不同年份老香黃定量分析及其化學(xué)模式識別研究

郭舒臣，鄭玉忠，郭 瑞，曾鑫海，梁惠芬，陳奕東，楊應(yīng)楷， 董婷霞,2，王懷友，詹華強,2*

(1.深圳市可食用及藥用資源研究重點實驗室 香港科技大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518057；2.香港科技大學(xué) 生命科學(xué)部暨中藥研發(fā)中心，香港 999077；3.中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，江蘇 南京 211198；4.韓山師范學(xué)院 食品工程與生物科技學(xué)院，廣東 潮州 521041；5.廣東濟(jì)公保健食品有限公司，廣東 潮安 515638)

老香黃(也稱老香櫞、佛手香黃)是嶺南特有的保健和藥用制品，具有增進(jìn)食欲、理氣化痰的功效，可治胃痛、腹脹、嘔吐、嗝噎、痰多咳喘等病癥[1]。它是由蕓香科植物佛手(CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle)的果實炮制而成。佛手是我國傳統(tǒng)的“藥食兩用”中藥之一[2]，但本身味道苦澀辛辣，不宜直接食用，故嶺南地區(qū)的潮汕鄉(xiāng)民以佛手(也稱香櫞)為原料，經(jīng)過鹽腌、曬干、炊熟、浸中藥份液、九蒸九曬，腌制成色黑如漆、口感綿軟的老香黃，同時可以久藏不壞，又可以保存藥效[3]。佛手的主要化學(xué)成分有揮發(fā)油類、黃酮類、香豆素類、多糖、氨基酸和無機鹽等多種生理活性物質(zhì)[4]，在抗氧化、抗炎[5]、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降糖、降脂、改善胰島素抵抗方面發(fā)揮著重要的作用[6]。但是目前老香黃多以作坊制作為主，在腌制過程中，工序較為復(fù)雜，且無標(biāo)準(zhǔn)的制備方法，導(dǎo)致老香黃成品在化學(xué)成分、組成及含量上差異很大，直接影響了老香黃的質(zhì)量。市場上不同貯藏年份的老香黃，具有功能和品質(zhì)上的差異[7]。迄今為止，老香黃缺少有效可靠的質(zhì)量控制及其品質(zhì)鑒定方法，而建立老香黃的質(zhì)量評價體系，找到差異性化學(xué)標(biāo)志物去判別不同年份的老香黃成為難點。

目前針對老香黃的成分分析，僅有運用高效液相色譜(HPLC)對2個指標(biāo)成分進(jìn)行定量分析的報道[8]。隨著液相色譜-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的高速發(fā)展，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)因具有快速、分離度好、靈敏度高的特點，被廣泛應(yīng)用于多種物質(zhì)的同時測定[9-10]。本研究以原料佛手中的化學(xué)成分為基準(zhǔn)，通過文獻(xiàn)篩選了21個具有代表性的化學(xué)質(zhì)量標(biāo)志物[11-12]，采用UPLC-MS/MS方法對老香黃中的化學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行快速定性與定量分析。

為了有效快速篩選中藥化學(xué)標(biāo)志物，常常采用化學(xué)模式識別技術(shù)，該技術(shù)在中藥鑒別、定性表征、質(zhì)量控制、組效關(guān)系等研究中均有廣泛應(yīng)用[13]，包括主成分分析(Principal component analysis,PCA)、聚類分析(Hierarchical cluster analysis,HCA)、正交偏最小二乘法判別分析(Orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)的分析方法[14]。本研究基于老香黃中各化學(xué)標(biāo)志物的含量結(jié)合上述模式識別方法區(qū)別不同年份的老香黃，篩選出差異性化學(xué)標(biāo)志物，并進(jìn)一步采用盲樣適用性能力測試結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

VGT-2227QTD型數(shù)碼超聲波清洗機(廣東固特超聲股份有限公司)；BSA2245型電子天平(萬分之一，德國賽多利斯公司)；Milli-QB型超純水凈化系統(tǒng)(美國Millipore公司)；A-30型超高效液相色譜-Q-sight型三重四極桿質(zhì)譜儀(珀金埃爾默儀器有限公司)；SAB 225i型電子天平(十萬分之一，英國ADAM衡器公司)；GL-16G-II 離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

從廣東濟(jì)公保健食品有限公司收集不同年份(7個年份)的老香黃，包括0年(即老香黃半成品,LXH0_1～6)、3年(儲藏3年的老香黃,LXH3_1～6)、5年(LXH5_1～6)、8年(LXH8_1～6)、10年(LXH10_1～6)、15年(LXH15_1～6)、20年(LXH20_1～6)，每個樣品各6批；同時收集不同廠家、不同年份測定用盲樣(Proficiency test，PT)共9批，編號PT_1～PT_9，所有樣品均保存于香港科技大學(xué)深圳研究院。21種對照品均由四川省維克奇生物科技有限公司提供，其純度均超過98%，具體的對照品信息見表1。

表1 21種對照品的采購信息Table 1 Commercial informations of 21 kinds of reference substances

1.2 溶液的制備

1.2.1 對照品溶液及其內(nèi)標(biāo)溶液的制備分別精密稱定21種候選化學(xué)標(biāo)志物適量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。搖勻，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品單標(biāo)溶液，各取適量溶液，混合成23.80 μg/mL的混合對照品儲備液。另取10 mg山柰酚-3-O-蕓香糖苷置于容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成1 mg/mL的儲備液，最終稀釋成5 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將對照品混標(biāo)溶液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.05、0.09、0.18、0.37、0.74、1.47、2.95、5.95、11.90、23.80 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 老香黃供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱取不同年份各6批老香黃樣品1.00 g，剪碎，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密吸取20 mL超純水，稱定重量，浸泡24 h過夜，80 ℃超聲 2 h(500 W，40 kHz)，放冷，用超純水補足減失的重量，過濾并收集續(xù)濾液；所剩殘渣按同樣方法再提取1次，合并濾液，12 000 r/min高速離心，4 ℃保存，待分析。

1.3 樣品的分析條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～2 min，95%～85% A；2～6 min，85% A；6～10 min，85%～47% A；10～12 min，47%～5% A；12～14 min，5%～95% A；14～17 min，95% A；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源檢測模式：ESI+-多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；毛細(xì)管電壓(Electrospray voltage)：5 500 V；干燥氣流速：100 L/min；質(zhì)譜接口溫度(HSID temp)：280 ℃；霧化氣流速：120 L/min；離子源溫度(Source temp)：450 ℃；待測成分的MRM質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)標(biāo)志物的選擇

參考佛手中化學(xué)成分研究的相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]，篩選出報道較多或含量較高的21個化合物作為候選化學(xué)標(biāo)志物，其中包括異莨菪亭、東莨菪內(nèi)酯、6,7-二甲氧基香豆素、5,7-二甲氧基香豆素、水合氧化前胡素、檸檬苦素、諾米林、佛手柑內(nèi)酯、香葉木素、金圣草素、圣草次苷、7-甲氧基香豆素、野漆樹苷、蘆丁、橙皮苷、新橙皮苷、甲基橙皮苷、香葉木苷、黃柏酮、7-羥基香豆素、山柰酚。

表2 待測化學(xué)標(biāo)志物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 MS parameters of chemical markers for test

圖1 各化學(xué)標(biāo)志物的MRM疊加色譜圖Fig.1 MRM overlay chromatograms of chemical markers the peak numbers denoted were the same as those inTable 1; A：blank methanol；B：mix standard(23.80 μg/mL)； C：Lao-Xiang-Huang(LXH0_1)

2.2 方法學(xué)

2.2.1 成分檢定及其專屬性精密吸取 “1.2.1”混合對照品溶液(23.80 μg/mL)、供試品溶液(LXH0_1)100 μL，加入100 μL內(nèi)標(biāo)，混勻，另取空白甲醇200 μL，按“1.3”條件進(jìn)行分析，各化學(xué)標(biāo)志物的MRM色譜圖見圖1?；旌系?1個化合物峰及其內(nèi)標(biāo)峰均得到很好的分離，且無雜峰干擾、峰形良好、基線平穩(wěn)。在供試品溶液中除內(nèi)標(biāo)外，共檢出15個化學(xué)標(biāo)志物，并作為有關(guān)樣品質(zhì)量的方法學(xué)考察指標(biāo)。

2.2.2 線性關(guān)系、定量下限及檢出限精密吸取“1.2.2”制備的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，加入100 μL內(nèi)標(biāo)，混勻，按“1.3”條件進(jìn)行分析，以對照品系列工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，對照品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(y)，得到21個化學(xué)標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表3)。結(jié)果表明，該方法在0.09～23.80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.990。以信噪比(S/N)約為10計算各成分的定量下限(LOQ)，以S/N≈3計算各成分的檢出限(LOD)，測得21種化學(xué)標(biāo)志物的定量下限為0.05～0.09 ng，檢出限為0.02～0.05 ng(見表3)。

2.2.3 精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性實驗精密吸取“1.2.1”混合對照品溶液(23.80 μg/mL)，加入內(nèi)標(biāo)100 μL，按照“1.3”條件進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定各對照品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，計算得21種待測化學(xué)標(biāo)志物的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.56%～2.1%(見表4)，說明儀器的精密度良好。精密稱取老香黃0年(LXH0_1)樣品6份，每份1.00 g，分別按照“1.2.3”制備供試液，加入100 μL內(nèi)標(biāo)，混勻，進(jìn)樣測定，計算得到15種化學(xué)標(biāo)志物含量的RSD為0.31%～2.4%(見表4)，表明該方法的重復(fù)性良好。取同一老香黃供試品溶液(LXH0_1)，加入100 μL內(nèi)標(biāo)，混勻，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，測定15種目標(biāo)峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值RSD為1.1%～2.1%(見表4)，表明供試品溶液在24 h中具有良好的穩(wěn)定性。

表3 21種化學(xué)標(biāo)志物的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 3 Linear relations，LODs and LOQs of 21 chemical markers for test

2.2.4 加標(biāo)回收率實驗精密稱取已知含量的老香黃0年(LXH0_1)樣品0.50 g各6份，分別加入近似等量的樣品中可測到的15種對照品，按“1.2.3”制備加標(biāo)回收供試品溶液，加入100 μL內(nèi)標(biāo)，混勻，按照“1.3”條件進(jìn)行測定，計算回收率及RSD(表4)。15種化學(xué)標(biāo)志物的回收率為92.3%～104%，RSD為0.49%～2.5%。結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，可以滿足日常樣品的分析要求。

表4 方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率Table 4 Precision，repeatability，stability and recovery for the method

2.3 不同年份老香黃樣品含量測定

取“1.2.3”供試品溶液100 μL，加入內(nèi)標(biāo)100 μL混勻，按照“1.3”條件進(jìn)行分析，以相應(yīng)的線性關(guān)系分析不同年份老香黃樣品的15種化學(xué)標(biāo)志物含量(見表5)。結(jié)果表明最初加工好的老香黃(LXH0)各標(biāo)志物含量較高，其中5,7-二甲氧基香豆素、檸檬苦素、諾米林、7-羥基香豆素含量較高，分別為(47.465±1.987)μg/g、(168.562±17.851)μg/g、(216.731±26.217)μg/g和(243.242±31.430)μg/g。實驗證實，這些化學(xué)標(biāo)志物含量較高，但隨著老黃香腌制時間的增加，復(fù)雜的炮制過程造成了化學(xué)標(biāo)志物的流失，含量不同程度降低，可能是各化學(xué)標(biāo)志物在炮制過程中轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌壌x產(chǎn)物，也可能是經(jīng)過多道工藝的炮制，特別是鹽浸和蒸煮等步驟后導(dǎo)致各標(biāo)志物嚴(yán)重流失[8]。此外，對于未檢出的圣草次苷、野漆樹苷、蘆丁、橙皮苷、新橙皮苷、甲基橙皮苷6種物質(zhì)在佛手原料中均有報道，但對比同年期的老香黃成品中未有發(fā)現(xiàn)，可能是加工過程中流失至含量低于檢出限。

此外，5,7-二甲氧基香豆素是佛手中的主要成分，其含量在佛手果實不同成熟階段變化很大，因此在樣品個體中含量也有較大的差異。表5和表6中，5,7-二甲氧基香豆素的不規(guī)律變化應(yīng)與樣品代表性有關(guān)。但整體而言，隨著儲藏時間的增加，與其他成分一致，5,7-二甲氧基香豆素含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。

表5 不同年份老黃香中15種化學(xué)標(biāo)志物的含量(μg/g,n=6)Table 5 Contents of 15 chemical markers in Lao-Xiang-Huang under different preserved years(μg/g,n=6)

2.4 基于化學(xué)標(biāo)志物的PCA降維分析

主成分分析(PCA)是一種降維思維或?qū)⒍鄠€指標(biāo)轉(zhuǎn)化為n個指標(biāo)的數(shù)據(jù)處理方法，克服了單一指標(biāo)的局限性，可篩選出不同組間的顯著差異性化學(xué)標(biāo)志物[15]。本研究采用SIMCA14.1軟件對不同年份的老香黃中15種化學(xué)標(biāo)志物的含量(C1～C15，編號見表5)進(jìn)行PCA分析和無監(jiān)督模式下的聚類分析(HCA)，HCA分析采用最短最長平均距離(Single linkage)，結(jié)果表明前兩個主成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)79.1%，且特征值均大于1，滿足主成分的選取要求，可以揭示樣品中的大多數(shù)差異信息。進(jìn)一步根據(jù)前兩個主成分進(jìn)行PCA得分圖、化合物載荷圖以及層次聚類分析圖的制作(見圖2)。PCA結(jié)果表明，老香黃0年和20年有明顯的區(qū)分，其他5個年份并未得到很好的區(qū)分(圖2A)；載荷圖顯示各成分未獲得良好的得分(值大于0.30，表示載荷顯著[15])(圖2B)。無監(jiān)督模式下的HCA分析同樣顯示，除了老香黃0年和20年有很好的聚類，其他年份樣品無法很好的聚類在一起(圖2C)。為了進(jìn)一步研究模式識別技術(shù)能否將不同年份的老香黃完全區(qū)分，后續(xù)實驗進(jìn)一步采用OPLS-DA法進(jìn)行分析。

2.5 基于OPLS-DA分析的差異性化學(xué)標(biāo)志物篩選

正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)結(jié)合了正交信號校正(OSC)和PLS-DA方法，能夠?qū)矩陣信息分解成與Y相關(guān)和不相關(guān)的兩類信息，通過去除與分類信息無關(guān)的噪音，提高模型的有效性來篩選差異變量[16]。本研究將7個不同年份的老香黃分為7組，分組同“1.1”一致。通過OPLS-DA分析結(jié)果可知，各組均有良好的區(qū)分(圖3A)，且R2X(cum)=0.943，R2Y(cum)=1，Q2(cum)= 0.855，表明模型的解釋度和預(yù)測度好。

圖2 不同年份老香黃的PCA分析結(jié)果Fig.2 PCA analysis results of Lao-Xiang-Huang under different preserved years A：PCA plot；B：loading plot；C：HCA dendrogram

圖3 不同年份老香黃的OPLS-DA分析結(jié)果Fig.3 OPLS-DA analysis results of Lao-Xiang-Huang under different preserved years A：OPLS-DA plot;B：VIP value of detected chemical markers；C：dendrogram of HCA clustering

通過提取OPLS-DA模型中15個變量的重要值(Variable importance in projection,VIP)(圖3B)，對15個化學(xué)標(biāo)志物含量VIP值大小進(jìn)行排序，篩選出VIP值大于1的差異化學(xué)標(biāo)志物。結(jié)果顯示，化學(xué)標(biāo)志物C4(5,7-二甲氧基香豆素)、C12(香葉木苷)、C15(山柰酚)、C13(黃柏酮)、C10(金圣草素)、C6(檸檬苦素)的VIP值均大于1，說明以上6種化學(xué)成分對7個貯藏年份的老香黃的分類有顯著影響，這些成分是引起變化的主要差異性化學(xué)標(biāo)志物。而其他化學(xué)成分的VIP值均小于1，表明對不同年份的老香黃的差異性影響不大。

在OPLS-DA有監(jiān)督的判別模式條件下，對不同年份的老香黃樣品進(jìn)行HCA聚類分析，參數(shù)為最短最長平均距離(Single linkage)。結(jié)果顯示，不同年份的樣品聚類位置不同，且大多數(shù)同一年份樣品聚為一類，可區(qū)分不同年份的老香黃(圖3C)。雖然老香黃8年樣品有部分差異，但不影響整體的年份聚類，表明在此模式下，不同貯藏年份的老香黃在品質(zhì)上存在一定差異。

綜合分析表5含量結(jié)果和篩選的差異標(biāo)志物，貢獻(xiàn)最大的差異化學(xué)標(biāo)志物5,7-二甲氧基香豆素，0年含量為(47.465±1.987)μg/g，3年含量為(17.069±0.542)μg/g，5年含量為(11.073±1.862)μg/g，8年含量為(41.905±2.240)μg/g，10年含量為(21.079±2.270)μg/g，15年含量為(43.267±2.432)μg/g，20年含量為(51.711±1.439)μg/g。該標(biāo)志物的含量在一定程度上可以體現(xiàn)不同年份的老香黃，進(jìn)而通過盲樣的適用性測試結(jié)果進(jìn)行驗證。

2.6 盲樣的適用性測試結(jié)果驗證

在市場上，收集不同廠家不同年份9批樣品進(jìn)行盲樣的適用性能力檢測(Proficiency test,PT)，樣品按“1.2.3”進(jìn)行供試品溶液的制備，取100 μL，加入內(nèi)標(biāo)100 μL混勻，按照“1.3”條件進(jìn)行分析，按照相應(yīng)的線性關(guān)系分析樣品中6種差異性化學(xué)標(biāo)志物的含量，結(jié)果見表6。通過比對表6和表5中5,7-二甲氧基香豆素含量，判斷盲樣中各批次的年份，驗證所建方法的可靠性。檢測表明PT_1～PT_3檢測數(shù)值落在老香黃3年(LXH3)，PT_4～PT_6落在老香黃5年(LXH5)，PT_7～PT_9落在老香黃8年(LXH8)，分析結(jié)果與廠家報告基本一致。進(jìn)一步分析，盲樣中各年份的其他5種成分(香葉木苷、山柰酚、黃柏酮、金圣草素、檸檬苦素)含量在表5各年份老香黃測定的范圍之內(nèi)，表明所建立的方法可靠，有較高的應(yīng)用價值。

表6 市場上老香黃盲樣適用性測試結(jié)果(μg/g,n=3)Table 6 Proficiency test in commercially available of Lao-Xiang-Huang samples(μg/g,n=3)

3 結(jié) 論

本研究提供了21種與老香黃相關(guān)的化學(xué)標(biāo)志物及其內(nèi)標(biāo)山柰酚-3-O-蕓香糖苷的UPLC-MS/MS檢測方法。在該條件下，各化學(xué)標(biāo)志物的提取峰與內(nèi)標(biāo)峰無雜峰干擾，峰形良好，基線平穩(wěn)，且該方法的線性良好，靈敏度高，專屬性強，方法學(xué)考察結(jié)果符合日常分析要求。研究發(fā)現(xiàn)：在佛手原料中均有報道的圣草次苷、野漆樹苷、蘆丁、橙皮苷、新橙皮苷、甲基橙皮苷6種成分未在不同年份的老香黃中檢出，可能是在加工過程中流失至低于檢出限。進(jìn)一步結(jié)合PCA、HCA、OPLS-DA化學(xué)模式識別技術(shù)，可以有效判別不同年份的老香黃，找出區(qū)分老香黃年份的6種差異化學(xué)標(biāo)志物，其中貢獻(xiàn)最大的差異化學(xué)標(biāo)志物為5,7-二甲氧基香豆素，通過該標(biāo)志物的含量在一定程度上可以判斷老香黃的年份。為了驗證方法的普適性，經(jīng)過市場上老香黃盲樣適用性測試分析表明，5,7-二甲氧基香豆素含量的檢測值對應(yīng)的老香黃年份與廠家報告基本一致。該研究一方面可通過對多種差異性成分的分析有效地控制老香黃的質(zhì)量，另一方面可以通過指標(biāo)性成分含量判斷老香黃的大概年份。