腸外營(yíng)養(yǎng)混合液中維生素C 含量測(cè)定的研究

穆殿平，解曉帥，張鳳瑩，許煜靜，楊金榮*

（1.天津市第一中心醫(yī)院，天津 300192；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津 300070）

維生素C（vitamin C，Vc）參與體內(nèi)多種代謝過(guò)程，可增加肌體抵抗能力，促進(jìn)膠原合成，具有抗病毒及抗癌作用［1，2］。近年來(lái)研究表明，Vc 在對(duì)抗膿毒血癥發(fā)揮一定療效［3］。根據(jù)臨床需要，Vc 常加入腸外營(yíng)養(yǎng)混合液（TNA）中，為不能耐受腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)或消化道受損患者提供腸外營(yíng)養(yǎng)治療［4］。有報(bào)道，腸外營(yíng)養(yǎng)添加大劑量Vc對(duì)急性重癥創(chuàng)傷患者較好的治療效果［5］。然而，由于TNA 處方組分多，不同物質(zhì)混合可能使其物理及化學(xué)性質(zhì)發(fā)生變化，有可能降低TNA 混合液的安全性及穩(wěn)定性［6，7］，尤其是Vc 含有烯二醇結(jié)構(gòu)易被氧化變色，甚至失效［8］。因此，測(cè)定TNA 中Vc 的含量變化是非?？煽康目疾槠溆行缘闹笜?biāo)，文獻(xiàn)中關(guān)于Vc 含量測(cè)定方法報(bào)道較多，但多為單一組分或簡(jiǎn)單配伍條件，且重復(fù)性較差。本研究旨在建立操作簡(jiǎn)便、適用性廣、重現(xiàn)性好、結(jié)果準(zhǔn)確的高效液相色譜法（HPLC），用于測(cè)定TNA混合液中Vc 注射液含量，確保臨床TNA 治療的安全性和有效性。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；十萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器）；Photoelectron TECHNOLOGY 色譜柱恒溫箱；AP-9901S 真空泵（天津蘭博實(shí)驗(yàn)儀器）。

1.2 試劑 維生素C 對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100425-201504；規(guī)格：100 mg/支；純度：100.0%）；維生素C 注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)1809301；規(guī)格：0.5 g/5 ml）；甲醇和乙腈（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純）；其他試劑均為市售分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Zirchrom Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：0.34%（w/v）磷酸二氫鉀-氫氧化四丁基銨-乙腈（92.5∶2.5∶5，v/v/v，pH 3.0）；流速：0.8 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱(chēng)取0.500 g 維生素C 對(duì)照品，用流動(dòng)相溶解并定容至100 ml，得濃度5 mg/ml 的Vc 對(duì)照品儲(chǔ)備液，搖勻，冷藏、避光保存。

2.2.2 TNA 處方設(shè)計(jì) 根據(jù)普通成人及住院患者對(duì)Vc 的日需求量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中TNA 處方。處方中具體各成分配比見(jiàn)表1。處方0（0 組）為陰性對(duì)照組不添加Vc 注射液，其余三組Vc 的含量分別為0.735、1.46 和2.88 mg/ml。四組供試溶液均在局部百級(jí)的水平層流臺(tái)由專(zhuān)業(yè)人員按照《靜脈用藥集中調(diào)配質(zhì)量管理規(guī)范》中相關(guān)操作規(guī)程規(guī)范配制，灌裝在1 L 營(yíng)養(yǎng)袋中，室溫、避光的條件下放置待測(cè)。

2.3 系統(tǒng)適用性及專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液15 ml，置100 ml 量瓶中，加入流動(dòng)相最終配制成含Vc 對(duì)照品0.75 mg/ml 的對(duì)照品溶液。取處方0（陰性對(duì)照組）溶液50 ml，置100 ml 量瓶中，加入對(duì)照品儲(chǔ)備液15 ml，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為樣品對(duì)照溶液；取處方1 溶液50 ml，置100 ml 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為樣品溶液；取處方0 溶液50 ml，置100 ml 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為陰性對(duì)照液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，HPLC 色譜圖見(jiàn)圖1。維生素C 色譜峰保留時(shí)間為5.5 min，與相鄰峰分離度良好。維生素C 色譜峰位置處無(wú)相關(guān)干擾，結(jié)果表明專(zhuān)屬性良好。

圖1 對(duì)照品（A）樣品對(duì)照（B）處方1 供試品（C）陰性對(duì)照（D）HPLC 色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 和12.0 ml 至100 ml 的棕色量瓶中，加入流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，避光。按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以各個(gè)濃度的維生素C 對(duì)照品峰面積（Y）對(duì)相應(yīng)的濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式為：Y=27 105X-10 325（r=0.999 8），維生素C 在50～600 μg/ml 濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取處方1 溶液50 ml，置100 ml 棕色量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，充分混勻，避光，作為供試品溶液。精密量取上述供試品溶液20 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，結(jié)果RSD 為0.96%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取處方1 溶液50 ml，置100 ml棕色量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，充分混勻，避光，作為供試品溶液。同法配制6 份，各取上述供試品溶液20 μl 進(jìn)樣，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算含量RSD 來(lái)考查試驗(yàn)的重復(fù)性，結(jié)果RSD 為1.78%。

2.7 回收率試驗(yàn) 取處方0 溶液，精密量取9 份，每份50 ml，置100 ml 棕色量瓶中，分別精密加入5 mg/ml 的維生素C 對(duì)照品儲(chǔ)備液5.0（低濃度）、7.5（中濃度）和10.0 m（l高濃度）3 個(gè)濃度，流動(dòng)相稀釋至刻度，每個(gè)濃度配制3 份，峰面積取平均值計(jì)算回收率。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果平均回收率為99.23%，RSD 為1.06%。見(jiàn)表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.8 樣品溶液的含量測(cè)定 根據(jù)方法學(xué)中考查的Vc濃度的線性范圍，處方1、處方2 和處方3 分別精密吸取50.0、25.0 和12.5 ml，置100 ml 的量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，充分混勻，避光備用。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果處方1、處方2 和處方3 平均含量分別為0.74、1.46 和2.88 mg/ml，見(jiàn)表3。

表3 不同處方Vc 樣品溶液含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.9 TNA 溶液的穩(wěn)定性 處方1、處方2、處方3 分別在0、4、8、12 和24 h 時(shí)取樣，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別對(duì)處方1、處方2、處方3 溶液進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以每組0 h 時(shí)Vc 濃度對(duì)應(yīng)的峰面積為100%，計(jì)算每組其他時(shí)間點(diǎn)Vc 的相對(duì)百分含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 含不同濃度維生素C的TNA 溶液隨放置時(shí)間的相對(duì)含量

3 討論

3.1 方法學(xué)討論

3.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 用紫外分光光度計(jì)在200 ～800 nm 對(duì)維生素C 進(jìn)行掃描，在波長(zhǎng)210 nm 處有最大吸收，故測(cè)定波長(zhǎng)選擇210 nm。

3.1.2 流動(dòng)相的選擇 本試驗(yàn)中樣品液為多種組分的TNA 混合液，并且多種物質(zhì)均有紫外吸收峰，極性與維生素C 相似，很可能干擾維生素C 的含量測(cè)定。在早期預(yù)試驗(yàn)中，探索正確的流動(dòng)相時(shí)多以參考文獻(xiàn)［9］為主，結(jié)果不是出峰時(shí)間過(guò)早導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確測(cè)定TNA 中維生素C 含量，就是無(wú)法很好分離多組分營(yíng)養(yǎng)液中的維生素C 峰。經(jīng)過(guò)探索，發(fā)現(xiàn)以0.025 mol/L 磷酸二氫鉀與0.010 mol/L 四丁基氫氧化銨加入5%的乙腈作為流動(dòng)相，維生素C 的保留時(shí)間在5 min 左右，并可以將相似極性的多種物質(zhì)與維生素C 的吸收峰分開(kāi)，峰形良好，不拖尾，分離的大于1.5。

3.1.3 流動(dòng)相pH 值的確定 由于維生素C 不穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的還原性，易氧化，故其注射劑均添加一定量的抗氧劑來(lái)確保其穩(wěn)定性。根據(jù)其在酸性介質(zhì)中氧化的速度減慢或生成單鈉鹽而不致發(fā)生水解［10］，確定流動(dòng)相應(yīng)呈偏酸性。當(dāng)流動(dòng)相pH 值調(diào)為2.0 時(shí)，維生素C主峰拖尾嚴(yán)重，而嘗試流動(dòng)相pH 值調(diào)節(jié)至3.5 時(shí)，出現(xiàn)峰形重疊的情況，經(jīng)過(guò)反復(fù)探索，調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 值為3 時(shí)能很好分開(kāi)極性相似的幾個(gè)峰，并確保了維生素C 水溶液的穩(wěn)定。有文獻(xiàn)報(bào)道［11］，當(dāng)pH 值大于5 時(shí)，會(huì)導(dǎo)致維生素C 的降解加速，并隨著pH 值越來(lái)越高，維生素C 降解反應(yīng)越快。因此，流動(dòng)相pH 值確定為3.0。

3.2 樣品液含量測(cè)定 試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表4）顯示，各組TNA中Vc 含量隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。1 組和2組分別在放置4 和8 h 后相對(duì)含量已經(jīng)減少到90%以下，根據(jù)《中國(guó)藥典》2015 版規(guī)定，即為失去療效。3組在放置12 h 時(shí)，含量?jī)H下降了5.9%；提示TNA 中加入濃度越高的Vc 注射液，其含量下降越慢，可能與Vc 注射液中抗氧劑濃度有關(guān)；同時(shí)也為進(jìn)一步研究TNA 中是否可以加入適宜濃度的Vc 注射液奠定了基礎(chǔ)。

3.3 其他影響因素 由于維生素C 具有光敏感性，遇空氣中的氧氣易氧化分解［11］，故本試驗(yàn)全程保持避光條件，將配好的樣品液及試劑密閉保存，避免與外界的空氣長(zhǎng)時(shí)間的接觸。由于樣品液為多種注射劑調(diào)配而得，而各種注射劑都有相應(yīng)規(guī)格的裝量差異，會(huì)導(dǎo)致配制的TNA 實(shí)際體積與理論體積有所差異。因此在本試驗(yàn)中，樣品溶液不同時(shí)間的維生素C 含量均以0 h 時(shí)測(cè)定濃度做比值，計(jì)算相對(duì)含量，從而排除偶然誤差。

4 結(jié)論

本文建立了測(cè)定腸外營(yíng)養(yǎng)混合液中Vc 含量的高效液相色譜法，該方法操作簡(jiǎn)單，快速準(zhǔn)確，且分離度和重復(fù)性均較好，可用于考查T(mén)NA 中Vc 注射液的含量變化。近些年，關(guān)于TNA 中加入Vc 注射液穩(wěn)定性和安全性國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道較少，該方法的建立可以說(shuō)為進(jìn)一步深入研究Vc 注射液加入TNA 中不同濃度，不同配伍的含量變化奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為臨床腸外營(yíng)養(yǎng)應(yīng)用更加安全、有效提供了很好的藥學(xué)研究路徑。