一測多評法在舒肝益脾顆粒中的應(yīng)用

顏瑞琪，栗建明，顧利紅，侯惠嬋，袁震霆

(廣州市藥品檢驗所 國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，廣東 廣州 510160)

舒肝益脾顆粒由五味子、茵陳、蒲公英、茯苓、山楂和黃芪組成，臨床上主要用于治療濕熱阻滯而致的急、慢性肝炎、遷延性肝炎、膽囊類等病癥。其中五味子為方中君藥，具有補益肝腎、益氣收精、滋腎固本的作用。五味子醇甲、五味子甲素(簡稱甲素)、五味子乙素(簡稱乙素)是五味子的主要有效成分，對化學(xué)毒物產(chǎn)生的肝臟損傷具有保護作用，對病毒早期的復(fù)制具有抑制作用，且對心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)均有一定的調(diào)節(jié)功能[1]，是治療肝膽類疾病較理想的藥物。舒肝益脾顆粒為肝膽類疾病的臨床常用藥，但該品種標(biāo)準(zhǔn)繁多，且僅以五味子中單獨某一成分為質(zhì)量控制指標(biāo)。在實際臨床用藥中，單一成分的含量并不能真實反映成品的質(zhì)量，也不利于企業(yè)對成品的質(zhì)量控制。

長期以來，我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥立足于整體理論，相較于單體藥物具有顯著優(yōu)勢[2-4]。中藥及其復(fù)方的多成分、多作用靶點等特點，決定了任何一味中藥或成方制劑的整體質(zhì)量不能以單一某種成分進行評價。多指標(biāo)綜合質(zhì)量控制模式將成為中藥質(zhì)量評價的發(fā)展趨勢[5-8]。一測多評法(QAMS)自提出以來，受到眾多藥學(xué)工作者的認可，并在現(xiàn)行版《中國藥典》及較多中藥質(zhì)量評價中得到廣泛運用[9-19]。如2015年版《中國藥典》將該方法的應(yīng)用擴展至提取物等制劑的多指標(biāo)質(zhì)量控制，新增銀杏葉片、銀杏葉提取物、銀杏葉膠囊及銀杏葉滴丸、咳特靈片、咳特靈膠囊、黃連藥材、丹參藥材、生姜藥材中典型成分的含量測定[20]。2020年版《中國藥典》進一步擴大了一測多評法的應(yīng)用范圍，如新增穿心蓮藥材、淫羊藿藥材、蟾酥藥材等[21]。本文采用一測多評法，利用五味子醇甲與甲素、乙素含量之間的函數(shù)和比例關(guān)系，通過只測定一個成分實現(xiàn)多個成分的同步測定，可用于舒肝益脾顆粒五味子藥味中主要化學(xué)成分的定量分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀(島津公司)，配自動進樣器(SIL-20AC)、柱溫箱(CTO-20A)、檢測器(SPD-M20A)；LabSolutions在線工作站；METTLER XP26電子天平、XS204電子天平(梅特勒公司)；Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

對照品：五味子醇甲(110857-201815，含量99.7%)、五味子甲素(110764-201714，含量99.3%)、五味子乙素(110765-201512，含量99.0%)，均購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純(德國Merck公司)，其他試劑為分析純；實驗用水為超純水(美國 Millipore 公司)；樣品分別來自M1、M2、M3等3個廠家，共12批；缺五味子的舒肝益脾顆粒陰性對照樣品由廣州萊泰制藥有限公司提供。

1.3 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)；梯度洗脫程序：0～15 min，56%A；15～25 min，56%～75%A；25～44 min，75%A。柱溫：30 ℃；檢測波長：217 nm；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL。

1.4 對照品溶液的制備

取五味子醇甲、甲素、乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含50 μg/mL五味子醇甲、10 μg/mL甲素、15 μg/mL乙素的混合溶液，即得。

1.5 供試品溶液的制備

取裝量差異項下的供試品，研細，取本品約5.0 g或1.0 g(無蔗糖)，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL甲醇，稱定重量，超聲處理(功率380 W，頻率37 kHz) 30 min，取出放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻,過濾。精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸至近干，殘渣加甲醇溶解，并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻即得。

1.6 陰性對照溶液的制備

取五味子陰性對照品適量，采用供試品溶液的制備方法制備五味子陰性對照溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

參考《中國藥典》2015年版一部“五味子”的檢測波長250 nm[20]，本研究采用二極管陣列(PDA)檢測器，分別提取五味子醇甲、甲素、乙素色譜峰在190～400 nm波長范圍的紫外光譜掃描圖，結(jié)果顯示上述3種對照品在217 nm、250 nm波長附近均有最大吸收?？紤]到甲素、乙素在250 nm處的響應(yīng)值較弱，217 nm波長能同時兼顧3種成分，故最終選擇檢測波長為217 nm。

圖1 混合對照品(A)、樣品(B)與陰性對照品(C)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A),sample(B) and negative control(C) 1.schisandrol(五味子醇甲),2.deoxyschisandrin(五味子甲素), 3.schisandrin B(五味子乙素)

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性實驗分別精密吸取“1.4～1.6”配制的溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品色譜圖中出現(xiàn)五味子醇甲、甲素、乙素的色譜峰，且陰性對照品的色譜圖中相應(yīng)位置無干擾(見圖1)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線取五味子醇甲、甲素、乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成五味子醇甲、甲素、乙素質(zhì)量濃度分別為0.250 6、0.125 2、0.168 9 mg/mL的混合對照品溶液，再稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列溶液，按“1.3”色譜條件進行測定。以各成分的峰面積積分值為縱坐標(biāo)(y)，對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程。結(jié)果表明：五味子醇甲、甲素、乙素在各自線性范圍內(nèi)均呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均為0.999 9。以3倍信噪比(S/N=3)對應(yīng)的質(zhì)量濃度計算檢出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N=10)對應(yīng)的質(zhì)量濃度計算定量下限(LOQ)，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示,五味子醇甲、甲素、乙素的LOD為3.12～5.08 pg，LOQ為7.80～12.7 pg，能滿足檢測要求。

表1 3種成分的線性關(guān)系、檢出限與定量下限Table 1 Linear relationships,LODs and LOQs of three components

2.2.3 精密度實驗取同一混合對照品溶液(五味子醇甲、甲素和乙素的質(zhì)量濃度分別為49.790、9.985、14.964 μg/mL)連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均為0.10%，說明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性實驗取本品1 g(無蔗糖樣品：S7)或5 g(含蔗糖樣品：S12)，按“1.5”方法平行制備供試品溶液各6份，在“1.3”色譜條件下進樣測定。結(jié)果顯示：無蔗糖型樣品中五味子醇甲、甲素、乙素的含量分別為0.564 3、0.090 67、0.141 3 mg/g，RSD分別為1.4%、1.4%、1.5%；含蔗糖型樣品中五味子醇甲、甲素、乙素的含量分別為0.127 9、0.061 57、0.087 75 mg/g，RSD分別為0.70%、1.5%、1.5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性實驗取供試品1 g(無蔗糖)和5 g(含蔗糖)，分別按“1.5”方法制備供試品溶液，按“1.3”色譜條件分別在0、4、8、16、24、30、36 h進樣測定。各成分測得值的RSD均小于1.0%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 加標(biāo)回收率實驗取已知含量的供試品約0.5 g(無蔗糖)和2.5 g (含蔗糖)各6份，精密稱定，分別精密加入混合對照品溶液50 mL，按“1.5”方法制備供試品溶液,采用本方法測定，計算五味子醇甲、甲素、乙素的回收率及RSD。結(jié)果表明，含蔗糖型顆粒中五味子醇甲、甲素和乙素的平均回收率分別為98.1%、101%、101%，RSD分別為0.40%、0.70%、0.50%；無蔗糖型顆粒的平均回收率分別為99.7%、99.9%、101%，RSD分別為0.80%、1.1%、0.90%?；厥章始癛SD符合方法學(xué)考察的相關(guān)要求。

表2 以五味子醇甲為參照的 fs/k(多點校正法)Table 2 fs/k with schisandrol as reference(multi-point correction method)

表3 不同儀器和色譜柱測得待測成分與五味子 醇甲的fs/k(n=6)Table 3 fs/k of three reference substances on different instruments and chromatographic columns(n=6)

2.3 相對校正因子的計算

2.3.1 多點校正法文獻[22-24]采用以多個質(zhì)量濃度點計算所得的相對校正因子(fs/k)取平均值作為定量用fs/k。計算公式：fs/k=(WkAs)/(WsAk)[25]。式中As和Ak分別為內(nèi)參物和目標(biāo)組分k的峰面積，Ws和Wk分別為內(nèi)參物和目標(biāo)組分k的質(zhì)量濃度。取“2.2.3”的混合對照品溶液，分別進樣2、5、7、10、15、20 μL，測定五味子醇甲、甲素、乙素的峰面積。以五味子醇甲為內(nèi)參物(s)，分別計算五味子醇甲與甲素(fs/ds)、五味子醇甲與乙素(fs/sb)之間的校正因子，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，在不同進樣體積時，五味子醇甲與甲素、乙素的相對校正因子基本一致，分別為0.94和0.95。

2.3.2 斜率校正法通過標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=aX+b可知，誤差通常由截距(b)引起，當(dāng)X=(Y-b)/a=Y/a-b/a，b與a比值小于0.01時，b/a值可以忽略。因此，公式進而簡化為X=Y/a。故fs/k可通過二者的斜率a值之比直接計算(fs/k=as/ak)。繼而通過公式Wk=fs/k×Ak/as，其中as為參照物的斜率，ak為其他對照組分的斜率，由參照物的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得as，并計算五味子醇甲與甲素、乙素的fs/k分別為0.93、0.95。

2.4 fs/k的系統(tǒng)耐受性與重復(fù)性

取“2.2.3”的混合對照品溶液，分別于2臺不同品牌的HPLC儀及3種不同品牌的C18色譜柱上按“1.3”色譜條件各進樣6次，每次10 μL。分別測定各成分的峰面積，按“2.3.1”的公式分別計算五味子醇甲與甲素、乙素的fs/k及RSD，結(jié)果見表3。同時分別考察了流速、柱溫對相對校正因子的影響，在柱溫為25、40 ℃時，fs/ds、fs/sb分別為0.95、0.96和0.94、0.95；流速為0.8、1.2 mL/min時，fs/ds、fs/sb分別為0.95、0.95和0.94、0.95。結(jié)果顯示，不同品牌的HPLC儀及色譜柱所得的fs/k基本相同，說明fs/k的系統(tǒng)耐受性較好。

2.5 待測成分色譜峰的定位

相同成分在不同的HPLC儀或色譜柱中的保留時間會存在較大差異。以“2.4”條件得到的相對保留時間(tR)和保留時間差(Δt)考察不同儀器和色譜柱的重現(xiàn)性，用于對目標(biāo)成分進行定位(見表4)。結(jié)果顯示，各待測成分相對保留時間的RSD均小于5.0%，且tR的RSD均小于Δt，表明相對保留時間更適用于待測成分色譜峰的定位。

表4 不同儀器和不同色譜柱下各目標(biāo)成分的相對保留時間與保留時間差(n=6)Table 4 Relative retention times and differences in retention time of components under test on different instruments and chromatographic columns(n=6)

2.6 舒肝益脾顆粒中QAMS與ESM結(jié)果比較

取編號為S1～S12的供試品按“1.5”方法制備供試品溶液，按“1.3”色譜條件進樣分析。采用外標(biāo)法(ESM)計算五味子醇甲、甲素、乙素含量，再用建立的QAMS法以多點校正和斜率校正分別計算甲素、乙素含量，并對兩種方法所得結(jié)果進行比較。結(jié)果顯示，外標(biāo)法、多點校正法、斜率校正法測得各成分的含量無顯著差異(P<0.05)，證明QAMS法能夠用于舒肝益脾顆粒的質(zhì)量控制研究。

3 結(jié) 論

本文建立了以五味子醇甲為內(nèi)參物，同時測定舒肝益脾顆粒中五味子醇甲、甲素、乙素含量的HPLC方法。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好。一測多評法可減少對照品用量，降低實驗成本，提高檢驗效率，是中藥質(zhì)量控制和評價模式新的發(fā)展趨勢，是未來中藥多成分質(zhì)量評價模式的發(fā)展方向。該方法可用于舒肝益脾顆粒五味子藥味中主要化學(xué)成分的定量分析，為提高及統(tǒng)一企業(yè)舒肝益脾顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)和解決方案。