廈門地區(qū)9249例女性人乳頭瘤病毒基因分型檢測及結(jié)果分析

張玉鳳 雷麗云 林 云 羅 巧

1.廈門市中醫(yī)院病理科，福建廈門 361000；2.廈門市中醫(yī)院婦科，福建廈門 361000

人乳頭瘤病毒（HPV）感染是生殖器疣、宮頸癌、陰莖癌以及肛門癌等的主要病因?qū)W因素之一[1-2]。目前發(fā)現(xiàn)HPV 有200 多種型別，其中大約40種型別與人類常見生殖道疾病有關(guān)[3]。各種HPV 亞型的致病力也是不一樣的，而且HPV 亞型的地域分布也是不一樣的。有研究表明，超過99%的宮頸癌患者均能檢測出HPV 感染，其中最為常見的HPV 分型為HPV 16、HPV 18 高危亞型[4]。宮頸癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化的狀態(tài)，廣大婦女的身心健康己經(jīng)受到嚴(yán)重的危害。然而大部分患者感染HPV后并沒有臨床癥狀，在經(jīng)過相關(guān)檢測后才知曉。發(fā)展成宮頸癌需要很長的時(shí)間，從癌前病變發(fā)展成宮頸癌大約需要十多年的時(shí)間，如果在癌前病變期盡早發(fā)現(xiàn)并給予規(guī)范治療，那么就能有效防止宮頸癌的出現(xiàn)[5]。因此，了解本地區(qū)女性HPV 感染的流行現(xiàn)狀，對本區(qū)域女性宮頸癌及高級(jí)別宮頸上皮不典型增生的早診斷、早預(yù)防有非常重要的意義。本研究對廈門市中醫(yī)院9249例患者的宮頸拭子標(biāo)本采用流式熒光雜交法進(jìn)行檢測，并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年7月～2019年6月在廈門市中醫(yī)院婦科門診就診的9249例患者作為研究對象，采用流式熒光雜交法對患者的宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行HPV 基因檢測。患者年齡18～79歲，平均（37.8±6.3）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲患者；②患者48 h 內(nèi)無性生活。排除標(biāo)準(zhǔn)：①生殖系統(tǒng)出血者；②3 d 內(nèi)存在陰道用藥史與陰道沖洗史者；③凝血功能障礙者；④嚴(yán)重器官功能衰竭者。參與本試驗(yàn)項(xiàng)目的患者均對本研究知情同意，本研究經(jīng)過廈門市中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

首先用棉拭子擦去宮頸口的分泌物，然后把宮頸刷伸到宮頸口處，緊貼宮頸口順時(shí)針方向輕柔轉(zhuǎn)動(dòng)4～5 周，慢慢取出宮頸刷，放入裝有細(xì)胞保存液（麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)18030102）的洗脫管中，在管口處沿刷柄折痕將宮頸刷折斷，宮頸刷留在洗脫管中，旋緊管蓋，1 周內(nèi)檢測。

1.2.2 試劑與儀器

HPV 核酸分型檢測試劑盒（上海透景生命科技股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)19A006）；核酸提取試劑（上海透景生命科技股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)19A003）；LifeECO 基因擴(kuò)增儀[杭州博日科技有限公司，型號(hào)TC-96/G/H（b）C]；HPV 分析儀（美國路明克斯公司，型號(hào)Luminex200）；金屬?。ê贾輮W盛儀器有限公司，型號(hào)MK-10）。

1.2.3 HPV 檢測方法

1.2.3.1 PCR 樣本處理 ①將裝有宮頸刷的樣本瓶振蕩混勻，取200 μL 脫落細(xì)胞樣本放入1.5 mL 潔凈EP 管內(nèi)，14 000 r/min 離心3 min；②吸棄上清液（務(wù)必去干凈），加入200 μL 核酸提取試劑（吸取前搖勻），振蕩混勻，放入100℃金屬浴中加熱15 min；③將EP管從金屬浴中取出，14 000 r/min 離心5 min，取5 μL上清液用于PCR 擴(kuò)增。

1.2.3.2 PCR 擴(kuò)增 包括預(yù)混液10 μL，引物混合液5.0 μL，聚合酶0.8 μL，待檢上清5 μL，總反應(yīng)總體積20.8 μL，按HPV 核酸分型檢測試劑盒說明書進(jìn)行共計(jì)42個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。

1.2.3.3 雜交過程 ①打開HPV 核酸分析儀預(yù)熱，并將96 微孔銅板放置在儀器加熱板上，將溫度設(shè)定在48℃；②將裝有微球雜交液試劑瓶振蕩混勻1 min，取22 μL 微球雜交液裝入微孔雜交板內(nèi)，再在孔內(nèi)加入3 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，并抽吸幾次混勻，貼上封板紙封嚴(yán)上機(jī)，程序如下：95℃5 min 變性，48℃30 min 雜交，48℃15 min 孵育，48°C Forever（建議1 h 內(nèi)讀數(shù)）；③小心撕下封板紙，每孔快速加入鏈霉親和素-藻紅蛋白溶液75 μL，加完后將封板紙重新粘好，繼續(xù)在48℃下孵育15 min；④將微孔雜交板快速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱好的HPV 核酸分析儀上進(jìn)行檢測。

1.2.3.4 結(jié)果判定 當(dāng)陽性內(nèi)對照Globin 信號(hào)＞150 且HPV型別特異性探針信號(hào)＞150 時(shí)，則判斷該探針對應(yīng)的HPV型別為陽性；該試劑盒能檢測27種HPV亞型，分別是：6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、55、56、58、59、61、66、68、81、82、83。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察入選患者發(fā)生HPV 感染的情況，分析不同年齡段患者的HPV 感染情況，考察患者感染HPV 亞型的分布情況、單一感染及多重感染情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡組HPV 基因型的感染分布情況

9249例患者中檢出陽性病例1523例，陽性率為16.47%。共分成7個(gè)年齡組，＜20歲年齡組的檢出率最高，達(dá)35.29%，其次是20～＜30歲年齡組和60～＜70歲年齡組，檢出率分別為18.77%和18.13%。＜20歲年齡組的檢出率與其他年齡組檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。30～＜40歲年齡組的HPV陽性人數(shù)占總陽性人數(shù)的占比為34.87%，20～＜30歲年齡組的HPV陽性人數(shù)占總陽性人數(shù)的占比為28.56%，40～＜50歲年齡組的HPV陽性人數(shù)占總陽性人數(shù)的占比24.95%，具體分布情況見表1。

2.2 HPV陽性患者中不同亞型的構(gòu)成比分布情況

1523例HPV陽性患者中，不同亞型的構(gòu)成比不同，前7 位依次為52、16、58、53、39、61、81型，其構(gòu)成比分別為18.38%、10.64%、10.44%、9.32%、8.21%、7.62%、6.63%，合計(jì)71.24%，具體HPV 亞型檢出分布情況見表2。

2.3 HPV陽性患者中單一感染和多重感染的分布情況

1523例HPV陽性患者中，單一感染有1148例，占75.38%，多重感染有375例，占26.62%。其中多重感染主要是以二重感染為主，為260例，占HPV陽性患者的17.07%，占多重感染的69.33%（表3）。

表1 不同年齡組HPV 基因型的感染分布情況

表2 1523例HPV陽性患者中不同亞型的構(gòu)成比分布情況

表3 1523例HPV陽性患者中單一感染和多重感染的分布情況

3 討論

HPV 是一種嗜人體皮膚和黏膜組織細(xì)胞的DNA病毒，人類皮膚、生殖道、呼吸道上皮組織都是它感染的對象，人類有多種良惡性腫瘤都與它有關(guān)。女性生殖器官惡性腫瘤中排第一位就是宮頸癌，宮頸癌和癌前病變的主要因素就是高危型HPV 的持續(xù)性感染。在某些條件下，比如機(jī)體免疫力下降或同時(shí)存在其他感染因素時(shí)，高危型HPV 的持續(xù)感染可影響宮頸上皮細(xì)胞遺傳物質(zhì)DNA 穩(wěn)定性，容易出現(xiàn)惡性增殖，形成浸潤性病變，最終導(dǎo)致宮頸癌[6]。女性的HPV 感染大部分都是一過性，大部分女性感染后大約在2年以內(nèi)自然消退，只有少數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)HPV 持續(xù)感染狀態(tài)，并導(dǎo)致宮頸上皮不典型增生甚至宮頸癌的發(fā)生。女性從感染HPV 到宮頸上皮不典型增生再到宮頸癌，大概要經(jīng)歷10年的時(shí)間，而且只要處理得當(dāng)，宮頸上皮不典型增生是完全可逆的。因此，臨床上對高危感染人群開展HPV 檢測是非常必要的，這對于盡早發(fā)現(xiàn)宮頸癌高?；颊撸瑢ζ溥M(jìn)行早期防治有著非常重要的意義。

研究表明，HPV 感染和年齡有相關(guān)性[7-8]。本研究結(jié)果顯示，不同年齡段的HPV陽性檢出率有較大的差異，＜20歲年齡組的檢出率最高，達(dá)35.29%，其次是20～＜30歲年齡組和60～＜70歲年齡組，檢出率分別為18.77%和18.13%。＜20歲年齡組的檢出率與其他年齡組檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與國內(nèi)其他學(xué)者報(bào)道[7-11]有所不同。＜20歲女性的HPV 檢出率最高，這說明HPV 感染有年輕化的趨勢，可能與其處于性行為活躍期、性健康知識(shí)缺乏及其性行為缺乏保護(hù)性措施等有關(guān)。本研究中，20～＜50歲年齡段的HPV陽性患者人數(shù)占總陽性人數(shù)的占比為88.38%，20～＜50歲年齡段處于為性活動(dòng)頻繁時(shí)期，說明性生活頻繁與HPV 感染有相關(guān)性，結(jié)果與程倩[12]報(bào)道類似。有研究表明，感染高危型HPV 的婦女如果不能在絕經(jīng)前清除HPV 感染，那么其在絕經(jīng)后更容易發(fā)展成宮頸癌[13]，可能的原因是機(jī)體自身免疫力下降以及絕經(jīng)后激素水平的改變。本研究中60～＜70歲年齡組的HPV陽性檢出率是一個(gè)小高峰，這說明臨床HPV檢測對早期防治宮頸癌非常有必要。

有研究顯示[14-15]，不同地域的HPV 亞型分布是有差異的。本研究結(jié)果顯示，1523例HPV陽性患者中，不同亞型的構(gòu)成比前5 位依次為52、16、58、53、39型，與國內(nèi)其他學(xué)者報(bào)道[14-18]有所不同，但相同的是在于這些報(bào)道中HPV 感染率排名前5 的亞型均包含有52、16、58型。本研究中，這前5種亞型檢出例數(shù)的占比合計(jì)為56.98%，可見廈門地區(qū)女性的HPV 感染以52、16、58、53、39 亞型感染為主，且均屬于高危型，結(jié)果與國內(nèi)學(xué)者江雨等[19]報(bào)道類似。

臨床上發(fā)現(xiàn)有很多患者的HPV 感染是復(fù)雜多樣的。本研究結(jié)果顯示，HPV 單一感染是本研究中女性HPV 感染的主要方式，占總感染的75.38%，結(jié)果與國內(nèi)其他學(xué)者[20-24]報(bào)道類似。本研究結(jié)果還顯示，多重感染占總感染的24.62%，二重感染是最主要的多重感染，二重感染占多重感染的69.33%。結(jié)果與國內(nèi)學(xué)者高超等[8]報(bào)道類似。有研究認(rèn)為，HPV 多重感染對人體危害更大，多重感染的患者患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)更高[25]。

宮頸癌的主要原因是HPV 感染，而高危型HPV的持續(xù)感染是宮頸癌的直接病因[26]。然而進(jìn)展成宮頸癌會(huì)經(jīng)歷很長的時(shí)間，所以有效的篩查方法加上恰當(dāng)?shù)母深A(yù)治療完全可以阻斷其發(fā)展成宮頸癌。

本研究用這種流式熒光雜交技術(shù)來檢測女性HPV 感染，不僅快捷準(zhǔn)確，而且可以區(qū)分HPV 感染的亞型，這對本地區(qū)女性宮頸癌和生殖器疣的防治具有非常重要臨床意義。因此，后續(xù)研究應(yīng)該加大HPV 感染與宮頸癌有關(guān)知識(shí)的宣傳力度，進(jìn)一步推進(jìn)婦女開展HPV 感染篩查及宮頸癌篩查。