高聚合度麥麩阿魏酸糖酯組分對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抑制作用研究

趙文紅，馮麗然，陳 暉，楊國龍

河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

谷物中的酚酸可以通過相互結(jié)合或協(xié)同增效起到抗氧化作用[1]。其中，酚酸與碳水化合物的結(jié)合是重要的存在形式[2]，如麩皮中的阿魏酸低聚糖酯(FOs)，它以不同聚合度低聚糖的糖羥基與阿魏酸(FA)羧基酯化的形式存在(圖1)。通過酶水解麥麩可以制備FOs。Smith等[3]用Oxyporus纖維素酶水解小麥麩皮細(xì)胞壁得到了阿魏酰基阿拉伯木糖。Ralet等[4]用黑曲霉中的阿魏酸酯酶降解麥麩中的阿魏酸低聚糖酯，在其消化液中分離出了阿魏?；⒗径呛湍救?。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)Os的水溶性好，熱穩(wěn)定性高，能促進(jìn)雙歧桿菌的增殖[5]，在自由基清除[6]、油脂抗氧化[7]和蛋白質(zhì)非酶糖基化[8]等方面表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化活性。美國在2010年以麥麩提取物的名義批準(zhǔn)將其作為食品添加劑(FDA, GRAS Notice 000343)使用[9]。

(5-O-FA-α-L-Ara)-(1→3)-[O-β-D-Xyl]n圖1 阿魏酸糖酯基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic structure of feruloylated oligosaccharides

α-二羰基化合物是美拉德反應(yīng)中形成風(fēng)味化合物的重要中間物質(zhì)，同時(shí)也是反應(yīng)性極強(qiáng)的糖基化劑[10]，參與美拉德反應(yīng)AGEs的形成[11]，從而對蛋白質(zhì)組和基因組造成損傷[12]。其中，GO、MGO和2, 3-BD作為α-二羰基化合物，對人體危害極大[13]，能夠引起乳糖不耐癥和氧化應(yīng)激等反應(yīng)[14]。此外，身體內(nèi)的AGEs對健康的危害十分廣泛，包括引起動(dòng)脈粥樣化、胰島素抵抗、糖尿病并發(fā)癥、骨質(zhì)疏松、衰老等[15]。已有研究表明，F(xiàn)A能夠通過清除美拉德反應(yīng)過程產(chǎn)生的自由基、抑制美拉德產(chǎn)物的形成或者直接與美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物形成加合物等方式影響美拉德反應(yīng)[16]。因此，研究抗氧化劑對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用具有現(xiàn)實(shí)意義。FOs這種新型的功能性添加劑對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物形成的影響研究鮮見相關(guān)報(bào)道。

作者采用凝膠層析技術(shù)制備得到組分F1，通過模擬美拉德反應(yīng)體系，研究F1對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抑制作用。以期為高活性FOs的篩選與制備提供理論依據(jù)，促進(jìn)FOs在食品特別是高溫焙烤食品等方面的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥麩：鄭州金苑面業(yè)有限公司；谷朊粉：高要市蜜丹兒商貿(mào)有限公司；聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；Sephaden LH-20凝膠：索萊寶生物科技有限公司;甘氨酸、乙二醛：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、磷酸氫二鈉、檸檬酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；2, 3-丁二酮：山東西亞化學(xué)股份有限公司；丙醛酮：上海麥克林生化科技有限公司；鄰苯二胺：天津市大茂化學(xué)試劑有限公司；乙腈和冰乙酸為色譜純試劑，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-6100S紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；XMTD-8222電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-6000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠;1260 InfineityⅡ高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；F-7000熒光分光光度計(jì)：日本日立高新技術(shù)公司；7890氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司;LGJ-10C冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 F1的制備

F1的制備見文獻(xiàn)[17]。收集合并第一個(gè)吸收峰對應(yīng)的洗脫液，濃縮后冷凍干燥即得F1。

1.3.2 F1的紫外光譜分析

采用紫外可見分光光度計(jì)在220～400 nm掃描范圍內(nèi)對色譜凝膠柱分離得到的F1和標(biāo)準(zhǔn)FA樣品進(jìn)行紫外全波長掃描，得到圖譜,進(jìn)行組分的定性鑒別。

1.3.3 F1結(jié)構(gòu)組成的分析

將不同分子質(zhì)量(分別為210、580、850、1 300、1 780 Da)的聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品用1.0 mL四氫呋喃溶解后加入25%乙醇溶液配制成2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在Sephadex LH-20層析柱中用四氫呋喃與25%乙醇(體積比為1∶ 10)的混合溶液作洗脫液，以0.5 mL/min的流速洗脫，測定每種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到聚苯乙烯平均分子質(zhì)量與保留時(shí)間的方程。

將分離得到的F1樣品(6 mL)上樣于同一個(gè)Sephadex LH-20柱中，用25%乙醇溶液以0.5 mL/min的流速洗脫，得到相應(yīng)的洗脫圖譜，讀取相應(yīng)組分的保留時(shí)間。按照上述方程計(jì)算得到該組分的平均分子質(zhì)量。并結(jié)合F1的GC、HPLC和紅外光譜結(jié)構(gòu)表征結(jié)果[18]，解析其組成。

1.3.4α-二羰基化合物的HPLC檢測

對α-二羰基化合物進(jìn)行HPLC分析，需要先進(jìn)行衍生化，生成喹喔啉衍生物[19]。分別配制質(zhì)量濃度均為2、4、10、20、40、100 μg/mL的GO、MGO和2, 3-BD，分別取2.0 mL上述溶液于試管中，加入2.0 mL鄰苯二酚(0.6%)后置于60 ℃水浴鍋中反應(yīng)4 h進(jìn)行衍生化處理，以生成相應(yīng)的喹喔啉、2-甲基喹喔啉和2-(2, 3, 4-三羥基丁基)-喹喔啉。反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)液過0.45 μm有機(jī)濾膜，然后進(jìn)行HPLC檢測分析。

HPLC檢測條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)；流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(0.1% 醋酸溶液)=0.30∶0.70；流速為1.0 mL/min；檢測波長為315 nm；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。之后分別分析3種α-二羰基化合物的質(zhì)量濃度與對應(yīng)峰面積的線性關(guān)系。

1.3.5 F1對α-二羰基化合物的抑制率的測定

參考姚勝文[20]和黃啟瑞[21]的方法及其優(yōu)化后的條件，經(jīng)過適當(dāng)修改，利用葡萄糖和谷朊粉構(gòu)建美拉德反應(yīng)體系。以0.1 mol/L檸檬酸溶液和0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液配制pH 8.0的緩沖溶液。準(zhǔn)確稱取7.0 g葡萄糖于燒杯中，用pH 8.0的磷酸緩沖液溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，配制80 mg/mL的葡萄糖溶液。用pH 8.0的磷酸緩沖液配制50 mg/mL的F1溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL F1溶液于比色管中，加入緩沖液使終體積為1.0 mL，分別向比色管中加入10 mL葡萄糖溶液和0.3 g谷朊粉(忽略谷朊粉對反應(yīng)體系體積的影響)，充分混勻后放入預(yù)先已經(jīng)升溫至120 ℃的烘箱中反應(yīng)60 min，結(jié)束后立刻放入冰水浴中終止反應(yīng)。反應(yīng)液定容至15 mL轉(zhuǎn)移至離心管中，5 000 r/min離心10 min，取上清液2.0 mL于干凈試管中，加入2.0 mL鄰苯二酚，60 ℃水浴4 h進(jìn)行衍生化，反應(yīng)結(jié)束后過0.45 μm有機(jī)濾膜進(jìn)行HPLC檢測(檢測條件同前)，以FA為對照，每組重復(fù)3次。檢測結(jié)果與GO、MGO和2, 3-BD的出峰時(shí)間作對比，積分得到相應(yīng)峰面積，依據(jù)相應(yīng)的α-二羰基化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出相應(yīng)濃度，并按照公式(1)計(jì)算F1對α-二羰基化合物的抑制率。

(1)

式中：C0為反應(yīng)混合物中不含F(xiàn)1時(shí)α-二羰基化合物的質(zhì)量濃度，μg/mL；C1為反應(yīng)混合物中含有F1時(shí)α-二羰基化合物的質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.3.6 F1對AGEs的抑制率的測定

參考康世墨[22]的方法并經(jīng)過適當(dāng)修改，利用葡萄糖和甘氨酸構(gòu)建美拉德反應(yīng)體系。分別稱取4.0 g葡萄糖和3.0 g甘氨酸于燒杯中，用pH 8.0的磷酸緩沖液(0.2 mol/L)溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，配制80 mg/mL的葡萄糖溶液和60 mg/mL的甘氨酸溶液。用pH 8.0的磷酸緩沖液配制50 mg/mL的F1溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL F1溶液于比色管中，加入緩沖液使終體積為1.0 mL，分別向比色管中加入2.5 mL葡萄糖溶液和2.5 mL甘氨酸溶液，充分混勻后放入預(yù)先已經(jīng)升溫至80 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)1.5 h，結(jié)束后立刻放入冰水浴中終止反應(yīng)。蒸餾水定容反應(yīng)液至10 mL，然后用熒光分光光度計(jì)檢測樣液的熒光響應(yīng)值，以FA為對照，每組重復(fù)3次。熒光分析條件為激發(fā)波長370 nm，發(fā)射波長440 nm。根據(jù)不同質(zhì)量濃度F1反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度大小，利用公式(2)計(jì)算F1對AGEs的抑制率。

(2)

式中：AU0為反應(yīng)混合物中不含F(xiàn)1時(shí)的熒光強(qiáng)度，a.u.；AU1為反應(yīng)混合物中含有F1時(shí)的熒光強(qiáng)度，a.u.。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以x±s表示結(jié)果，組間比較采用多因素方差分析，組內(nèi)比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 F1的結(jié)構(gòu)特征分析

F1和FA經(jīng)紫外全波長掃描，見圖2，結(jié)果顯示在325 nm左右出現(xiàn)最大吸收峰，并且峰形出現(xiàn)一定紅移。Jankovska等[23]的研究表明未水解的酯化阿魏酸紫外吸收光譜會(huì)出現(xiàn)一定程度的紅移。結(jié)果表明F1結(jié)構(gòu)中含有結(jié)合型的阿魏酸結(jié)構(gòu)。同時(shí)，課題組此前將F1組分堿水解后經(jīng)HPLC法檢測,顯示其含有阿魏酸組分；紅外光譜分析顯示F1組分在1 735 cm-1附近有吸收峰，表明酯鍵的存在，896 cm-1左右的吸收峰表明β(1-4)吡喃糖苷鍵的存在；GC法檢測F1組分糖體組成為阿拉伯糖和木糖[18]。研究結(jié)果表明：F1組分為阿魏酸通過酯鍵連接在阿拉伯木糖糖體上的糖酯結(jié)構(gòu)。

圖2 Sephadex LH-20凝膠柱洗脫組分F1和FA的紫外全波長掃描圖譜Fig.2 Ultraviolet full-wavelength spectra of eluted fractions F1 and FA with Sephadex LH-20 gel column

2.2 F1的結(jié)構(gòu)組成分析

不同分子質(zhì)量聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品的Sephadex LH-20凝膠柱洗脫圖譜見圖3a，在該試驗(yàn)條件下，聚苯乙烯分子質(zhì)量與保留時(shí)間之間的回歸方程為y=-712.1ln x+4 484.5，其分子質(zhì)量與保留時(shí)間有良好的相關(guān)性，決定系數(shù)達(dá)到0.989 8。分子質(zhì)量-保留時(shí)間擬合曲線見圖3b。F1在此色譜條件下的出峰時(shí)間為(52±2) min，根據(jù)方程計(jì)算可知該樣品的平均分子質(zhì)量為(1 671.17±27.40) Da。據(jù)前期研究：GC法檢測麥麩F1組分糖體組成中阿拉伯糖和木糖的摩爾比為1∶ 9.46；DNS法測定F1組分的平均聚合度為10.9[17]，推測F1可能的結(jié)構(gòu)組成為FA-ara-(xly)9，即含有9個(gè)木糖個(gè)數(shù)的阿魏酸糖酯。經(jīng)計(jì)算該組分的分子質(zhì)量為1 675.49 Da，該結(jié)果與Sephadex LH-20凝膠色譜柱的平均分子質(zhì)量檢測結(jié)果一致。

圖3 聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品的Sephadex LH-20凝膠柱洗脫圖譜及其分子質(zhì)量-保留時(shí)間曲線Fig.3 Gel column elution profile of polystyrene standard and its molecular weight-retention time curve

2.3 F1對模擬體系中間產(chǎn)物α-二羰基化合物生成的影響

2.3.1 3種α-二羰基化合物的HPLC分析與線性分析

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物α-二羰基化合物經(jīng)鄰苯二胺衍生化生成喹喔啉后可利用HPLC法檢測。3種α-二羰基化合物的HPLC圖譜見圖4。由圖4可知，GO、MGO和2, 3-BD的出峰時(shí)間分別為4.277 min、5.068 min、6.247 min(2.082 min左右的峰為鄰苯二酚的特征峰)。

由圖4可進(jìn)一步分析3種α-二羰基化合物的質(zhì)量濃度與對應(yīng)峰面積的線性回歸關(guān)系，結(jié)果見表1。在2～100 μg/mL范圍內(nèi)，此線性回歸方程的R2均在0.999 9以上，最低檢測限為10 ng/mL。結(jié)果表明：3種α-二羰基化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，可進(jìn)行組分F1對模擬體系中的3種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物α-二羰基化合物的影響研究。

2.3.2 F1對3種α-二羰基化合物生成的影響

以FA為對照，研究F1對美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物α-二羰基化合物的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 F1和FA對α-二羰基化合物的抑制作用Fig.5 Inhibitory effects of F1 and FA on α-dicarbonyl compounds GO, MGO, and 2, 3-BD

從圖5的整體走勢看，F(xiàn)1和FA對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物GO、MGO和2, 3-BD這3種α-二羰基化合物的生成均具抑制作用，且其抑制率隨著質(zhì)量濃度的增加呈上升趨勢。

由圖5a可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，F(xiàn)A促進(jìn)GO的生成。隨著質(zhì)量濃度的升高，F(xiàn)1和FA對GO的抑制率升高，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1對GO的抑制率顯著優(yōu)于FA(P<0.05)；當(dāng)質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)，F(xiàn)1和FA對GO的抑制率分別為63.64%和57.18%，其抑制率無顯著性差異(P>0.05)。在美拉德反應(yīng)過程中，糖分子的碳鏈裂解會(huì)形成GO，該過程中會(huì)有羰自由基、羥自由基等的生成，而F1具有優(yōu)良抗氧化能力[24]，因此,能夠清除這些自由基從而抑制GO的形成。

由圖5b可知，當(dāng)質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)，F(xiàn)1和FA對MGO的抑制率分別為46.65%和33.49%，經(jīng)SPPS分析，F(xiàn)1質(zhì)量濃度對抑制MGO的生成具有顯著影響(P<0.05)，同時(shí)FA對MGO的抑制率顯著低于F1(P<0.05)。F1對MGO的抑制效果優(yōu)于FA。

由圖5c可知，隨著質(zhì)量濃度的升高，F(xiàn)1和FA對模擬體系中2, 3-BD的抑制率逐漸升高。當(dāng)質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)，F(xiàn)1和FA對2, 3-BD的抑制率分別為76.74%和64.85%，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1質(zhì)量濃度對抑制2, 3-BD的生成具有顯著影響(P<0.05)，F(xiàn)1和FA對2, 3-BD的抑制率不存在顯著差異(P>0.05)。F1和FA均表現(xiàn)出優(yōu)異的清除2, 3-BD的能力。

2.4 F1對模擬體系中AGEs生成的影響

以FA為對照，研究F1對美拉德反應(yīng)AGEs生成的影響，結(jié)果見表2。

表2 F1和FA對AGEs生成的影響 Table 2 Effects of F1 and FA on the formation of AGEs

由表2可知，F(xiàn)1和FA對模擬體系中生成的AGEs表現(xiàn)出抑制作用，并且其抑制作用隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為50 mg/mL時(shí)，F(xiàn)1和FA對AGEs的抑制率分別為97.50%和94.76%。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到30 mg/mL以上時(shí)，F(xiàn)A的質(zhì)量濃度對抑制AGEs生成沒有顯著影響(P>0.05)。F1和FA能很好地抑制美拉德反應(yīng)過程中的α-二羰基化合物，而作為AGEs的反應(yīng)底物，α-二羰基化合物的減少能有效抑制AGEs的生成，因此,F1和FA均表現(xiàn)出優(yōu)異的抑制AGEs的能力。

3 結(jié)論

本研究采用凝膠層析技術(shù)制備得到高聚合度麥麩FOs組分F1，并對其組成特征進(jìn)行了分析，得到平均分子質(zhì)量為(1 671.17±27.40)Da，結(jié)合聚合度計(jì)算可知其分子組成可能為阿魏酰基阿拉伯木九糖。構(gòu)建食品美拉德模擬體系，研究F1對美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明：F1和FA均能夠很好地抑制GO、MGO和2, 3-BD 3種中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，并且其抑制作用呈濃度依賴關(guān)系。總體來說，F(xiàn)1和FA對3種主要α-二羰基化合物抑制效果順序?yàn)?, 3-BD>GO>MGO。此外，F(xiàn)1和FA均對終產(chǎn)物AGEs表現(xiàn)出很好的抑制作用，由于F1能有效抑制美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物α-二羰基化合物的產(chǎn)生，從而能夠抑制AGEs的生成。