環(huán)狀RNA在急性髓系白血病中的研究進展

徐秉岐，孔德勝，邊思成，李英花

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，哈爾濱 150001； 2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院血液內(nèi)科，哈爾濱 150001)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一，與其他類型的白血病相比，成人AML患者的死亡率居第一位[1]。近年來，針對AML的分子靶向治療、免疫治療及造血干細(xì)胞移植等均取得了長足進步，但由于復(fù)發(fā)以及耐藥的產(chǎn)生，每年仍有許多患者死于疾病進展[1-2]。因此，深入研究AML發(fā)生及發(fā)展的分子機制，對尋找新的臨床標(biāo)志物及治療靶點具有重要意義。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)被發(fā)現(xiàn)廣泛分布于真核生物體內(nèi)并執(zhí)行復(fù)雜的生物學(xué)功能[3]。與信使RNA(messenger RNA，mRNA)相比，circRNA更穩(wěn)定，能在一定程度上耐受RNA酶的降解作用，并具有高度的空間、時序和組織特異性[4]。與其他非編碼RNA類似，circRNA在腫瘤的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用：Chen等[5]基于芯片及二代測序技術(shù)，證實circCSNK1G3在前列腺癌細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用；Feng等[6]對多發(fā)性骨髓瘤小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0000190可在骨髓瘤細(xì)胞胞質(zhì)中通過競爭性內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，CeRNA)機制結(jié)合微RNA(microRNA，miRNA/miR)-767-5p，進而靶向上調(diào)促分裂原活化的蛋白激酶4的表達(dá)，從而抑制疾病進展；Ping等[7]發(fā)現(xiàn)，circ_0009910在AML患者骨髓標(biāo)本中表達(dá)顯著上調(diào)，并提示不良的預(yù)后。現(xiàn)就circRNA的性質(zhì)、生物學(xué)功能及其在AML中的作用予以綜述，以期為AML的臨床診治提供新思路。

1 circRNA概述

1.1性質(zhì) circRNA以其閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)為特征，因不具有5′端的帽子結(jié)構(gòu)和3′端的多聚腺苷酸尾結(jié)構(gòu)，故不易被RNA酶識別及降解，從而在生物體內(nèi)更穩(wěn)定地存在并發(fā)揮作用，顯示出極強的穩(wěn)定性[8]。circRNA亦數(shù)量豐富，目前擁有人類全基因組注釋信息的circRNA超過14萬種，而mRNA僅有3萬余種[9]。在某些細(xì)胞(如人類成纖維細(xì)胞)中，circRNA對應(yīng)的基因占比達(dá)到14%左右[10]。circRNA富集于生物體內(nèi)的同時，也表現(xiàn)出一定的保守性，Werfel等[11]在3個不同的物種中共發(fā)現(xiàn)了9 000余種circRNA，其中1 288 種circRNA在3種物種中均有發(fā)現(xiàn)，提示某些circRNA具有一定的進化保守性。此外，隨著高分辨率熒光原位雜交、熒光素酶報告基因檢測等實驗技術(shù)的不斷優(yōu)化，circRNA被檢測出具有高度組織和發(fā)育時序特異性。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是樹突中含量更高，且在老年人的腦組織中更易聚集[12-13]。Ruan等[14]檢測了1 000種人癌細(xì)胞系中circRNA的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，circRNA在不同的癌細(xì)胞中高度特異表達(dá)?？梢姡琧ircRNA兼具穩(wěn)定性、豐富性、保守性和特異性，這些特殊的性質(zhì)與其生物學(xué)功能具有密切聯(lián)系，有待學(xué)者們進一步探索。

1.2生物學(xué)功能 目前，關(guān)于circRNA生物學(xué)功能的研究主要集中于circRNA對基因表達(dá)的調(diào)控作用。最初的研究認(rèn)為，circRNA有兩種調(diào)控基因表達(dá)的機制[3]，其中一種為circRNA通過CeRNA機制調(diào)控靶基因的表達(dá)。CeRNA機制是指富含miRNA應(yīng)答元件的RNA，可競爭性地結(jié)合并抑制特定的miRNA，解除miRNA對靶基因的抑制作用，富含miRNA應(yīng)答元件的circRNA可經(jīng)過circRNA-miRNA-mRNA途徑調(diào)控靶基因的表達(dá)[3]。Yang等[15]發(fā)現(xiàn)，circHECW2可通過CeRNA機制競爭性結(jié)合miR-30d，上調(diào)血管緊張素原5的表達(dá)，進而促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，破壞血腦屏障的完整性，提示其在腫瘤細(xì)胞的腦轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。另一種機制認(rèn)為，circRNA通過順式調(diào)控作用影響基因轉(zhuǎn)錄，如環(huán)狀內(nèi)含子RNA可在細(xì)胞核中促進RNA聚合酶Ⅱ?qū)﹀^蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域52親本基因的轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)控其表達(dá)[16]。circRNA不僅能調(diào)控基因的表達(dá)，早在1986年，就出現(xiàn)了關(guān)于circRNA可以表達(dá)多肽的文獻(xiàn)報道[17]。Yang等[18]發(fā)現(xiàn)circFBXW7可以編碼一種新的蛋白質(zhì)FBXW7-185aa，此蛋白可以協(xié)同野生型FBXW7蛋白抑制惡性膠質(zhì)瘤的進展。這些研究不僅了顛覆circRNA、miRNA等非編碼RNA不能編碼蛋白的傳統(tǒng)認(rèn)知，也提示circRNA在生物體內(nèi)執(zhí)行著重要的生物學(xué)功能。近年來，外泌體成為circRNA功能研究領(lǐng)域的熱點。circRNA在外泌體中高度富集，外泌體直徑為40～160 nm，是細(xì)胞外囊泡的一部分，可作為細(xì)胞間信息交流的重要途徑[19-20]。外泌體數(shù)據(jù)庫exoRBase收錄了包括健康志愿者、冠心病和結(jié)腸癌患者等92份血清外泌體的測序樣本，其中包含58 330種circRNA、18 333種mRNA[21]。Zhang等[22]證實，circNRIP1由外泌體分泌后，可以被胃癌細(xì)胞吸收并促進癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。所以，外泌體被認(rèn)為可以充當(dāng)circRNA在生物體內(nèi)的搬運工，并放大其生物學(xué)功能。以上研究表明，circRNA在調(diào)控基因表達(dá)、編碼多肽和腫瘤發(fā)生及發(fā)展的過程中起至關(guān)重要的作用。

2 circRNA與急性髓系白血病

研究學(xué)者通過高通量測序和芯片技術(shù)，已經(jīng)在各種組織和細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了成千上萬的circRNA，且經(jīng)相關(guān)體內(nèi)外實驗證實，circRNA在各種良惡性疾病中均發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[5-6,21]。但有關(guān)其在AML中的具體功能和分子機制研究較少。目前，已有的circRNA在AML中的研究大致可分為兩大類：AML的生物標(biāo)志物和功能機制研究。

2.1生物標(biāo)志物

2.1.1診斷標(biāo)志物 circRNA具有高度的穩(wěn)定性和特異性，在腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景。Hirsch等[23]首先發(fā)現(xiàn)由核仁磷酸蛋白1環(huán)化而成的hsa_circ_0075001與AML存在相關(guān)性，從而開啟了circRNA作為AML生物標(biāo)志物的研究。一項關(guān)于circRNA的臨床研究發(fā)現(xiàn)，circVIM在非急性早幼粒細(xì)胞白血病患者中表達(dá)明顯上調(diào)，通過繪制受試者工作特征曲線，可顯著區(qū)分非急性早幼粒細(xì)胞白血病和細(xì)胞遺傳學(xué)正常的AML患者，提示circVIM為AML理想的診斷標(biāo)志物[24]。AML的髓外浸潤(extramedullary infiltration，EMI)是指骨髓中的白血病細(xì)胞浸潤到骨髓以外的任何其他器官和組織，目前沒有檢測EMI的理想實驗室指標(biāo)[25]。Lv等[26]利用AML患者的骨髓血進行circRNA芯片檢測，通過比較EMI和非EMI樣本中circRNA的表達(dá)差異，篩選出17個與EMI相關(guān)的circRNA分子，并對其中的hsa_circRNA_004520進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)驗證，證實其在EMI中表達(dá)上調(diào)4.38倍，為尋找AML中EMI的診斷標(biāo)志物提供了新思路?？梢?，circRNA的出現(xiàn)，在分子生物學(xué)層面豐富了AML的檢測手段，從而為AML患者的診斷及治療提供更有力的科學(xué)依據(jù)。

2.1.2預(yù)后標(biāo)志物 AML依據(jù)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)檢查等即可確診，但能夠準(zhǔn)確、動態(tài)地監(jiān)測AML疾病進展的生物標(biāo)志物較少[27]，而早期監(jiān)測AML的緩解、復(fù)發(fā)及浸潤對AML的預(yù)后評估均具有重要意義。Li等[28]應(yīng)用芯片技術(shù)檢測circRNA在AML中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0004277在AML患者中表達(dá)下調(diào)，在復(fù)發(fā)難治性AML患者中表達(dá)進一步下調(diào)，提示hsa_circ_0004277可用來監(jiān)測AML早期復(fù)發(fā)；且在化療后獲得完全緩解的AML患者中，hsa_circ_0004277表達(dá)上調(diào)，提示其也可作為評估AML化療療效的動態(tài)指標(biāo)。在EMI相關(guān)的17個circRNA中，通過結(jié)合醫(yī)學(xué)癌癥數(shù)據(jù)庫對17個靶基因進行預(yù)后分析并繪制生存曲線發(fā)現(xiàn)，其中5個靶基因的高表達(dá)在AML中提示不良預(yù)后[26]。Yi等[24]還發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)circVIM的AML患者的總生存期和無白血病生存期更短。上述研究表明，circRNA在AML中具有生物標(biāo)志物的價值，但其臨床應(yīng)用仍存在以下問題：①高通量測序及芯片技術(shù)價格昂貴，今后可通過完善算法和改進技術(shù)降低成本，使得大樣本的AML進行circRNA研究成為現(xiàn)實，從而更加全面、系統(tǒng)地評估circRNA在AML中的預(yù)后因素。②circRNA不僅僅存在于骨髓中，更在外泌體中大量富集，目前有關(guān)AML-外泌體-circRNA的研究處于初始階段，未來circRNA與AML的研究應(yīng)盡可能地按AML發(fā)病時間軸“初治-緩解-復(fù)發(fā)/浸潤”納入AML的研究對象，并應(yīng)在單個研究對象中收集“骨髓血-外周血-外泌體-浸潤組織”標(biāo)本，以助于完善AML患者的預(yù)后評價體系。

2.2功能機制

2.2.1細(xì)胞增殖與分化 AML的發(fā)生和疾病進展與多種調(diào)控因素有關(guān)，如AML細(xì)胞增殖失控、分化障礙等。已有研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在AML中廣泛參與調(diào)節(jié)上述過程。Fan等[29]發(fā)現(xiàn)，circ_100290通過競爭性結(jié)合miR-203上調(diào)靶基因Rab10的表達(dá)，進而抑制凋亡，促進AML細(xì)胞增殖。白血病中染色體異位重排形成融合基因的現(xiàn)象十分普遍，Guarnerio等[30]首次發(fā)現(xiàn)急性早幼粒細(xì)胞白血病和AML的融合基因能產(chǎn)生融合circRNA(fusion-circular RNA，f-circRNA)，f-circRNA在體外實驗中可以促進小鼠胚胎成纖維細(xì)胞增殖并增強其克隆能力，且這一過程獨立于mRNA之外；在體內(nèi)實驗中，f-circRNA可在融合蛋白的協(xié)同下，導(dǎo)致健康小鼠進展為白血病。Ping等[7]的研究證實，過表達(dá)circ_0009910可以促進白血病細(xì)胞增殖，而沉默circ_0009910可以抑制細(xì)胞增殖并促進其凋亡。有研究表明，AML與circRNA之間的作用并不是單向的，AML基因組存在雙微體基因擴增區(qū)域，轉(zhuǎn)錄因子p64的雙微體擴增可以促進白血病細(xì)胞的增殖，同樣轉(zhuǎn)錄因子p64的雙微體擴增也可以引起circRNA的異常表達(dá)[31]。circRNA不僅參與調(diào)控AML中的細(xì)胞增殖過程，Li等[32]通過測序技術(shù)得到全反式視黃酸治療前后508種差異表達(dá)的circRNA，提示circRNA在全反式視黃酸誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞分化過程中具有獨立的功能，尤其以circHIPK2對急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)作用最為重要。Sun等[33]基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，與無Fms樣酪氨酸激酶3基因內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(Fms-like tyrosine kinase 3-internal tandem duplication，F(xiàn)LT3-ITD)突變相比，F(xiàn)LT3-ITD突變的AML患者circMYBL2的表達(dá)水平更高。且該研究進一步證實，circMYBL2通過多聚嘧啶區(qū)結(jié)合蛋白1提高FLT3蛋白的翻譯效率，進而促進AML細(xì)胞分化。這些研究不僅揭示了circRNA在AML中調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的作用，也使得開發(fā)以circRNA為治療靶點的藥物成為可能。

2.2.2白血病細(xì)胞耐藥 白血病細(xì)胞耐藥是AML患者進展為復(fù)發(fā)難治性AML的重要原因，進而導(dǎo)致化療方案的失敗和極高的死亡率[34-35]。目前，AML化療耐藥的具體分子機制尚不明確，成為相關(guān)研究領(lǐng)域的難點。早期研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)f-circRNA可增強白血病細(xì)胞對化療藥物的耐受性[30]，提示circRNA可參與調(diào)控AML的耐藥機制。FLT3-ITD突變的AML患者長期預(yù)后不佳，目前已開發(fā)出針對其突變的抑制劑，研究人員通過敲除circMYBL2，逆轉(zhuǎn)了AML細(xì)胞對FLT3-ITD突變抑制劑的耐藥，提示circMYBL2適用于FLT3-ITD突變的AML患者的靶向治療[33]。阿霉素作為AML化療方案中常見的蒽環(huán)類化療藥物，在臨床應(yīng)用過程中表現(xiàn)出較低的化療敏感性，Shang等[36]通過CeRNA機制揭示了AML中circRNA介導(dǎo)阿霉素耐藥的分子機制，與正常人相比，circPAN3在復(fù)發(fā)難治性AML患者的骨髓樣本中表達(dá)增加，并能通過競爭性結(jié)合miR-153-5p/miR-183-5p，上調(diào)X連鎖凋亡抑制蛋白的表達(dá)，進而增強AML細(xì)胞對阿霉素的耐藥性。以上研究表明，circRNA在調(diào)控白血病細(xì)胞耐藥的相關(guān)領(lǐng)域中具有極大的研究潛力，未來隨著circRNA靶向藥物的出現(xiàn)，有望提高AML患者的長期生存率。但是AML的疾病進展不僅與細(xì)胞增殖、分化和耐藥相關(guān)，腫瘤免疫、腫瘤微環(huán)境和血管新生等病理生理過程在AML中的調(diào)控作用也不可忽視，需引起學(xué)者們的重視。

3 小 結(jié)

目前，AML的常規(guī)檢查方法包括形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和微小殘留病變檢測等，近年來二代測序也逐漸用于評價基因突變在AML預(yù)后中的意義[27]。在傳統(tǒng)化療的基礎(chǔ)上，表觀遺傳藥物(如地西他濱)在復(fù)發(fā)難治性AML患者中的應(yīng)用[37]，細(xì)胞免疫治療和造血干細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展，為AML患者帶來了相對豐富和有效的治療手段。雖然AML的生物標(biāo)志物和預(yù)后評價體系多次進行更新和改進，但仍有許多預(yù)后良好的AML患者死亡率較高[38]，接受最新分子靶向治療的患者仍面臨耐藥和疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險[39-40]，從而導(dǎo)致較短的生存期和較差的生活質(zhì)量。未來，需擴大樣本量及樣本類型，在快速發(fā)展的生物信息學(xué)算法、測序和芯片技術(shù)的支持下，尋找出更多具有代表性的circRNA作為生物標(biāo)志物，以完善對AML乃至整個腫瘤領(lǐng)域的預(yù)后評估體系。目前，circRNA在AML致病機制中的研究尚處于起步階段，且大多數(shù)研究均基于circRNA的CeRNA機制，缺乏足夠的創(chuàng)新性。隨著更多功能機制實驗和臨床試驗的證實，靶向治療AML的circRNA相關(guān)藥物必將出現(xiàn)，并廣泛實現(xiàn)臨床-基礎(chǔ)-臨床的轉(zhuǎn)化與應(yīng)用。