叔丁基對(duì)苯二酚(tBHQ)對(duì)2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的長(zhǎng)期保護(hù)作用△

羅云霞 余曦 田敏 鄧偲捷 呂紅彬

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病(DM)常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，是工作年齡人群第一位的致盲疾病[1]。DR的發(fā)生發(fā)展與組織缺血缺氧、新生血管形成密切相關(guān)，新生血管的形成可能導(dǎo)致玻璃體積血、牽拉性視網(wǎng)膜脫離，嚴(yán)重影響患者視功能[1]。目前DR發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。長(zhǎng)期慢性高血糖、缺氧可誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)產(chǎn)生，HIF-1α是新生血管形成過(guò)程中的關(guān)鍵因子，可刺激下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等的表達(dá)，促進(jìn)新生血管形成，加重DR缺血缺氧[2]。PI3K/Akt通路是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成的關(guān)鍵信號(hào)通路[3]。叔丁基對(duì)苯二酚(tBHQ)是食品中常見(jiàn)的抗氧化添加劑，可通過(guò)激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2) 與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合發(fā)揮抗氧化作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)tBHQ干預(yù)2型DM大鼠，觀察干預(yù)后4周、12周和20周時(shí)大鼠空腹血糖、血脂及視網(wǎng)膜中PI3K、HIF-1α和VEGF的表達(dá)，探索tBHQ對(duì)2型DM大鼠視網(wǎng)膜的長(zhǎng)期保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康雄性Sprague Dawley大鼠(6周齡左右，體質(zhì)量160～180 g)90只，購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取18只大鼠作為正常對(duì)照組(NC組)，其余72只作為造模組。NC組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)。4周后，造模組大鼠禁食12 h后腹腔注射30 mg·kg-1鏈脲佐菌素(STZ)，1周后尾靜脈采血，如血糖≥16.7 mmol·L-1視為造模成功，剔除造模失敗的4只大鼠，68只造模成功大鼠進(jìn)一步隨機(jī)分為DM組34只及tBHQ組(34只)。DM組繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)，tBHQ組則于成模后1周喂養(yǎng)添加10 g·L-1tBHQ的高脂高糖飼料。去除飼養(yǎng)過(guò)程中死亡的大鼠后，最終NC組18只，DM組26只，tBHQ組29只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和管理遵守國(guó)家及西南醫(yī)科大學(xué)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.1.2 主要試劑及儀器STZ(美國(guó)Sigma公司)；tBHQ(比利時(shí)Acros公司)；總RNA 提取試劑盒、qRT-PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green染料(日本寶生物工程有限公司)；兔抗大鼠PI3K、HIF-1α多克隆抗體(美國(guó) Abcom公司)；PI3K、HIF-1α、VEGF、GAPDH引物序列(上海生工生物工程有限公司)。血糖儀(德國(guó)羅氏公司)；qRT-PCR儀CFX96(美國(guó)BIO-RAD公司)；7180全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)；Leica生物顯微鏡(德國(guó)Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 生化指標(biāo)檢測(cè)及眼球標(biāo)本制備分別于tBHQ干預(yù)后4周、12周和20周時(shí)，將3組大鼠禁食過(guò)夜后，采用10 g·L-1戊巴比妥鈉50 mg·kg-1腹腔內(nèi)注射，待大鼠麻醉生效后行心臟穿刺采血，采用7180全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組大鼠血脂和空腹血糖。其中干預(yù)后4周、12周，每組各隨機(jī)選擇8只大鼠用于實(shí)驗(yàn)；干預(yù)后20周，各組剩余大鼠全部用于實(shí)驗(yàn)。心臟采血后處死各組大鼠，摘除雙眼眼球，其中一只眼球以40 g·L-1多聚甲醛溶液固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋后以5 μm連續(xù)切片；另一只眼球快速分離出大鼠視網(wǎng)膜，于PBS中漂洗后迅速放入無(wú)RNA酶的EP管中，立即于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HE染色和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組大鼠眼球石蠟切片部分用于常規(guī)HE染色，中性樹(shù)膠封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)；部分用于標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)染色，采用兔抗大鼠PI3K和HIF-1α多克隆抗體作為一抗，加二抗后DAB顯色。免疫組織化學(xué)切片于高倍鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)不同視野拍照，使用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析，以棕黃色或棕褐色著色者為陽(yáng)性反應(yīng)，測(cè)定單位面積的平均光密度值。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)RNA提取試劑盒提取各組大鼠視網(wǎng)膜總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR法擴(kuò)增cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，計(jì)算PI3K、HIF-1α、VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：HIF-1α：正向引物為5’-GTGCTGATTTGTGAACCCATTC-3’，反向引物為5’- TCAACCCAGACATATCCACCTC-3’；VEGF：正向引物為5’- GCTACTGCCGTCCGATTGAG-3’，反向引物為5’-GGCTTTGTTCTGTCTTTCTTTGGT-3’；PI3K：正向引物為5’- CACGGCGATTACACTCTTACACT-3’，反向引物為5’- ATCCTGCTGGTATTTGGACACT-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。三樣本均數(shù)比較，符合正態(tài)分布且方差齊者用方差檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較用LSD法；方差不齊者行Welch方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況干預(yù)后4周、12周、20周，3組大鼠間空腹血糖水平總體差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。與同時(shí)間點(diǎn)NC組相比，DM組大鼠空腹血糖均明顯升高(均為P<0.05)；與同時(shí)間點(diǎn)DM組相比，tBHQ組大鼠空腹血糖均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。干預(yù)后4周、12周、20周，DM組大鼠空腹血糖水平總體差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.323,P<0.01)，隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，DM組大鼠空腹血糖呈升高趨勢(shì)。tBHQ組在不同時(shí)間點(diǎn)空腹血糖水平總體呈逐漸降低的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)空腹血糖水平

2.2 各組大鼠血脂情況干預(yù)后4周、12周、20周，DM組、tBHQ組和NC組間TC、LDL-C水平比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，DM組、tBHQ組TC、LDL-C水平均較NC組升高(均為P<0.01);干預(yù)后4周，tBHQ組TC、LDL-C水平與DM組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.109、0.581);干預(yù)后12周、20周，tBHQ組TC、LDL-C水平均較DM組降低(均為P<0.05)。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，DM組大鼠TC水平呈升高趨勢(shì)(F=25.163,P<0.01)；tBHQ組在干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)間TC水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.027,P=0.155)。干預(yù)后4周、12周、20周，DM組、tBHQ組和NC組間TG水平比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；DM組TG水平均較NC組升高(均為P<0.01)；tBHQ組TG水平均較DM組降低(均為P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中TC、TG和LDL-C變化情況

2.3 各組視網(wǎng)膜HE染色結(jié)果不同時(shí)間點(diǎn)NC組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)均清晰，細(xì)胞排列均整齊。干預(yù)后4周，DM組、tBHQ組大鼠視網(wǎng)膜各層排列稍紊亂。干預(yù)后12周，DM組、tBHQ組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈空泡樣改變，內(nèi)叢狀層、外叢狀層排列紊亂、變薄，內(nèi)核層、外核層細(xì)胞密度減少，排列稀疏，厚度變?。籺BHQ組較DM組形態(tài)改變輕。干預(yù)后20周，DM組大鼠視網(wǎng)膜各層水腫，形態(tài)學(xué)改變較干預(yù)后12周更為明顯；tBHQ 組較DM組視網(wǎng)膜各層排列整齊，水腫不明顯(圖1)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)(HE染色,×400) A、B、C為干預(yù)后4周，D、E、F為干預(yù)后12周，G、H、I為干預(yù)后20周；A、D、G為NC組，B、E、H為DM組，C、F、I為tBHQ組。

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜PI3K和HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量PI3K主要表達(dá)于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，少部分表達(dá)于內(nèi)核層，HIF-1α主要表達(dá)于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層。干預(yù)后4周、12周、20周，NC組大鼠視網(wǎng)膜可見(jiàn)少量PI3K和HIF-1α蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，DM組、tBHQ組PI3K和HIF-1α蛋白的陽(yáng)性表達(dá)量均顯著增加。3組大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜中PI3K和HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)水平總體差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)DM組、tBHQ組大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α和PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量均較NC組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均

為P<0.05)。干預(yù)后12周、20周，tBHQ組HIF-1α和PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量均較DM組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。tBHQ組大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間增加呈下降趨勢(shì)(F=21.30,P<0.01)，PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.226,P=0.802)。DM組大鼠視網(wǎng)膜PI3K蛋白相對(duì)表達(dá)量干預(yù)后20周均較干預(yù)后12周、4周增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)(見(jiàn)圖2)。

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜PI3K、HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量 注：與同時(shí)間點(diǎn)NC組比較，*P<0.05；與同時(shí)間點(diǎn)DM組比較，#P<0.05。

2.5 3組大鼠視網(wǎng)膜中PI3K、HIF-1α和VEGF mRNA的表達(dá)干預(yù)后4周、12周、20周，3組大鼠間視網(wǎng)膜HIF-1α、VEGF和PI3K mRNA相對(duì)表達(dá)量總體差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。不同時(shí)間點(diǎn)DM組HIF-1α、VEGF、PI3K mRNA相對(duì)表達(dá)量均較同時(shí)間點(diǎn)NC組增加，tBHQ組均較同期DM組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(圖3)。DM組PI3K mRNA相對(duì)表達(dá)量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(均為P<0.05)，VEGF和HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量在干預(yù)后20周均較干預(yù)后4周明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)3組大鼠視網(wǎng)膜中PI3K、HIF-1α、VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量 注：與同時(shí)間點(diǎn)NC組比較，*P<0.05；與同時(shí)間點(diǎn)DM組比較，#P<0.05；與干預(yù)后4周時(shí)DM組比較，▲P<0.05；與干預(yù)后12周時(shí)DM組比較，△P<0.05。

3 討論

根據(jù)國(guó)際DM聯(lián)盟發(fā)布的第九版全球DM地圖，2019年DM年齡標(biāo)化患病率為8.3%，預(yù)計(jì)2030年為9.2%，中國(guó)DM患者數(shù)量居世界之首[6]，有研究表明，35%的 DM患者伴隨有不同程度的DR[7]。發(fā)生DR的危險(xiǎn)因素眾多，包括高血壓、高血糖、高血脂、高年齡和遺傳傾向等[8]。DR是DM常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，血-視網(wǎng)膜屏障破壞及新生血管形成是最終導(dǎo)致失明的主要原因[9]。tBHQ是食品中常用的抗氧化劑，具有抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化和神經(jīng)保護(hù)作用[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腹腔注射STZ并予以高脂高糖飲食成功誘導(dǎo)2型DM大鼠模型，DM組大鼠TC、TG和LDL-C水平均較NC組明顯升高。

前期研究表明，tBHQ通過(guò)激活Nrf2/ARE通路誘導(dǎo)一系列抗氧化作用[4-5]。但有研究表明，除Nrf2/ARE通路外，tBHQ還可通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用[11]。Bahia等[12]研究表明，tBHQ可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制FoxO3a的轉(zhuǎn)運(yùn)和活性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。因此，值得進(jìn)一步探索tBHQ對(duì)2型DM患者視網(wǎng)膜的保護(hù)機(jī)制及是否具有長(zhǎng)期保護(hù)作用。

缺氧是導(dǎo)致DR至關(guān)重要的因素，在缺氧條件下，HIF-1α亞基與β亞基形成復(fù)合體異位到細(xì)胞核內(nèi)與HIF反應(yīng)元件結(jié)合，參與氧化應(yīng)激、凋亡、新生血管形成等一系列反應(yīng)[13]。STZ誘導(dǎo)的DM 大鼠胰島素分泌降低，組織對(duì)葡萄糖的攝取能力降低，加劇了視網(wǎng)膜的缺血缺氧。HIF-1α是機(jī)體適應(yīng)氧濃度變化的主要轉(zhuǎn)錄因子，Zhang等[2]通過(guò)玻璃體內(nèi)注射HIF-1α反義寡核苷酸發(fā)現(xiàn)，玻璃體內(nèi)HIF-1α與VEGF表達(dá)呈現(xiàn)一致性，抑制HIF-1α可減輕視網(wǎng)膜新生血管形成，且HIF-1α表達(dá)隨DR病程延長(zhǎng)而增加。本實(shí)驗(yàn)中，DM組大鼠HIF-1α表達(dá)隨喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而有所增加，干預(yù)后4周、12周和20周，tBHQ組HIF-1α表達(dá)均較同時(shí)間點(diǎn)DM組下降，說(shuō)明tBHQ可以通過(guò)抑制HIF-1α表達(dá)，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，從而抑制視網(wǎng)膜新生血管形成。有研究表明，在高糖環(huán)境下，HIF-1α蛋白表達(dá)水平增加并增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，刺激下游基因如VEGF等表達(dá)，促進(jìn)新生血管形成[14]。HIF-1α也可以調(diào)節(jié)細(xì)胞葡萄糖攝取的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(glucose transporter 1,GLUT1)和GLUT3的表達(dá)，參與糖酵解過(guò)程的酶的表達(dá)，加重組織的缺血缺氧，再次刺激HIF-1α的表達(dá)[15]。本研究干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)，tBHQ組大鼠血糖均較DM組明顯降低，且干預(yù)后20周時(shí)血糖較同時(shí)間點(diǎn)DM組降低幅度更大，說(shuō)明tBHQ有一定的降低血糖作用，可能間接影響了視網(wǎng)膜組織中HIF-1α的表達(dá)，同時(shí)說(shuō)明tBHQ對(duì)DM組大鼠視網(wǎng)膜具有長(zhǎng)期保護(hù)作用。干預(yù)后20周時(shí)tBHQ組大鼠空腹血糖較同時(shí)間點(diǎn)NC組仍升高，說(shuō)明tBHQ改善胰島素β細(xì)胞的功能具有一定局限性。

PI3K/Akt通路是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成的關(guān)鍵信號(hào)通路[3]。Liu等[16]研究表明，在高糖環(huán)境下，PI3K/Akt通路對(duì)Nrf2表達(dá)的調(diào)控在細(xì)胞抗氧化和抗凋亡反應(yīng)的調(diào)控中起重要作用。Paeng等[17]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧條件下活性氧簇生成時(shí)，PI3K/Akt激活誘導(dǎo)VEGF生成的上游信號(hào)，使用活性氧抑制劑可顯著地抑制PI3K/AKT的激活，以及HIF-1α和VEGF的表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果部分一致。本實(shí)驗(yàn)中，DM組視網(wǎng)膜PI3K表達(dá)較NC組增加，且隨著高糖狀態(tài)時(shí)間的延長(zhǎng)，干預(yù)后20周較干預(yù)后12周和4周明顯升高，tBHQ組PI3K表達(dá)較DM組明顯降低，在干預(yù)后20周趨勢(shì)更加明顯。這說(shuō)明tBHQ對(duì)2型DM大鼠視網(wǎng)膜起保護(hù)作用可能是通過(guò)抑制PI3K/Akt通路從而抑制HIF-1α/VEGF表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上，本研究結(jié)果表明，tBHQ對(duì)2型DM大鼠視網(wǎng)膜具有較長(zhǎng)的保護(hù)作用，且其機(jī)制可能是通過(guò)PI3K/HIF-1α/VEGF通路實(shí)現(xiàn)的。