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    玻璃化解凍和慢速解凍在程序化冷凍胚胎解凍移植中的比較研究

    2021-01-29 11:07:24王建業(yè)唐寧呂丹
    關(guān)鍵詞:卵裂玻璃化程序化

    王建業(yè),唐寧,呂丹

    玻璃化冷凍是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣也是最為普遍的冷凍方式,它廣泛應(yīng)用于卵裂期胚胎、囊胚期胚胎、卵母細(xì)胞,甚至是精子的冷凍[1-5],極大地提高了冷凍胚胎移植(frozen embryo transfer, FET )周期患者的胚胎復(fù)蘇率和患者的累計(jì)妊娠率[6-7],保障了FET周期患者成功率,減少了患者并發(fā)癥,也進(jìn)一步降低了不孕不育患者治療的總費(fèi)用。但早期不孕不育患者在接受體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET)治療時(shí)多采用程序化的冷凍方式,對(duì)于這部分胚胎如果按照標(biāo)準(zhǔn)的慢速解凍(slow thawing, ST)方式進(jìn)行操作,解凍后胚胎有較高的卵裂球壞死率,胚胎利用率相對(duì)較低;按照玻璃化解凍(vitrificative thawing, VT)方式解凍玻璃化冷凍的胚胎,解凍后胚胎存活率高,胚胎利用率也相對(duì)較高[8-9]。但是否能用VT方式解凍程序化冷凍的胚胎,目前還在探討之中。本研究將比較VT和ST對(duì)程序化冷凍胚胎的影響,以期為程序化冷凍胚胎尋求更好的解凍方案。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    研究對(duì)象為2016年1月至2018年12月解放軍第九六〇醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET技術(shù)進(jìn)行助孕治療的胚胎解凍移植患者。使用隨機(jī)數(shù)生成軟件產(chǎn)生隨機(jī)分組數(shù)值,患者按照就診先后順序所對(duì)應(yīng)的隨機(jī)數(shù)分為VT組(200例,解凍液使用日本加藤的玻璃化解凍液)和ST組(200例,解凍液使用Quinn’s的慢速解凍液)。兩組患者夫婦的胚胎在冷凍時(shí)均為程序化冷凍方式。納入研究的患者年齡<37歲,不孕原因?yàn)檩斅压芤蛩?,超促排卵方案為短方案。所有患者均按照醫(yī)院生殖倫理委員會(huì)要求,每一步操作都簽訂相應(yīng)的知情同意書。

    1.2 方法

    使用本中心常規(guī)方法,但略有改進(jìn)[10],具體如下。

    1.2.1 超促排卵 采用本生殖中心常規(guī)超促排卵方案,當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)18 mm時(shí),肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)5 000~10 000 U。

    1.2.2 取卵、受精和胚胎觀察 hCG注射后36 h在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵,取卵后3~5 h行體外受精(in vitro fertilization,IVF),19~20 h觀察受精情況,6~7 h行卵胞漿內(nèi)單精子注射( intracytoplasmic sperm injection,ICSI),17~18 h觀察受精情況。授精后68~70 h觀察胚胎卵裂球和碎片數(shù)量,并以此判定卵裂期胚胎的級(jí)別。① Ⅰ級(jí)胚胎:卵裂球大小均勻,胞漿碎片<10% ;② Ⅱ級(jí)胚胎:卵裂球大小略不均勻,胞漿碎片<15% ;③ Ⅲ級(jí)胚胎:胞漿碎片<50%,卵裂球情況類似于Ⅱ級(jí)胚胎;④ Ⅳ級(jí)胚胎:胞漿碎片>50%。胚胎達(dá)6細(xì)胞以下,胚胎評(píng)級(jí)降低一個(gè)級(jí)別。解凍后胚胎有卵裂球死亡,胚胎評(píng)級(jí)降低一個(gè)級(jí)別。Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎。Ⅰ~Ⅲ級(jí)胚胎為可用胚胎。兩組胚胎均在Labotect C 200培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所有洗精和受精用培養(yǎng)液均使用Vitro Life產(chǎn)品。

    1.2.3 所有解凍移植胚胎均使用程序化冷凍方法。

    1.2.4 移植日測(cè)定患者子宮內(nèi)膜厚度,低于10 mm不予移植,不計(jì)入本研究統(tǒng)計(jì)范圍。

    1.3 觀察指標(biāo)

    ① 比較兩組患者最初進(jìn)入IVF-ET周期時(shí)的基本情況,包括年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、促性腺激素(gonadotropins,Gn)用量和基礎(chǔ)促卵泡成熟激素(follicle stimulating hormone,F(xiàn)SH)值;② 比較兩組患者最初進(jìn)入IVF-ET周期時(shí)胚胎發(fā)育情況,包括MⅡ卵率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可用胚胎率和冷凍胚胎率;③ 比較兩組患者胚胎復(fù)蘇情況,包括胚胎復(fù)蘇完整率和復(fù)蘇可用率;④ 比較兩組患者胚胎移植情況和臨床妊娠結(jié)局,包括胚胎移植日移植次數(shù)、移植胚胎數(shù)、內(nèi)膜厚度和臨床妊娠結(jié)果。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 患者基本情況

    所有患者均曾在中心接受IVF助孕。最近一次IVF周期檢查顯示:兩組患者年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、Gn用量和基礎(chǔ)FSH值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見下頁表1。

    2.2 胚胎發(fā)育情況

    最近一次IVF周期胚胎發(fā)育情況顯示:兩組患者M(jìn)Ⅱ卵率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可用胚胎率和冷凍胚胎率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表2。

    2.3 胚胎復(fù)蘇情況

    VT組患者胚胎復(fù)蘇完整率和復(fù)蘇可用率明顯高于ST組,兩組差異均有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),詳見表3。

    2.4 胚胎移植及妊娠結(jié)局

    胚胎移植日,兩組患者移植次數(shù)、移植胚胎個(gè)數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度、移植后兩組患者臨床妊娠率比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見78頁表4。

    3 討論

    自1978年第1例試管嬰兒誕生以來,越來越多不孕不育患者受益于輔助生殖技術(shù)。在眾多的輔助生殖技術(shù)中,冷凍和解凍技術(shù)是最重要的技術(shù)之一,最常用的冷凍和解凍方法包括程序化冷凍與ST及玻璃化冷凍與VT。程序化冷凍是最早使用的冷凍方法,采用“植冰”方式防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成,使用麥管作為冷凍載體,程序化降溫方式;玻璃化冷凍是后來使用的冷凍方法,采用高濃度冷凍保護(hù)劑,在極速降溫中形成玻璃態(tài)方式防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成,使用冷凍環(huán)、冷凍鉤或者冷凍片作為冷凍載體,急速降溫方式。ST使用冷凍保護(hù)劑梯度遞降的方式置換細(xì)胞內(nèi)外液體,避免解凍時(shí)的冰晶損傷;VT同樣使用冷凍保護(hù)劑梯度遞降的方式置換細(xì)胞內(nèi)外液體,避免解凍時(shí)的冰晶損傷?,F(xiàn)在多數(shù)學(xué)者和臨床胚胎學(xué)家認(rèn)為,玻璃化冷凍更適合胚胎的冷凍保存,玻璃化冷凍和解凍應(yīng)該全面代替程序化冷凍和ST[11-12]。只是兩種解凍方式使用的冷凍保護(hù)劑有所不同。這為我們使用VT方式代替ST方式,解凍程序化冷凍的胚胎,提供了一定的理論基礎(chǔ)。

    本研究中,所有進(jìn)入冷凍周期的患者都是最近接受IVF周期并有冷凍胚胎,隨機(jī)數(shù)分配形成VT組和ST組。兩組患者在年齡、不孕年限、獲卵數(shù)、Gn用量和基礎(chǔ)FSH值方面沒有差異,有共同的比較基礎(chǔ)。進(jìn)一步的胚胎發(fā)育比較顯示MⅡ卵率、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可用胚胎率和冷凍胚胎率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在影響冷凍和解凍的因素中,胚胎質(zhì)量和數(shù)量非常重要,胚胎發(fā)育的一致性使得兩組在比較解凍方法對(duì)冷凍效果的影響上有了較好的共同基礎(chǔ),增加了比較的可行度。解凍結(jié)果顯示VT組患者胚胎復(fù)蘇完整率和復(fù)蘇可用率明顯高于ST組,這表明了VT能達(dá)到比ST較好的解凍結(jié)果,這也意味著解凍同樣數(shù)量的冷凍胚胎,經(jīng)過VT可以獲得更多的優(yōu)質(zhì)胚胎和可用胚胎用于胚胎移植。在實(shí)際的臨床實(shí)踐中,我們總是盡可能的保證在一次移植時(shí)有兩個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎,因此使用慢速冷凍意味著要解凍更多的胚胎。本研究中VT組解凍了523個(gè)胚胎,而ST組則解凍了603個(gè)胚胎。80個(gè)胚胎可能來自ST組解凍后的不可用胚胎,也可能來自復(fù)蘇后的多余可用胚胎。這表明ST不僅會(huì)造成更多的胚胎壞死,而且考慮到隨后的胚胎移植,還會(huì)造成更多的胚胎浪費(fèi)。由于兩組患者的移植次數(shù)、移植胚胎個(gè)數(shù)和子宮內(nèi)膜厚度沒有差異,移植后的臨床妊娠率也沒有差異,但VT組移植胚胎數(shù)(2.13±0.26)還是略低于ST組(2.48±0.42),而VT組臨床妊娠率(55.0%)卻略高于ST組(53.5%),這表明VT比ST對(duì)臨床妊娠結(jié)果有一定提高,雖然這種提高并沒有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 患者基本情況

    表2 胚胎發(fā)育情況(%)

    表3 胚胎復(fù)蘇情況(%)

    總之,對(duì)于程序化冷凍的胚胎,VT比ST提升解凍效果明顯,能夠更好地提高冷凍胚胎的利用率,進(jìn)而提高不孕不育患者的累計(jì)妊娠率,降低患者的妊娠花費(fèi),是相對(duì)較好的胚胎解凍方法。但由于本研究樣本量有限,加之缺乏相關(guān)機(jī)理的深入探討,對(duì)玻璃化方法解凍程序化冷凍胚胎的研究還需要深一步探究。

    表4 胚胎移植及妊娠結(jié)局

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