HPLC法測定人血清中阿米卡星的濃度及臨床應(yīng)用

徐蘭，汪鳳華，任琦，陳集志，李剛*

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○八醫(yī)院藥學(xué)科，南昌 330002；2.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院，南昌 330003；3.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，南昌 330029

阿米卡星是一種半合成氨基糖苷類抗生素，常被經(jīng)驗(yàn)性聯(lián)合青霉素類或β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物用于治療Gˉ多重耐藥菌感染，且不會(huì)被普通細(xì)菌酶和低耐藥性細(xì)菌所激活［1］，臨床上常用于呼吸道感染、骨關(guān)節(jié)感染、敗血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、手術(shù)后感染及復(fù)發(fā)性尿路感染等［2］。但由于其具有嚴(yán)重的不良反應(yīng)如腎毒性、聽力損害［3］，因而使用劑量較小且臨床療效差，特別是在重癥多重耐藥菌感染時(shí)使用阿米卡星非常謹(jǐn)慎。阿米卡星具有濃度依賴性，血漿峰濃度/細(xì)菌MIC的比值是評(píng)價(jià)抗菌活性的最好參數(shù)［4］，更高的峰濃度可以獲得更為理想的治療效果［5,6］，臨床上需對(duì)于ICU重癥感染患者給予高于常規(guī)劑量的阿米卡星。因此，對(duì)重癥感染患者需進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，按血藥濃度監(jiān)測結(jié)果及時(shí)調(diào)整給藥方案，減少耐藥菌株的產(chǎn)生，提高治療成功率。

目前關(guān)于阿米卡星的血清濃度測定包括微生物 法［7］、熒光偏振免疫法［8］、HPLC-UV法［9］、HPLC-MS/MS法［2，10］等，但考慮到柱前或柱后衍生化法、固相萃取法操作繁瑣，測定結(jié)果容易受衍生化試劑及衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響，微生物法準(zhǔn)確度欠佳，而普通醫(yī)院無法配備價(jià)格昂貴的液質(zhì)聯(lián)用儀，均無法快速有效進(jìn)行阿米卡星血清濃度監(jiān)測。本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)，采用HPLC-末端吸收法，對(duì)血樣處理方法、色譜條件進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，建立了一種準(zhǔn)確度高、快速、簡便、重現(xiàn)性好的HPLC法測定人血清中阿米卡星濃度，并應(yīng)用于本院血藥濃度監(jiān)測，為臨床醫(yī)師安全合理使用阿米卡星提供參考。

1 儀器與試藥

島津LC-15C型高效液相色譜儀（包括SPD-15C二極管陣列檢測器，LC-15C泵，CTO-15C柱溫箱，SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器）；AZJ-2002-C型超純水儀（美國艾科浦國際有限公司）；KQ3200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AUW120D型1/10萬電子分析天平（日本島津公司）；TG1650-WS型高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；微量移液器（Thermo Fisher科技有限公司）。阿米卡星對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130335-200204，每mg相當(dāng)于655單位）；辛烷磺酸鈉（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：110910，分析純）；無水硫酸鈉、磷酸二氫鉀（西隴科學(xué)股份有限公司，分析純）；乙腈、甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［11］色譜柱為Wondasil C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；預(yù)柱為C18保護(hù)柱（3.0 mm×4 mm，迪馬科技公司）；流動(dòng)相：辛烷磺酸鈉1.8 g和無水硫酸鈉20 g，加pH 3.0的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用0.2 mol/L磷酸溶液調(diào)節(jié)pH值至3.0）50 mL和乙腈75 mL溶解，用水稀釋至1 000 mL；流速為1.3 mL/min；檢測波長為200 nm；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的配制精密稱取阿米卡星對(duì)照品0.023 6 g，置25 mL量瓶中，加注射用水溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.944 0 mg/mL的阿米卡星對(duì)照品溶液，分裝于1.5 mL EP管中，置-20 ℃冰箱保存，備用。

2.3 樣品處理密量取血漿樣品200 μL，加入10%高氯酸溶液50 μL，渦旋振蕩2 min，15 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后，進(jìn)樣分析。

2.4 專屬性試驗(yàn)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。由結(jié)果可知，經(jīng)甲醇、乙腈、正己烷萃取的血樣，阿米卡星保留時(shí)間處無峰或者峰面積非常小，提取回收率非常低，不適合阿米卡星血樣處理。經(jīng)10%高氯酸萃取的阿米卡星血樣，色譜峰形較好，保留時(shí)間約為9.8 min，12 min左右有一雜質(zhì)峰，但不干擾阿米卡星峰型，分離度大于1.5，且血清中其他內(nèi)源性雜質(zhì)對(duì)阿米卡星無干擾。

圖1 HPLC色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取濃度為0.944 0 mg/mL的阿米卡星對(duì)照品溶液適量，加入超純水稀釋并配制成濃度分別為472.84、236.44、118.21、59.12、29.56、9.84、4.92、2.48 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。精密量取空白血清150 μL，置1.5 mL離心管中，加入阿米卡星系列對(duì)照品溶液50 μL，使阿米卡星血清濃度分別為0.62、1.23、2.46、7.39、14.78、29.55、59.11、118.21 μg/mL，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以血清濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得阿米卡星的回歸方程為Y=7 013.8C-6 242，r=0.999 8。定量下限濃度為0.62 μg/mL。結(jié)果表明，阿米卡星血清濃度在0.62～118.21 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 回收率試驗(yàn)分別配制低、中、高濃度為1.23、7.39、29.55 μg/mL的阿米卡星對(duì)照品血清樣品，每個(gè)濃度樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以峰面積代入回歸方程計(jì)算得出各濃度的測定值，與加入濃度比較，計(jì)算方法回收率。分別配制低、中、高濃度為1.23、7.39、29.55 μg/mL的阿米卡星對(duì)照品血清樣品及水溶液，每個(gè)濃度樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄峰面積分別為A1、A2。絕對(duì)回收率=（血清樣品峰面積/水溶液峰面積）×100%=（A1/A2）×100%。結(jié)果見表1，說明該方法符合生物樣品分析要求。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=5）

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（±s，n=5）

2.7 精密度試驗(yàn)分別配制低、中、高濃度為1.23、7.39、29.55 μg/mL的阿米卡星對(duì)照血清樣品，每個(gè)濃度樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行分析，測定日內(nèi)5次及日間5次的精密度，結(jié)果阿米卡星的日內(nèi)和日間精密度RSD均＜10%，該方法符合生物樣品分析要求。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)分別配制低、中、高濃度為1.23、7.39、29.55 μg/mL的阿米卡星對(duì)照血清樣品，每個(gè)濃度樣品各3份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，分別考察在室溫穩(wěn)定性、冷藏穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性。室溫穩(wěn)定性：室溫放置0、2、4、6、8、12 h；冷藏穩(wěn)定性：4 ℃、-20 ℃冰箱分別冷藏放置24 h；凍融穩(wěn)定性：-20 ℃冰箱中凍存，取出自室溫自然融化，再置-20 ℃冷凍24 h，此步驟重復(fù)2次，共進(jìn)行3次凍融試驗(yàn)。以上樣品均按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2，阿米卡星峰面積均變化不大（峰面積變化＜15%，RSD＜6.26%），說明阿米卡星血清樣品在室溫、冷藏、凍融條件下均比較穩(wěn)定。

表2 血清樣品阿米卡星的穩(wěn)定性（±s，n=5）

表2 血清樣品阿米卡星的穩(wěn)定性（±s，n=5）

3 治療藥物監(jiān)測

收集2019年6月至2020年6月我院ICU住院的重癥感染患者16例，患者因治療需要聯(lián)合青霉素類或β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物用于治療革蘭陰性多重耐藥菌感染。給藥方案為0.4 g加入250 mL 0.9%氯化鈉注射液中靜脈滴注，q12 h。在用藥48～72 h血藥濃度達(dá)穩(wěn)態(tài)后，經(jīng)外周靜脈采血，谷濃度在阿米卡星靜滴前30 min采血，峰濃度在阿米卡星靜滴完畢后30 min采血。本試驗(yàn)方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。共收集患者血清36例，測定結(jié)果為峰濃度 在21.35～43.18 μg/mL［（31.56±4.73）μg/mL］，有6例樣品濃度低于定量下限，其余樣本谷濃度在1.05～8.59 μg/mL［（4.36±1.13）μg/mL］。

4 討論

本試驗(yàn)比較了10%高氯酸、甲醇、乙腈、正己烷等幾種蛋白沉淀劑對(duì)血漿樣品分離效果的影響。經(jīng)甲醇處理的樣品，靜置后進(jìn)樣瓶底部有白色沉淀物，且阿米卡星提取回收率較低，僅有25%左右，不能滿足定量下限的要求；經(jīng)乙腈處理的樣品，阿米卡星保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，這與張亮［9］采用乙腈進(jìn)行萃取的結(jié)果不一致，分析原因可能與色譜柱、高效液相色譜儀型號(hào)不一致或者流動(dòng)相選擇不同有關(guān)。而經(jīng)正己烷提取后的血漿中雜質(zhì)峰較多，干擾阿米卡星峰；經(jīng)10%高氯酸沉淀蛋白后，阿米卡星提取回收率達(dá)90%左右，且干擾峰較少，能減少血清中雜質(zhì)干擾，故選擇10%高氯酸作為蛋白沉淀試劑。對(duì)10%高氯酸的用量（20 μL、50 μL）進(jìn)行考察，20 μL用量沉淀后的血樣較渾濁，雖然提取回收率較高（達(dá)96%），但靜置后底部仍有白色沉淀物，沉淀效果欠佳；50 μL用量處理的血樣，上清液靜置24 h后仍澄清，且色譜圖干擾峰較少，提取回收率滿意。

由監(jiān)測結(jié)果可知，不同患者的谷、峰濃度差異比較大，其中6例患者谷濃度低于定量下限。阿米卡星檢測波長為200 nm，屬于末端吸收，靈敏度較低，定量下限為0.62 μg/mL。部分患者阿米卡星在體內(nèi)的代謝及清除較快，給藥后24 h內(nèi)排泄90%以上，體內(nèi)藥物濃度低于0.62 μg/mL，本方法無法檢測到。阿米卡星血清濃度個(gè)體化差異較大，分析原因可能與ICU重癥感染患者存在影響藥物體內(nèi)分布和排泄的多種因素有關(guān)，比如高齡、低蛋白血癥、肝腎功能損傷等，這些病理生理變化都會(huì)造成藥物在體內(nèi)過程發(fā)生改變，分布容積增大、藥物稀釋、清除增加等。而且阿米卡星主要經(jīng)腎小球?yàn)V過排泄，各器官功能的下降也可引起藥物代謝及清除下降，ICU重癥感染患者腎功能差異較明顯。這些原因都會(huì)造成阿米卡星在重癥患者體內(nèi)濃度存在一定的個(gè)體化差異。

阿米卡星具有耳毒性和腎毒性，因此非常有必要通過優(yōu)化抗菌藥物治療方案，嚴(yán)密監(jiān)測患者血清濃度（谷濃度＞5 μg/mL為毒性閾值）。因本研究測定病例數(shù)較少，下一步研究方案擬擴(kuò)大樣本測定量，并監(jiān)測患者腎功能、聽力，將阿米卡星的血清濃度與抗菌效果、不良反應(yīng)有效結(jié)合起來，提高抗感染治療效果的同時(shí)避免阿米卡星引起的不良反應(yīng)，得到優(yōu)化的、個(gè)體化的給藥方案應(yīng)用于臨床，促進(jìn)抗菌藥物的持續(xù)質(zhì)量改進(jìn)，為藥學(xué)同行提供參考依據(jù)。