宮頸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的LncRNA篩選及功能研究

董君偉，賈海生

作為全球女性中第三大最常見的癌癥和惡性腫瘤相關(guān)死亡率的第四大突出原因，宮頸癌在全世界每年發(fā)生530 000例病例，近27.5萬例死亡，高于其他婦科腫瘤[1]。近年來，由于宮頸細(xì)胞學(xué)和宮頸活檢的進(jìn)展，已經(jīng)通過更好的檢測方法診斷出早期和局部晚期宮頸癌[2]。宮頸癌的篩查和先進(jìn)的醫(yī)療手段使宮頸癌的發(fā)病率降低了40%～50%。在許多發(fā)達(dá)國家，死亡率降低了60%，預(yù)后良好率也有所提高[3]。然而，宮頸癌仍然是主要的公共衛(wèi)生問題，尤其是在晚期病例中[4]。過去的研究主要集中在識別可預(yù)測生物學(xué)行為的腫瘤特異性標(biāo)志物上，主要是由于細(xì)胞運動的重要性和宮頸癌進(jìn)展中的侵襲性[5]。為了進(jìn)一步研究宮頸癌的治療，需要開展更多研究以研究宮頸癌的分子機制[6]。非編碼RNA(ncRNA)是基因調(diào)控的關(guān)鍵因素，影響正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的表型[7]。 這些ncRNA被認(rèn)為在腫瘤發(fā)生的起始中起著重要的調(diào)節(jié)作用[8]。最近，一類新的轉(zhuǎn)錄本，長鏈非編碼RNA(LncRNA)，已在真核基因組中廣泛轉(zhuǎn)錄[9]。LncRNA的長度約為200 nt至100 kb，是功能性非編碼RNA分子之一[10]。 據(jù)報道，宮頸癌中涉及幾種LncRNA[11]。到目前為止，僅對一小部分LncRNA進(jìn)行了詳細(xì)表征[12]。一些LncRNA調(diào)控重要的癌癥過程，包括增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和耐藥性[13]。仍需要鑒定更多影響癌癥相關(guān)基因表達(dá)的LncRNA。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及材料試劑

本研究中宮頸癌細(xì)胞Hela購于美國ATCC細(xì)胞庫。胎牛血清FBS、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher；Trizol試劑、脂質(zhì)體2000購自美國Invitrogen；siRNA購自廣州市銳博生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑及熒光定量PCR試劑購自翊圣(上海)有限公司；細(xì)胞增殖實驗反應(yīng)MTS購于abcam公司; BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天；兔抗人MYC多克隆抗體、抗β-Actin抗體及HRP偶聯(lián)二抗購自英國Abcam?；蛐蛄衼碓从贜CBI數(shù)據(jù)庫，通過Primer 3.0軟件設(shè)計RT-PCR檢測引物，由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞購于美國ATCC細(xì)胞庫，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并加入100 μg/mL鏈霉素和100 IU/mL青霉素。細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于含5%的CO2和95%濕度的37°C培養(yǎng)箱中。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.2 臨床數(shù)據(jù)篩選 在臨床數(shù)據(jù)庫GEPIA( Gene Expression Profiling Interactive Analysis)[14]中，tumor/normal>2找到在宮頸癌中高表達(dá)的基因，并通過GEPIA數(shù)據(jù)庫找到與宮頸癌臨床預(yù)后密切相關(guān)的基因，進(jìn)一步篩選LncRNA作為目的基因進(jìn)行研究。

1.2.3 實時熒光定量PCR實驗(RT-qPCR) 反轉(zhuǎn)錄的cDNA用滅菌純水稀釋適當(dāng)?shù)臐舛?，一般稀?0倍，按照qPCR mix 5 μL，primer 1 μL, cDNA 4 μL的配方加入到96孔PCR板中；貼膜，以2 500 rpm離心1 min，將樣品放入qPCR儀器中進(jìn)行實驗，反應(yīng)完成后，拷貝數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析。

1.2.4 轉(zhuǎn)染 以6孔板轉(zhuǎn)染siRNA為例： 將1 μL siRNA與250 μL Opti-MEM混勻，1 μL lipo 2000與250 μL Opti-MEM混勻，室溫放置5 min，然后將兩部分合并，混勻，靜置15 min，之后逐滴、均勻加入6孔板中的1個孔中。

1.2.5 細(xì)胞增殖實驗 消化長滿的10 cm盤細(xì)胞，重懸于1 mL新鮮培養(yǎng)基中，用20 μL可鋪1個96孔板的密度鋪細(xì)胞，每個實驗組需3個實驗副孔，鋪好所需的實驗孔數(shù)。在5%的CO2，37℃條件下孵育。細(xì)胞貼壁后即可轉(zhuǎn)染siRNA，48 h后，開始測量吸光度。配制MTS反應(yīng)液，按照MTS：培養(yǎng)液=1∶20的比例配制反應(yīng)液。每孔加入100 μL MTS反應(yīng)溶液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。每隔半小時檢測一次吸光度。將培養(yǎng)皿置搖床上低速振蕩10 s以充分溶解結(jié)晶物。在490 nm處測量各孔的吸光值。將每天的吸光值轉(zhuǎn)換成代表每日細(xì)胞生長的參數(shù)，并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.6 克隆形成實驗 以6孔板細(xì)胞為例：每孔鋪2 000個細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后即可轉(zhuǎn)染siRNA。每個樣品做3個生物重復(fù)，待6～14 d之后出現(xiàn)肉眼可見的克隆，收集細(xì)胞，用常溫的PBS洗滌兩次，用甲醇、乙酸比為3∶1的固定液進(jìn)行常溫固定5 min，用含0.5%結(jié)晶紫的甲醇溶液常溫固定15 min，水洗，直至背景紫色洗掉，室溫晾干進(jìn)行掃描。

1.2.7 HallMark信號通路分析 將與CLIC 3共表達(dá)的基因在metascape數(shù)據(jù)庫[15]中進(jìn)行分析,找到其參與的HallMark信號通路，為后續(xù)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1.2.8 蛋白免疫印跡實驗 收細(xì)胞進(jìn)行蛋白定量并制樣，準(zhǔn)備電泳、電轉(zhuǎn)裝置，電泳液以及電轉(zhuǎn)液，裝樣品加入在凝膠中，100 V進(jìn)行電泳，待藍(lán)色條帶跑出即進(jìn)行電轉(zhuǎn)，100 V電轉(zhuǎn)2 h，將蛋白膜放在牛奶中封閉1 h，4℃孵育一抗過夜，洗膜4次，每次5 min，室溫孵育二抗1 h，洗膜4次，每次5 min，暗房顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌目的LncRNA篩選及確定

通過GEPIA數(shù)據(jù)庫[14]，將在宮頸癌中高表達(dá)的有1 851個基因，和在宮頸癌中具有明顯臨床預(yù)后相關(guān)性的500個基因(P<0.05)進(jìn)行重合性分析，共找到78個既在宮頸癌中高表達(dá)又具有顯著臨床意義的基因。通過將78個宮頸癌中高表達(dá)又具有顯著臨床意義的基因與人類基因組中14 871個LncRNA進(jìn)行重合性分析，共找到3個可能在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中具有明顯作用的LncRNA：ATP 2A 1-AS1、SOX 21-AS1和DLEU1。研究發(fā)現(xiàn)3種LncRNA在宮頸癌組織中相比于宮頸正常組織顯著高表達(dá)，詳見圖1.1。其中ATP 2A 1-AS1和SOX 21-AS1在宮頸癌中呈現(xiàn)顯著的高表達(dá)預(yù)后好特征(P=0.0042、P=0.0023)，而DLEU1宮頸癌中呈現(xiàn)顯著的高表達(dá)預(yù)后差特征(P=0.0023)，詳見圖1.2(見彩插2)，根據(jù)致癌因子屬性(高表達(dá)預(yù)后差)，因此我們選擇DLEU1作為研究目的LncRNA。

2.2 DLEU1在Hela細(xì)胞中的敲低效率

RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染無義序列、兩條siDLEU1后的Hela細(xì)胞中DLEU1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：敲低DLEU1組的DLEU1的相對表達(dá)量與對照組相比有顯著降低(P=0.001、0.001)，詳見下頁圖2。該結(jié)果同時證明si DLEU1的有效性和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的可靠性。

2.3 敲低DLEU1對Hela細(xì)胞的生長速率影響

在轉(zhuǎn)染無義序列和siDLEU1后的Hela細(xì)胞中通過細(xì)胞增殖實驗和克隆形成實驗進(jìn)一步評估DLEU1對Hela細(xì)胞生長速率的影響。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，敲低DLEU1表達(dá)的細(xì)胞增殖速率顯著減慢，提示DLEU1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長的作用(P<0.05，P<0.01)詳見下頁圖3.1?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示：與對照組相比，敲低DLEU1表達(dá)的細(xì)胞克隆形成速率顯著減慢，進(jìn)一步驗證了DLEU1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長的作用，詳見下頁圖3.2。

2.4 DLEU1主要定位于細(xì)胞核中發(fā)生作用

通過核質(zhì)分離實驗，用經(jīng)典位于細(xì)胞核中的標(biāo)志LncRNA NEAT1和經(jīng)典位于細(xì)胞質(zhì)中的標(biāo)志LncRNA DANCR作為對照，RT-qPCR實驗結(jié)果顯示DLEU1主要定位于細(xì)胞核中，詳見下頁圖4，為后續(xù)進(jìn)一步探討DLEU1在宮頸癌中發(fā)揮作用的方式提供參考。

2.5 DLEU1可能參與調(diào)控MYC從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長

通過將與DLEU1共表達(dá)基因在metascape數(shù)據(jù)庫[15]中參與的信號通路進(jìn)行分析，探索DLEU1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞生長的潛在分子機制。發(fā)現(xiàn)DLEU1顯著參與經(jīng)典致癌基因MYC的調(diào)控，詳見下頁圖5。

圖1.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示3個LncRNA在宮頸癌中的表達(dá)情況

2.6 DLEU1正調(diào)控MYC的表達(dá)

轉(zhuǎn)染無義序列和siDLEU1后的Hela細(xì)胞中通過RT-qPCR實驗和蛋白免疫印跡實驗進(jìn)一步評估DLEU1對MYC基因的表達(dá)調(diào)控。RT-qPCR結(jié)果顯示：與對照組相比，敲低DLEU1表達(dá)的Hela細(xì)胞中MYC基因的RNA水平表達(dá)顯著降低(P=0.001、0.002)，詳見圖6.1。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示：與對照組相比，敲低DLEU1表達(dá)的Hela細(xì)胞中MYC基因的蛋白水平表達(dá)顯著降低，詳見圖6.2。由此提示了在宮頸癌細(xì)胞中DLEU1正調(diào)控經(jīng)典致癌基因MYC的表達(dá)。

圖2 DLEU1在Hela細(xì)胞中的敲低效率

圖3.1 敲低DLEU1對Hela細(xì)胞增殖速率影響

圖3.2 敲低DLEU1對Hela細(xì)胞克隆形成速率影響

圖4 DLEU1主要定位于細(xì)胞核中

圖5 DLEU1可能參與調(diào)控MYC信號通路

圖6.1 RT-qPCR實驗驗證DLEU1正調(diào)控MYC的表達(dá)

圖6.2 蛋白免疫印跡實驗驗證DLEU1正調(diào)控MYC的表達(dá)

3 討論

宮頸癌是全球女性因婦科惡性腫瘤死亡的第四大死因，它需要新的潛在生物標(biāo)記物進(jìn)行診斷、治療和預(yù)后，以改善治療癌癥的臨床策略。近年來，LncRNA受到越來越多的關(guān)注。許多報告指出，LncRNA在生物學(xué)上對癌癥的發(fā)病機制很重要。有證據(jù)表明，LncRNA紊亂會導(dǎo)致一系列生物學(xué)功能，從而導(dǎo)致進(jìn)行性腫瘤和不受限制的腫瘤生長。LncRNA已被用作生物標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)[16]。人類基因組和轉(zhuǎn)錄組測序的進(jìn)步表明，大多數(shù)人類基因組都可以轉(zhuǎn)錄，但是只有一小部分的轉(zhuǎn)錄本可以編碼蛋白質(zhì)[17]。LncRNA通常調(diào)控不佳，現(xiàn)在已知在基因表達(dá)和各種生物學(xué)過程中起著越來越重要的作用，并且可以為宮頸癌提供一種新穎的治療方法[18]。研究表明，LncRNA已在包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤中異常表達(dá)[19]，例如LncRNA NORAD[20]，TPT1-AS1[21]和NEAT 1[22]可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。HOXD-AS1激發(fā)宮頸癌中的阿霉素抗性[23]。HOTAIR和CCHE 1在宮頸癌組織中過表達(dá)，HOTAIR和CCHE 1的高表達(dá)是宮頸癌的陰性預(yù)后因素[24]。在本文中，我們通過GEPIA數(shù)據(jù)庫將宮頸癌中高表達(dá)的基因和具有顯著臨床預(yù)后相關(guān)性的基因進(jìn)行重合性分析，共篩選到78個在宮頸癌中既高表達(dá)又具有顯著宮頸癌臨床預(yù)后相關(guān)性的基因，進(jìn)一步將這78個基因進(jìn)行分類，篩選到3個LncRNA：ATP 2A 1-AS1、SOX 21-AS1和DLEU1，最后根據(jù)高表達(dá)預(yù)后差原則確定DLEU1作為研究目的LncRNA。

據(jù)報道，位于13q14.3染色體上的LncRNA DLEU1在慢性淋巴細(xì)胞性白血病，多發(fā)性骨髓瘤，乳腺癌，胃癌和卵巢癌中失調(diào)[25]。DLEU1的高表達(dá)與胃癌的預(yù)后不良有關(guān)，并有助于細(xì)胞增殖。 顯示DLEU1通過與miR-490-3p相互作用來促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲[26]。迄今為止，研究表明DLEU1在幾種腫瘤中起著致癌LncRNA的作用[27]。但是，關(guān)于DLEU1在宮頸癌中的作用和上游調(diào)節(jié)機制知之甚少。在本文中，利用細(xì)胞增殖實驗及克隆形成實驗，我們同樣發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細(xì)胞中敲低DLEU1的表達(dá)，會顯著減慢宮頸癌細(xì)胞增殖和克隆形成速率，說明DLEU1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的致癌因子屬性。為了進(jìn)一步探討DLEU1在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮功能的潛在分子機制，作為LncRNA，我們首先研究了DLEU1的核質(zhì)定位，發(fā)現(xiàn)DLEU1主要分布在細(xì)胞核中，而在細(xì)胞核中，一般都是通過調(diào)控發(fā)揮功能，因此我們便將與DLEU1共表達(dá)的基因在metascape中進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DLEU1可能參與調(diào)控經(jīng)典的致癌因子MYC。MYC是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)包括發(fā)育和分化在內(nèi)的各種過程。它的調(diào)控功能之一涉及基因轉(zhuǎn)錄，在該基因轉(zhuǎn)錄中，它與位于基因啟動子區(qū)域的E-box序列(CANNTG)結(jié)合。據(jù)估計，MYC靶基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成了從蒼蠅到人類的所有基因的約15%。MYC基因敲除對小鼠具有致死性，可導(dǎo)致較小的胚胎和發(fā)育遲緩[28]。MYC還是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)劑，其敲除或敲低會嚴(yán)重影響細(xì)胞增殖[29]。 它還在細(xì)胞分化中起作用。MYC是由長期造血干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的，并平衡干細(xì)胞的自我更新和分化。在小鼠胚胎干細(xì)胞中，MYC通過誘導(dǎo)miRNA表達(dá)來抑制分化標(biāo)記基因的表達(dá)并影響干細(xì)胞的分化[30]。由此可見MYC在細(xì)胞進(jìn)程中的重要性，為了證明DLEU1對MYC的調(diào)控作用，我們在敲低DLEU1表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞中進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)敲低DLEU1的表達(dá)，不管是從RNA水平還是蛋白水平,MYC的表達(dá)都被降低，說明在宮頸癌細(xì)胞中DLEU1確實正調(diào)控經(jīng)典致癌因子MYC的表達(dá)。

綜上所述，宮頸癌中DLEU1可能通過高表達(dá)導(dǎo)致經(jīng)典致癌因子MYC的高表達(dá)，因此促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。