論著與臨床GJB2通過AMPK/mTOR信號通路促進宮頸癌細胞惡性增殖

王洪萍，劉嬌，尚憲平，劉文鳳

宮頸癌是僅次于乳腺癌和直腸癌的全球第三大惡性腫瘤，每年有569 000例新發(fā)病例[1-2]。2018年發(fā)生13 000例新發(fā)病例和4 100例宮頸癌死亡[3]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染與大多數(shù)宮頸癌病例相關，其中HPV 16和18被確定為最致癌的亞型，分別占病例的50%和10%以上[4]。單磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)最初被鑒定為一種負性調節(jié)脂質合成代謝的幾種關鍵酶的絲氨酸/蘇氨酸激酶。 同時，AMPK被認為是主要的能量感應激酶，可以激活多種細胞生物中的各種分解代謝過程，例如葡萄糖攝取和代謝，同時抑制多種合成代謝途徑，例如脂質、蛋白質和碳水化合物的生物合成[5]。AMPK通過調節(jié)雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)活性在控制細胞生長、增殖和自噬中起著核心作用，而mTOR活性在癌細胞中一直處于失調狀態(tài)[6]。 mTOR是營養(yǎng)和生長因子輸入的中心調控者，可控制所有真核生物的細胞生長，其活性在大多數(shù)人類癌癥中受到異常調控[7]。目前鮮有關于AMPK/mTOR信號通路與GJB2的關聯(lián)研究，由研究提出AMPK是縫隙連接蛋白2(Gap Junction Protein Beta 2， GJB2)的有效調節(jié)劑[8]。GJB2是編碼間隙連接蛋白家族的成員，目前報道GJB2的突變主要與耳部疾病相關，GJB2突變是兒童遺傳性耳聾的最常見原因[9]。突變可以阻止有機溶質的交換，但允許離子的自由交換[10]。皮質醇支持細胞中的GJB2顯然對于谷氨酸的跨細胞運動特別重要。在缺乏GJB2的小鼠中，內毛細胞附近的谷氨酸緩沖支持細胞發(fā)生凋亡，這很可能是由于它們無法通過間隙連接將谷氨酸分布到表達谷氨酰胺合酶的相鄰支持細胞而引起的[11]。目前關于GJB2在宮頸癌的研究未有報道，且發(fā)現(xiàn)GJB2在宮頸癌中的表達相比正常組織顯著高表達，并具有高表達預后差特征，暗示GJB2可能在宮頸癌中的致癌因子特性，因此本篇文章主要研究了GJB2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的功能與分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人宮頸癌細胞siHa和Hela細胞購于美國ATCC細胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并加入100 μg/mL鏈霉素和100 IU/mL 青霉素。細胞培養(yǎng)瓶置于含 5%的 CO2和 95%濕度的 37°C 培養(yǎng)箱中。

1.2 臨床數(shù)據(jù)篩選

在臨床數(shù)據(jù)庫 (Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)中[12]，通過tumor/normal>2找到在宮頸癌中高表達的蛋白，并通過GEPIA找到與宮頸癌臨床預后密切相關的蛋白，將兩部分蛋白進行重合性分析，從而篩選到目的蛋白。收集2018年7月至2019年7月濟南市人民醫(yī)院婦科行宮頸癌手術的30例宮頸癌患者腫瘤組織標本及癌旁組織標本，患者年齡40～62歲，平均年齡(55.2±5.6)歲，病理類型：鱗癌24例、腺癌6例；FIGO分期：Ⅰ～Ⅱ期17例，Ⅲ期13例；采用RT-qPCR法檢測組織中GJB2 mRNA表達情況。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR實驗(qPCR) 使用primer3(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)設計特異性GJB2 qPCR引物，序列：GJB2-F/CTGCAGCTGATCTTCGTGTC，GJB2-R/ATGACCCGGAAGAAGATGCT，并在生工生物工程(上海)股份有限公司合成；cDNA用滅菌純水稀釋適當?shù)臐舛?，一般稀?0倍，按照qPCR mix 5μL、primer 1μL 、cDNA 4μL的配方加入到96孔PCR板中；貼膜，以2 500 rpm離心1 min，將樣品放入qPCR儀器中進行實驗。 qPCR擴增實驗程序：熱啟動：95℃，10 mim；擴增(兩步法)：95℃, 10 s (解鏈); 60℃, 20 s (退火)；溶解曲線溫度：95℃, 30 s；65℃, 30 s；95℃,30 s；反應完成后，進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.2 siRNA轉染總RNA提取及RT-qPCR 以6孔板轉染siRNA為例：第1天鋪6孔板1/4的細胞于孔中，待第2天長到50%即可轉染第1輪，將1 μL siRNA與250 μL Opti-MEM混勻，1 μL lipo 2000與250 μL Opti-MEM混勻，室溫放置5 min，然后將兩部分合并，混勻，靜置15 min，之后逐滴、均勻加入6孔板中的1個孔中，轉染第1輪24 h之后按照上述操作轉染第2輪，轉染第2輪24 h之后收細胞提RNA。對于總RNA的提取，我們采用RNAiso Plus(TaKaRa，Cat.#9108)試劑，提取的流程如下：以6孔板為例，細胞用PBS洗滌1次，加入350 uL的RNAiso Plus，室溫裂解5 min后，添加RNAiso Plus量 0.2倍體積的氯仿，劇烈渦旋15 s，繼續(xù)在室溫保持5 min，離心(12 000 g，4℃，15 min)，轉移上清(水相層的70%～80%)至新的EP管中，然后向上清中添加RNAiso Plus量 1倍體積的異丙醇，顛倒混勻8～10次，室溫保持10 min，離心(12 000 g，4℃，10 min)，去除上清，白色沉淀即為粗RNA沉淀物，然后向沉淀物中加75%乙醇洗滌RNA沉淀物，并離心(7 500g，4℃，5 min)，去除上清(盡可能去除干凈)，室溫干燥5～15 min，最后加50 uL無核酸酶水溶解，即可獲得總RNA。隨后使用GoScript 反轉錄系統(tǒng)(Promega)進行RNA反轉錄，按照廠商的使用說明，將總RNA中反轉錄成cDNA，并通過AriaMx實時定量PCR儀(Agilent Technologies)進行定量PCR(qPCR)，每個樣本進行3個生物學重復，最后分析數(shù)據(jù)。

1.3.3 細胞增殖實驗 消化長滿的10 cm盤細胞，重懸于1 mL新鮮培養(yǎng)基中，用20 μL可鋪1個96孔板的密度鋪細胞，每個實驗組需3個生物重復，鋪好所需的實驗孔數(shù)。在5% CO2、37℃條件下孵育。細胞貼壁后即可轉染siRNA，48 h后開始測量吸光度。配制MTS反應液，按照MTS：培養(yǎng)液=1∶20的比例配制反應液。每孔加入100 μL MTS反應溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。每隔半小時檢測1次吸光度。將培養(yǎng)皿置搖床上低速振蕩10 s以充分溶解結晶物。在490 nm處測量各孔的吸光值。將每天的吸光值轉換成代表每日細胞生長的參數(shù)，并繪制細胞增殖曲線。

1.3.4 劃痕遷移實驗 10 cm盤的1/4鋪整個6孔板，待細胞貼壁后分別轉染siRNA，36 h后待細胞長到90%用槍頭在盤中央劃痕，并用PBS洗1遍，拍攝0 h圖片作為對照，之后24 h進行拍攝觀察。

1.3.5 基因功能分析 在臨床數(shù)據(jù)庫cBioPortal[13-14]中找到與GJB2共表達的基因，將這些基因在metascape中進行信號通路分析，從而為解析目的蛋白在癌癥進程中發(fā)揮的功能提供參考。

1.3.6 蛋白質免疫印跡實驗 收細胞進行蛋白定量并制樣，每組蛋白總樣品加20 ug，準備電泳、電轉裝置，電泳液及電轉液，裝樣品加入在凝膠中，100 V進行電泳，待藍色條帶跑出即進行電轉，100 V冰浴電轉2 h，將蛋白膜放在用TBST配置的5%牛奶中室溫封閉1 h，4℃孵育一抗過夜，洗膜4次，每次5 min，室溫孵育二抗1 h，洗膜4次，每次5 min，暗房顯影。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 篩選宮頸癌中高表達且具有顯著臨床預后相關性的基因

為了找到對宮頸癌發(fā)生發(fā)展中具有顯著作用的基因，通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分別找到在宮頸癌中高表達(tumor/normal>2)的基因1 851個和在宮頸癌中具有顯著臨床預后的基因500個(pValue<0.05)，進行基因重合性分析，發(fā)現(xiàn)78個在宮頸癌中高表達且具有顯著臨床預后相關性的基因(如下頁圖1a)，再將重合基因進行熱圖分析，找到表達差異排名前4的基因(如下頁圖1b),分別是序列相似性家族83名成員H(Family with Sequence Similarity 83 Member H,FAM83H)、GJB2、載脂蛋白B mRNA編輯酶催化亞基3 B(Apolipoprotein B MRNA Editing Enzyme Catalytic Subunit3B ,APOBEC3B)和著絲粒蛋白M(Centromere Protein M, CENPM)(如下頁圖1c)。

2.2 GJB2在宮頸癌中高表達且具有顯著臨床預后相關性

在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，分析FAM83H，GJB2，APOBEC3B和CENPM與宮頸癌的臨床預后相關性，發(fā)現(xiàn)FAM83H和GJB2在宮頸癌中均呈現(xiàn)顯著高表達而預后差的特征(P=0.0047、0.0056)；而APOBEC3B和CENPM則是低表達預后差(P=0.0005、0.0011，如圖2a，見彩插2)。通過RT-qPCR實驗檢測30組宮頸癌及鄰近正常組織中GJB2的表達水平情況，結果發(fā)現(xiàn)GJB2的確在宮頸癌組織中較鄰近正常組織顯著性高表達(P<0.001，如下頁圖2b)。一般將在癌癥中高表達且預后差的基因認為是致癌基因，因此主要關注FAM83H和GJB2；而FAM83H在宮頸癌中的重要作用已被證實，本文主要研究GJB2在宮頸癌中的重要作用。

2.3 GJB2促進宮頸癌細胞生長增殖和遷移

RT-qPCR結果顯示，在敲低GJB2表達的兩種宮頸癌細胞中(Hela和siHa)(如83頁圖3a)，相比對照細胞，敲低GJB2表達的細胞增殖速率顯著減慢，自第3天后差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，如83頁圖3b)，同時相比對照細胞，細胞遷移速率也顯著減慢(P<0.01，如83頁圖3c)。

2.4 GJB2主要參與AMPK/mTOR信號通路促進宮頸癌細胞生長增殖和遷移

為探究GJB2促進宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，將與GJB2共表達的基因(pValue>0.4)進行了metascape分析，結果發(fā)現(xiàn)GJB2主要參與AMPK信號通路(如84頁圖4a)；隨后在敲低GJB2的細胞中對此信號通路中的重要基因進行了驗證，發(fā)現(xiàn)敲低GJB2的表達，AMPK本底不變的情況下，AMPK的磷酸化顯著升高(P<0.01，如84頁圖4b～4c)，同時也發(fā)現(xiàn)在mTOR本底不變的情況下，mTOR的磷酸化顯著減弱(P<0.05，如84頁圖4b～4c)；而在宮頸癌中GJB2的高表達則會減弱AMPK磷酸化的抑癌表達，同時升高mTOR的磷酸化促癌表達。說明GJB2參與AMPK/mTOR信號通路，促進宮頸癌細胞生長增殖和遷移。

3 討論

GJB2編碼連接蛋白26蛋白(Connexin 26，Cx 26)，它是一種間隙連接蛋白，通過鉀離子再循環(huán)參與耳蝸液、內淋巴和周圍淋巴的內耳穩(wěn)態(tài)[16]。該基因具有簡單的基因組結構，由680 bp組成，測序也較簡單[16]。迄今為止，已經(jīng)鑒定出GJB2基因中的100多個致病突變，GJB2突變的發(fā)生率因人群而異[17]。在高加索人中，c.35 delG是最常見的突變，頻率高達2%～4%[18]。但是，c.235 delC和p.Trp 24*分別是日本人[19]和印度人[20]中最常見的突變。目前研究報道最多的也是GJB2的突變在疾病中的作用。

a.宮頸癌中高表達的基因與具有顯著臨床預后相關性的基因重合性分析結果；b.熱圖顯示宮頸癌中高表達基因按表達差異從大到小排序結果；c.表達差異前4基因在宮頸癌中的表達情況。

b.30組宮頸癌及鄰近正常組織中GJB2的表達情況。

在本文中，我們主要研究了GJB2在宮頸癌中的功能和分子機制。首先，通過GEPIA數(shù)據(jù)庫找到在宮頸癌中相比鄰近正常組織高表達的基因，同時找到在宮頸癌中具有顯著臨床預后相關性的基因，將這兩部分的基因進行重合性分析，找到既在宮頸癌中高表達又具有顯著臨床預后相關性的基因，將重合基因在宮頸癌中的表達量差異再次進行排序，找到表達量差異前4的基因，分別為FAM83H，GJB2，APOBEC3B和CENPM，因為FAM83H和GJB2與臨床預后相關性是高表達預后差，而APOBEC3B和CENPM與臨床預后相關性是低表達預后差，因此我們主要研究FAM83H和GJB2，但FAM83H已經(jīng)研究頗多，因此最后我們篩選到GJB2進行研究。接著我們在30組宮頸癌臨床樣品中進行了驗證，證實GJB2在宮頸癌中相比臨近正常組織更高表達，由此暗示了GJB2在宮頸癌中的重要性，為了進一步探究GJB2在宮頸癌中的關鍵作用，我們在敲低GJB2的兩個宮頸癌細胞中進行了細胞增殖和遷移實驗，發(fā)現(xiàn)敲低GJB2確實顯著減慢宮頸癌細胞的增殖和遷移速率，由此證明了GJB2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的重要性，為了進一步探究GJB2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制，我們將與GJB2表達相關系數(shù)大于0.4的基因進行了metascape分析，發(fā)現(xiàn)在京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路中GJB2主要參與AMPK信號通路，接著我們用敲低GJB2的兩個宮頸癌細胞進行了驗證，發(fā)現(xiàn)敲低GJB2的表達，AMPK的磷酸化顯著升高，而mTOR的磷酸化顯著降低，這說明GJB2是AMPK/mTOR信號通路的一個激活劑。綜上所述，GJB2在宮頸癌中高表達，GJB2的高表達激活了AMPK/mTOR信號通路軸，進而促進宮頸癌細胞的惡性增殖及遷移，引發(fā)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，因此GJB2可能是一個新的潛在的治療宮頸癌的藥物靶標。

a.兩種宮頸癌細胞中，qPCR實驗顯示GJB2的表達敲低情況；b.兩種宮頸癌細胞中，MTS法顯示敲低GJB2對宮頸癌細胞生長增殖影響情況；c. 兩種宮頸癌細胞中，劃痕遷移實驗顯示敲低GJB2對宮頸癌細胞遷移速率影響情況。

a.通過metascape分析顯示GJB2共表達基因參與的信號通路；b、c在宮頸癌細胞中敲低GJB2表達對AMPK和mTOR磷酸化的影響

本文篩選宮頸癌中高表達且具有顯著臨床預后相關性的基因，從功能驗證及分子機制等方面對促進宮頸癌發(fā)生發(fā)展的進程進行了研究，但這其中的研究還不是很全面，功能驗證除了細胞增殖和遷移實驗，還可利用細胞周期，克隆形成等表型實驗進行進一步的驗證，分子機制也只是初步的探討，需要更多的全轉錄組結合高通量測序實驗以及后續(xù)的RT-qPCR，相互作用蛋白及質譜的進一步驗證。