發(fā)現(xiàn)可有效降解ZEN的內(nèi)酯水解酶基因，已廣泛應(yīng)用到了農(nóng)業(yè)等各領(lǐng)域。除了zdh101基因，2018年[21]Meixing Wd等表達(dá)的一種稱為Zhd518的內(nèi)酯酶，它與Zdh101有65%的氨基酸同源性，不僅能降解ZEN，也能降解ZEN系列衍生物。

除了過氧化物酶和內(nèi)酯水解酶外，Banu I[22]等發(fā)現(xiàn)由Trametes versicolor產(chǎn)生的漆酶可以降解81.7%的玉米赤霉烯酮。黃曲霉毒素的生物酶降解主要依靠還原酶類。AFO即黃曲霉毒素氧化酶早在1998年Liu[23]等首次在真菌Armillariella tabescens中被發(fā)現(xiàn)。

乙?；?、氧化酶、糖基化酶是降解嘔吐毒素的3種典型的酶。1997年Kimura[24]等就發(fā)現(xiàn)單端孢甲-3-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶可以降解嘔吐毒素，它的降解機(jī)理是使嘔吐毒素三號位乙?；瘡亩摱?。Poppenberger等發(fā)現(xiàn)UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶將一分子葡萄糖基轉(zhuǎn)移到DON的3號位碳原子上后形成的DON-葡糖苷酸毒性比原來低，降低了嘔吐毒素的危害[25]。2013年Ito等發(fā)現(xiàn)P450細(xì)胞色素系統(tǒng)能夠?qū)I吐毒素氧化，毒性大大降低。

由以上可知利用生物酶降解真菌毒素在操作上簡單易行，降解均一、徹底，具有很大的研究前景與價(jià)值，是解決真菌毒素對食品、飼料危害最為有效的方法之一，但是，生物酶解目前存在的問題是新酶的開發(fā)與利用十分艱難。

2.2 降解真菌毒素的其他方法

降解真菌毒素除了微生物降解菌和生物酶解外，還有傳統(tǒng)的降解方法，如物理法和化學(xué)降解法。

物理方法降解真菌毒素包括：吸附劑吸附、熱處理、有機(jī)溶劑抽提、超聲處理、射線照射，最簡單的處理方式是將谷物進(jìn)行清洗或?qū)⒈徽婢舅匚廴镜牟糠秩サ粢詼p少真菌毒素的危害。雖然這些方法操作簡便，但是存在不徹底的缺點(diǎn)，近年來人們研究較多的是利用輻射降解真菌毒素。2005年Aquino[26]等研究發(fā)現(xiàn)玉米中的AFTB1和AFTB2在輻照劑量為10 kGy照射時(shí)可以完全降解；王蓓[27]研究表明在輻射通量為28.52 J/cm2的條件下，AFB1和AFB2經(jīng)脈沖強(qiáng)光處理10 s，降解率高達(dá)96.6%和91.7%。許多的研究都表明用輻射去降解真菌毒素具有很好的脫毒效果，為食品、谷物、飼料中真菌毒素降解帶來新方法，具有很高的研究價(jià)值。

化學(xué)方法降解真菌毒素是利用氫氧化鈉、過氧化氫、次氯酸鈉、鹽、酸、氨等化學(xué)物質(zhì)對被真菌毒素污染的飼料、食品或谷物進(jìn)行處理，從而使真菌毒素的某些結(jié)構(gòu)或基團(tuán)遭到破壞，達(dá)到脫毒目的。與物理方法相比，化學(xué)降解真菌毒素的效果更好、更徹底，但是有可能給食品、飼料帶來新的化學(xué)污染，并在一定程度上會使食品、飼料的營養(yǎng)物質(zhì)流失，因此化學(xué)方法有一定的局限性而不常用，更多的是把化學(xué)方法與物理方法相結(jié)合，取長補(bǔ)短，以達(dá)到最有效、最安全的降解效果。

3 真菌毒素的檢測技術(shù)

由于真菌毒素對人類和動物健康都具有極大的威脅性，因此必須對食品、飼料中的真菌毒素進(jìn)行檢測，故完善真菌毒素檢測技術(shù)是非常必要的。

真菌毒素的檢測方法根據(jù)檢測的對象不同及不同種類的真菌毒素而異。如，食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測一般是采用LC-MS/MS、HPLC、TLC或ELISA，而在谷物中一般用膠體金快速定量法來檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。食品中的真菌毒素的檢測方法有HPLC（柱前、柱后衍生法）、LC-MS/MS、免疫親和柱-熒光光度法；糧食和谷物的真菌毒素的檢測方法有膠體金快速定量法、UPLC、HPLCMS/MS、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等[28]。除了以上的這些方法，常用的檢測方法還有熒光光度法、免疫熒光分析法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫分析技術(shù)、免疫芯片技術(shù)、薄層色譜法、快速檢測方法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、近紅外技術(shù)以及利用生物化學(xué)傳感器[29]對真菌毒素進(jìn)行檢測，這些檢測方法都是如今發(fā)展得較為完善的檢測方法，檢測的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是檢測的過程較為繁瑣復(fù)雜。目前又出現(xiàn)了一種稱為便攜式定量檢測儀對真菌毒素進(jìn)行檢測的方法，這種方法操作簡單又能快速知道結(jié)果且成本低，最大的優(yōu)點(diǎn)是可以進(jìn)行實(shí)地檢測，為實(shí)時(shí)實(shí)地調(diào)查、檢測研究提供了可能性[30]。隨著科技的不斷發(fā)展，會出現(xiàn)更為準(zhǔn)確與快速的檢測方法。

4 展望

真菌毒素對飼料、食品、農(nóng)業(yè)的影響已經(jīng)嚴(yán)重威脅了人和動物的健康，并對全球的經(jīng)濟(jì)也帶來了難以想象的損失，已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了社會的發(fā)展。物理降解、化學(xué)降解都可以在一定程度上實(shí)現(xiàn)對真菌毒素的降解，但都存在一定的局限性，將兩者相互結(jié)合可以取得不錯(cuò)的降解效果，在未來這些方法可能應(yīng)用到實(shí)際中。

微生物降解與生物酶解是依然是目前最為安全、有效的手段，也是人們研究的熱點(diǎn)，降解菌的篩選是關(guān)鍵，一方面可以從自然界中篩選，另一方面可利用基因定向改造技術(shù)進(jìn)行培育、篩選。新酶的發(fā)掘也是研究的另一大熱點(diǎn)，且發(fā)掘得到的新酶對真菌毒素的降解效率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過物理與化學(xué)降解法。但是，新酶的發(fā)掘較為困難，條件也較為嚴(yán)格，因此目前還停留在起步階段，不過，相信隨著近代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，不斷克服、改進(jìn)，最終可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。另一方面，真菌毒素的檢測手段也得到不斷發(fā)展，從而使檢測更加簡便、快速、準(zhǔn)確，有助于及時(shí)避免真菌毒素造成的危害。