洛伐他汀高產(chǎn)菌株的選育

摘 要：為了提高紅曲霉發(fā)酵生產(chǎn)洛伐他汀的能力，分別采用紫外線、亞硝酸、硫酸二乙酯對(duì)出發(fā)菌株（Monascus sp.）進(jìn)行誘變處理。結(jié)果表明：3種誘變劑對(duì)Monascus sp.的誘變效果有較大差異，其中紫外線誘變效果最好，硫酸二乙酯次之，亞硝酸最差。通過(guò)篩選，得到2株高產(chǎn)突變株，分別命名為：Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8，其產(chǎn)量分別為 0.239 mg/mL、0.223 mg/mL，比原始菌株分別提高了42.3%、32.7 %。遺傳穩(wěn)定試驗(yàn)結(jié)果顯示，Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8遺傳性能較穩(wěn)定，可應(yīng)用于生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：洛伐他汀；紅曲霉；誘變；紫外線；硫酸二乙酯；亞硝酸

中圖分類號(hào) S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）12-0027-03

Abatract：In order to improve lovstatin yield of Monascus sp.，the starting strains were treated by treated by UV，HNO2 and DES respectively. The results showed that three kinds of Mutagens had different effects on Monascus sp.，UV had best mutagenesis effects，then was DES and HNO2 was the worst. Two high and stable yield mutants were obtained and named Monascus sp. UV-5 and Monascus sp.DE-8 respectively.The lovstatin yield of Monascus sp.UV-5，Monascus sp. DE-8 was 0.239mg/mL and 0.223 mg/mL，which increased 42.3% and 32.7% compared with the original strain.The consecutive culture of Monascus sp. UV-5，Monascus sp. DE-8 showed that genetic performance was stable and can be used in production.

Key words：Lovstatin；Monascus sp.；Mutagenesis；UV；DES；Nitrous acid

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，人民生活水平不斷提高。我國(guó)民眾的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的改變，過(guò)多地?cái)z入高熱量、高脂質(zhì)的食物，導(dǎo)致高血脂、高血壓、冠心病等“富貴病”發(fā)病率顯著增加。目前，臨床上治療該類疾病的主要是他汀類藥物，最重要的是洛伐他汀。洛伐他?。↙ovastatin）是一類在臨床上應(yīng)用廣泛的降血脂、降膽固醇藥物，作為體內(nèi)羥甲戊二酰輔酶A（HMG-CoA）的結(jié)構(gòu)類似物，能競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMG-CoA的代謝，減少機(jī)體內(nèi)膽固醇的生成，從而對(duì)高血壓和冠心病等疾病起到積極的防治作用[1-4]。當(dāng)前，洛伐他汀主要是通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)，在微生物發(fā)酵中，優(yōu)良的菌種是獲得生產(chǎn)成功的關(guān)鍵[5]。誘變育種是獲得高產(chǎn)菌株的簡(jiǎn)便有效的手段在微生物育種中被廣泛應(yīng)用。課題組采用多種誘變劑對(duì)洛伐他汀產(chǎn)生菌株紅曲霉進(jìn)行處理，以期獲得穩(wěn)定高產(chǎn)菌株，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)功能性紅曲提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 紅曲霉（Monascus sp.），粗糙脈胞菌（Neurospora crassa），均購(gòu)于中科院微生物所，保藏于本院院生物制藥國(guó)家級(jí)實(shí)訓(xùn)基地。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基及平板培養(yǎng)基：馬鈴薯蔗糖固體（PDA）培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯蔗糖液體（PD）培養(yǎng)基。

1.1.3 洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥98%，購(gòu)于上海永葉生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 HJ-1磁力攪拌器（江蘇醫(yī)療）；CBV-1500A超凈工作臺(tái)（上海瑞仰）；QYC.2102搖床（上海?，敚?；HPS-250生化培養(yǎng)箱（哈爾濱東明）；高效液相色譜儀（美國(guó)戴安）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫外線（UV）誘變 在超凈工作臺(tái)上，用接種環(huán)取紅曲霉孢子2環(huán)，用無(wú)菌水制成孢子懸液，將孢子懸液分成6份（各5mL），放在紫外誘變裝置中分別處理0s、30s、60s、90s、120s、150s。然后取誘變處理后的孢子懸液0.1mL分別涂布于6個(gè)固體平板上，倒置培養(yǎng)3d，計(jì)算致死率[6]。再分別取0.5mL誘變后的孢子液進(jìn)行管碟法試驗(yàn)，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，初篩突變株。突變效果好的進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，以洛伐他汀產(chǎn)量為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，并評(píng)價(jià)誘變效果。

1.2.2 亞硝酸（HNO2）誘變 孢子懸液制備方法同1.2.1，將孢子懸液分成6份（各5mL），分別加入0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25mol/L NaNO2溶液1mL，然后加入1mL pH4.4醋酸緩沖液，于32℃保溫處理20min，加入pH8.6的Na2HPO4溶液，調(diào)整pH為7，終止誘變作用。適當(dāng)稀釋后涂布于固體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算致死率[6]。再分別取0.5mL誘變后的孢子液進(jìn)行管碟法試驗(yàn)，以抑菌圈直徑為指標(biāo)，初篩突變株。突變效果好的進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，以洛伐他汀產(chǎn)量為指標(biāo)進(jìn)行復(fù)篩，并評(píng)價(jià)誘變效果。

1.2.3 硫酸二乙酯（DES）誘變 孢子懸液制備方法同1.2.1，將孢子懸液分成6份（各5mL），分別加入0%、1%、2%、3%、4%、5%（v/v）的DES溶液5mL誘變處理10min，立刻加10mL的25%硫代硫酸鈉溶液中止反應(yīng)。誘變后的孢子懸液經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)南♂尯螅〕?.1mL孢子液涂布到分別固體平板培養(yǎng)基上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算致死率。并進(jìn)行管碟法初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，并評(píng)價(jià)誘變效果。

1.2.4 菌種篩選 采用管碟法[7]進(jìn)行初篩。利用粗糙脈胞菌對(duì)洛伐他汀敏感的原理，在粗糙脈孢菌孢子液的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，通過(guò)測(cè)量抑菌圈直徑D進(jìn)行初篩。

采用HPLC法進(jìn)行復(fù)篩。高效液相測(cè)定洛伐他汀的條件為[8]：色譜柱：XDB C18柱；檢測(cè)波長(zhǎng)237nm，流動(dòng)相：甲醇：水（體積比為70：30），柱溫26℃，體積流量1.0mL/min，進(jìn)樣量20μL。

1.2.5 突變株遺傳穩(wěn)定性研究 將篩選到的實(shí)變株進(jìn)行斜面?zhèn)鞔鷮?shí)驗(yàn)，連續(xù)傳種5代，分別測(cè)定洛伐他汀的產(chǎn)量，考察菌株的遺傳穩(wěn)定性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種誘變劑致線曲線與分析

由圖1、圖3可知，紅曲霉菌株對(duì)UV、DES均比較敏感，致死率與誘變劑劑量呈正相關(guān)。當(dāng)UV照射時(shí)間為120s 時(shí)，致死率為72.1%。DES濃度為4%時(shí)，致死率為74.6%。由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，紅曲霉對(duì)HNO2不敏感，致死率低且變化不明顯，因此，不宜選HNO2作為紅曲霉的誘變劑。

2.2 UV誘變結(jié)果 從篩選平板上挑取抑菌圈直徑D≥1.48cm的10株菌株孢子，置于溫度為32℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min搖床上發(fā)酵7d，測(cè)洛伐他汀產(chǎn)量。所得結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，在所得到的10株突變株中，抑菌圈直徑比原始菌株均有不同程度的增加，但洛伐他汀的產(chǎn)量則有高有低，總的來(lái)看大部分菌株的產(chǎn)量是提高的，即發(fā)生了正向突變，如UV-5、UV-10；而有少部分菌株的產(chǎn)量不升反降，如：UV-6、UV-9。其中UV-5的產(chǎn)量最高，達(dá)到了0.239mg/mL，相對(duì)于出發(fā)菌株提高了42.3%。說(shuō)明出發(fā)菌株（Monascus sp.）對(duì)紫外線敏感，采用紫外線單因素處理即可得到較理想的誘變效果。

2.3 HNO2誘變結(jié)果 經(jīng)亞硝酸誘變后，通過(guò)初篩選擇9株抑菌圈直徑D≥1.42cm的突變株，置于溫度為32℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min搖床上發(fā)酵7d，測(cè)洛伐他汀產(chǎn)量。所得結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，經(jīng)亞硝酸誘變后，紅曲霉對(duì)粗糙脈胞菌抑菌圈直徑及洛伐他汀產(chǎn)量變化幅度均較小。在所得的9株紅曲霉突變株中，抑菌圈變化范圍1.42～1.76cm之間，洛伐他汀產(chǎn)量最高是HN-4、HN-8菌株，均為0.184mg/mL，比出發(fā)菌株的產(chǎn)量提高不到10%，說(shuō)明該紅曲霉對(duì)亞硝酸不大敏感，這與致線曲線分析是一致的。

2.4 DES誘變結(jié)果 經(jīng)硫酸二乙酯誘變后，通過(guò)初篩選擇10株抑菌圈直徑D≥1.52cm的突變株，置于溫度為32℃、轉(zhuǎn)速為160r/min搖床上發(fā)酵7d，測(cè)洛伐他汀產(chǎn)量。得到結(jié)果見(jiàn)表3。

表3結(jié)果表明，篩選所得到的10株突變株中，大部分菌株發(fā)生了正向突變，產(chǎn)量均有不同程度提高，其中洛伐他汀產(chǎn)量最高的菌株為DE-8，達(dá)到了0.223mg/mL，增幅為32.7%。說(shuō)明該紅曲霉對(duì)DES較為敏感，應(yīng)用DES對(duì)其進(jìn)行誘變育種能得到較理想的效果。但從洛伐他汀產(chǎn)量的提高幅度來(lái)看，DES的誘變效果不如UV好?？赡艿脑蚴谴藘煞N誘變劑的誘變機(jī)理不相同所造成的，UV能誘發(fā)DNA形成胸腺嘧啶二聚體，導(dǎo)致復(fù)制中發(fā)生錯(cuò)配而引起突變；而DES能與DNA中堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，使堿基結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致堿基配對(duì)的轉(zhuǎn)換或顛換，從而引起突變[9]。

2.5 UV-5、DE-8遺傳穩(wěn)定性研究 對(duì)UV-5、DE-8菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性能測(cè)定，在斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行5次傳代實(shí)驗(yàn)，以洛伐他汀產(chǎn)量為測(cè)試指標(biāo)，所得結(jié)果如表4所示。從表4可以看出，該2菌株洛伐他汀產(chǎn)量均較穩(wěn)定，相對(duì)產(chǎn)量≥95%。表明它們的遺傳性能均穩(wěn)定，有一定的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

采用UV、DES、HNO2 3種誘變劑分別對(duì)紅曲霉進(jìn)行誘變，采用管碟法初篩結(jié)合HPLC法復(fù)篩的方法選育高產(chǎn)菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：3種誘變劑對(duì)Monascus sp.的誘變效果有較大差異，其中紫外線誘變效果最好，硫酸二乙酯次之，亞硝酸最差。通過(guò)篩選得到2株高產(chǎn)突變株，分別命名為：Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8，產(chǎn)量分別為 0.239mg/mL、0.223mg/mL，比原始菌株分別提高了42.3%、 32.7 %。遺傳穩(wěn)定試驗(yàn)顯示，Monascus sp.UV-5、Monascus sp.DE-8遺傳性能較穩(wěn)定，可應(yīng)用于生產(chǎn)。因此誘變育種是微生物育種中一種簡(jiǎn)便、有效的方法。但UV與DES對(duì)紅曲霉誘變是否有協(xié)同作用，需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

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