濃香型白酒窖泥微生物群落多樣性及理化因素對其影響

胡曉龍，余苗，王康麗，田瑞杰，楊旭，王永亮，張治剛，趙西民，何培新*

（1.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.賈湖酒業(yè)集團有限責任公司，河南 漯河 462400；3.河南省張弓酒業(yè)有限公司，河南 商丘 476700）

濃香型、清香型、醬香型和米香型為中國白酒四大基本香型，其中濃香型白酒占整個白酒行業(yè)銷量的70%左右。濃香型白酒的生產是以高粱、大米、玉米等谷物為原料，經固態(tài)發(fā)酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，其具有窖香濃郁、綿甜醇厚、香味協調、回味悠長等特征，深受消費者青睞[1]。窖泥是濃香型白酒生產的重要微生物來源之一，其復雜的微生物群落與濃香型白酒品質密切相關[2-3]。例如，產己酸菌屬為濃香型白酒主體香己酸乙酯的合成提供前體物質己酸，張應剛[4]的研究中表示甲烷菌與其共生有助于提升己酸產量。為了闡明窖泥對白酒生產的影響，窖泥微生物群落多樣性以及理化性質對其影響成為研究的熱點[5]。其中隨著窖泥質量增加，厚壁菌門（Firmicutes）呈下降趨勢，而擬桿菌門（Bacteroidetes）和廣古菌門（Euryarchaeota）呈增加趨勢[2，4]，窖泥中細菌總量與窖泥理化因子pH值、銨態(tài)氮和有效磷呈正相關[6]，趨老熟和老熟狀態(tài)的窖泥樣品中梭菌屬（Clostridium）的優(yōu)勢較為明顯。窖泥中微生物群落非常復雜，其組成與窖池窖齡[5]和空間位置[7]有關。Tao等[5]研究結果指出隨著窖齡增加（0～25年），窖泥微生物菌群結構不斷變化并趨于穩(wěn)定，老窖窖泥微生物群落結構處于均衡狀態(tài)且窖泥微生物多樣性高。此外，窖泥微生物群落多樣性和組成明顯受窖泥理化性質的影響，且兩者之間存在交互作用[8-10]。窖泥pH值與擬桿菌門（Bacteroidetes）呈極顯著（P<0.01）正相關，而與乳酸桿菌屬（Lactobacillus）呈極顯著（P<0.01）負相關，銨態(tài)氮含量與廣古菌門（Euryarchaeota）呈極顯著（P<0.01）正相關等[5，8]。

高通量測序技術能更為全面地認識目標環(huán)境中微生物群落信息[7，11-12]，已廣泛應用于窖泥微生物群落多樣性和組成解析，但目前研究主要集中在四川、安徽等濃香型白酒產區(qū)，尤其是四川產區(qū)[7，11]。河南作為我國白酒主產區(qū)之一，主要以濃香型白酒企業(yè)為主，在2016年河南白酒產量為117.50萬千升，位居全國第二[13]。但針對該產區(qū)的窖泥微生物群落多樣性及其組成研究相對較少。因此，本研究以河南某知名濃香型白酒企業(yè)4年和40年窖壁泥和窖底泥為研究對象，采用高通量測序技術解析其中窖泥原核微生物群落多樣性和組成，結合冗余相關分析（redundancy analysis，RDA）揭示其與窖泥理化因素之間的相關性，有助于闡明影響窖泥微生物群落演替的理化因素。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

氫氧化鈉、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、濃硫酸（ρ=1.84 g/mL）、鹽酸（ρ=1.19 g/mL）、苯酚、亞硝基鐵氰化鉀、高氯酸鈉、氯化銨、酒石酸銻鉀、鉬酸銨、氟化銨、硼酸：國藥集團化學試劑有限公司，所有試劑均為分析純。Magen HiPureSoilDNAKit試劑盒：廣州美基生物科技有限公司。

1.1.2 儀器

UV BlueStar A紫外分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；PB-10 PH計：德國Sartorius公司；MP200A精密電子天平：上海良豐儀器儀表有限公司；101-1電熱鼓風干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；DF-1集熱式恒溫磁力攪拌鍋：金壇市中大儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 窖泥取樣方法

窖泥樣品均取自豫酒產區(qū)某濃香型白酒企業(yè)。針對該企業(yè)新窖（4年，XJ）和老窖（40年，LJ）兩類窖池進行取樣，其中隨機選取正常使用的新窖2口（XJ1和XJ2），老窖 4 口（LJ1、LJ2、LJ3 和 LJ4），分別選取每口窖池窖壁及窖底兩個位置的窖泥樣品混合樣作為該窖池的窖壁泥（B）和窖底泥（D）代表樣品。共計12個窖泥代表樣（表1），于-30℃保存?zhèn)溆?。采集窖泥樣品及編號見?，窖泥取樣位置見圖1。

表1 采集窖泥樣品及編號Table 1 Collect samples and numbers of pit mud

圖1 窖泥取樣位置Fig.1 Collection sample location of pit mud

1.2.2 理化指標檢測方法

參照李俊輝等烘干法和電位法分別測定窖泥含水量及pH值[12]。采用酸、堿中和滴定法測定總酸含量[14]。采用靛酚藍比色法測定窖泥中銨態(tài)氮含量[15]。參照NY/T 1121.7—2014《中華人民共和國農業(yè)行業(yè)標準》，第7部分：土壤有效磷的測定檢測窖泥中有效磷含量[16]。

1.2.3 窖泥基因組提取、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）及高通量測序

采用Magen HiPure Soil DNA Kit試劑盒參照步驟說明對窖泥樣品DNA進行提取，使用QubitdsDNA HS Assay Kit檢測DNA濃度。采用上游引物5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3′和下游引物 5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′，對原核生物16S rRNA基因的V3和V4區(qū)進行擴增。

PCR擴增反應體系：TransStart Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、TransStart Taq DNA 0.5 μL、模版 20 ng、上下游引物各1μL，用ddH2O（雙蒸水）補足體積到25μL。

反應條件：預變性94℃ 3 min，變性 94°C 5 s，退火 57℃90 s，延伸 72℃10 s，終延伸72℃ 5 min，24個循環(huán)。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將合格的PCR產物委托蘇州金唯智生物科技有限公司進行高通量測序文庫構建及Illumina MiSeq雙端測序。

1.3 數據處理

采用 Cutadapt（v1.9.1）、Vsearch（1.9.6）及 Qiime（1.9.1）軟件對高通量測序序列進行質控，包括序列拼接、去掉含有N的序列、去除引物和接頭、去除質量值<20的堿基及長度<200 bp的序列及去除嵌合體。經過質控的序列使用VSEARCH（1.9.6）進行序列聚類，其中相似性設為97%歸為1個OUT。利用貝葉斯算法（Ribosomal database program，RDP）對操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）數量的代表性序列進行物種分類學分析，并在不同物種分類水平下統計每個樣本的群落組成?；贠TU得到分析結果，采用對樣本序列進行隨機抽平的方法，分別計算香農（Shannon）指數、Chao1指數等α-多樣性指數。采用SPSS（IBM19）軟件完成方差分析及聚類分析；利用O－rigin9.0繪制窖泥樣品優(yōu)勢（平均相對含量大于1%）菌門與優(yōu)勢菌綱百分比柱狀圖；采用HemI軟件繪制熱圖；采用Canoco 5軟件繪制RDA圖譜。

2 結果與討論

2.1 窖泥理化性質分析

不同窖泥理化性質、原核微生物群落OTU數量及其α-多樣性見表2。

窖泥理化性質分析表明，4組窖泥理化因子除含水量外，其它理化因子均存在顯著性（P＜0.05）差異（表2）。4組窖泥樣品分類中新窖窖底泥pH值顯著高于其他幾組（P＜0.05），老窖窖底泥pH值最低。新窖窖底泥（60.88 mg/100 g）和老窖窖壁泥（53.64 mg/100 g）銨態(tài)氮含量顯著高于其它組窖泥（P＜0.05）。除老窖窖壁泥外，新窖窖底泥有效磷含量顯著高于其他組窖泥（P＜0.05）。此外，老窖窖壁泥和窖底泥只有銨態(tài)氮含量存在顯著性差異（P＜0.05）；新窖窖壁泥和窖底泥的理化因子含量（含水量除外）均存在顯著性差異。而上述理化性質差異將導致不同類型窖泥微生物群落結構存在差異，且兩者之間存在交互作用。例如，窖泥pH值可以直接和間接影響微生物生長繁殖[8-9，17]，低pH值將有利于耐酸的乳酸桿菌屬富集，而其它最適pH值為近中性或微偏酸的梭菌綱（Clostridia）、甲烷桿菌綱（Methanobacteria）、甲烷微菌綱（Methanomicrobia）及擬桿菌綱（Bacteroidia）等微生物數量將減少[18-20]；銨態(tài)氮和有效磷為微生物生長和代謝提供速效營養(yǎng)物質。同時，窖泥微生物群落變化將會引起窖泥理化性質改變，如乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的富集可以導致其代謝物乳酸的積累，進而導致窖泥pH值下降[5]；沉積菌屬（Sedimentibacter）具有降解氨基酸及提高銨態(tài)氮的能力[21]。

表2 不同窖泥理化性質、原核微生物群落OTU數量及其α-多樣性Table 2 Physicochemical properties，number of OTUs of prokaryotic microbial communities and α-diversity in pit mud from different pit

2.2 窖泥微生物α-多樣性分析

由表2可見，隨著窖泥窖齡增加和位置的深度增加，窖泥的OTU數分別均呈現降低的趨勢，但無顯著性（P＞0.05）差異。窖泥Chao1指數和ACE指數變化規(guī)律與OTU數的變化趨勢一致。新窖窖壁泥和新窖窖底泥α-多樣性指數均沒有顯著性（P＞0.05）差異；老窖窖底泥Shannon指數和辛普森（Simpson）指數顯著性（P＜0.05）低，而其它組窖泥之間沒有顯著差異。結合窖泥理化性質分析，可發(fā)現窖泥pH值變化與Shannon指數變化一致，推測pH值與窖泥物種豐度和多樣性呈一定的正相關，與胡曉龍等研究結果一致[8，22]。

2.3 窖泥微生物群落β-多樣性分析

2.3.1 窖泥微生物群落門和綱水平上組成

基于OTU注釋，對窖泥樣品中微生物群落門水平和綱水平相對豐度進行分析，結果見圖2。

圖2 窖泥樣品優(yōu)勢菌門相對豐度和窖泥樣品優(yōu)勢菌綱相對豐度Fig.2 Relative abundance of dominant phylum and class in pit mud samples

所有窖泥樣品中共檢測到15個門，由細菌和古菌構成，分別占96.3%和3.7%。厚壁菌門（Firmicutes，63.56%）、變形菌門（Proteobacteria，15.19%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，14.42%）、廣古菌門（Euryarchaeota，4.32%）和放線菌門（Actinobacteria，1.6%）為優(yōu)勢（平均含量>1%）菌門（圖2a）。其中Firmicutes為絕對優(yōu)勢菌門，在所有樣品中平均含量均最高。Bacteroidetes和Euryarchaeota在新窖窖底泥和老窖窖壁泥中含量都較高，與已報道的正常窖泥和優(yōu)質窖泥原核菌群結構更為相似[8]。Proteobacteria在新窖樣品平均相對含量（28.92%）較高，而老窖中其含量急劇下降，與張應剛等研究結果一致[11]。此外，綠彎菌門（Chloroflexi）和螺旋體門（Spirochaetes）等為該酒企窖泥中的稀有菌門（平均含量<0.01%）。

在綱水平共檢測到29個綱，包括6個優(yōu)勢（平均相對含量>1%）菌綱，即芽孢桿菌綱（Bacilli）、梭菌綱（Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、γ-變形桿菌綱（Gammaproteobaoteria）、甲烷桿菌綱（Methanobacteria）和甲烷微菌綱（Methanomicrobia）（圖2b）。其中Bacilli（74.20%）在老窖窖底泥中占絕對優(yōu)勢，梭菌綱（Clostridia）是新窖窖底泥（31.24%）和老窖窖壁泥（43.29%）中的第一大優(yōu)勢菌綱。此外，甲烷菌數量和代謝能力可能是窖泥老熟的重要標志之一[23]，且其與梭菌屬的協同作用可提高白酒主體香味己酸乙酯含量[4，8]，Methanobacteria（9.61%）和 Methanomicrobia（2.76%）在新窖窖底泥中總豐度含量最高，其次為老窖窖壁泥，含量分別為3.42%和0.74%；Clostrdia含量一般隨著窖泥的窖齡和質量增加而增加[5，8]，其在新窖窖底泥和老窖窖壁泥中都為第一優(yōu)勢菌，在一定程度上反映了新窖窖底泥和老窖窖壁泥質量及老熟程度可能要高于新窖窖壁泥和老窖窖底泥。

2.3.2 窖泥屬水平微生物群落組成

基于OTU注釋，對窖泥樣品中優(yōu)勢菌屬（所有樣品中平均相對含量大于1%）按照門水平分類進行聚類，結果見圖3。

圖3 基于優(yōu)勢屬的物種進化樹Fig.3 Evolutionary tree based on dominant genera

共檢測到179個屬，有12個優(yōu)勢（所有樣品中平均相對含量大于1%）菌屬，即乳酸桿菌屬（Lactobacillus，36.84%）＞產己酸菌屬（Caproiciproducens，14.30%）>不動菌屬 （Acinetobacter，4.43%）>理研菌屬（Petrimonas，4.30%）>梭菌屬-12（Clostridium_sensu_stricto_12，4.23%）>Proteiniphilum （4.00%）>Prevotella_7（2.54%）>假單胞菌屬（Pseudomonas，2.37%）>甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter，1.96%）>氫孢菌屬（Hydrogenispora，1.32%）>沉積菌屬（Sedimentibacter，1.29%）>梭菌屬-1（Clostridium_sensu_stricto_1，1.19%）。系統發(fā)育樹分析表明上述優(yōu)勢屬分屬于Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes和Euryarchaeota門，其中主要集中于Firmicutes門，與我國四川、貴州等濃香型白酒產區(qū)窖泥研究中優(yōu)勢屬種類一致性較高[5，24]。

選取每個窖泥樣品中含量前十的菌屬進行熱圖分析，占每個樣品含量88.8%～99.2%，共43個屬，結果見圖4。

圖4 窖泥樣品含量前十的屬Fig.4 Top 10 genera of pit mud samples

熱圖分析進一步揭示了不同窖齡、窖池位置窖泥微生物屬水平上的差異。其中新窖和老窖樣品分別聚為簇i和簇ii，表明不同窖齡窖泥含量前十的屬存在明顯差異。例如，優(yōu)勢菌屬Lactobacillus、Caproiciproducens和Prevotella_7在老窖中含量高于新窖，而其它優(yōu)勢菌屬在新窖窖泥中含量高。不同窖池空間位置窖泥含量前十的屬也存在明顯差異。例如，Petrimonas（12.23%）、Proteiniphilum（9.18%）和 Methanobrevibacter（9.87%）含量在新窖窖底泥顯著（P＜0.05）高于其它組窖泥，其次是老窖窖壁泥（P＞0.05）；Caproiciproducens在老窖窖壁泥中含量最高（17.95%）。Clostridium和Caproiciproducens在老窖、質量較高窖泥中含量較高，是我國其它產區(qū)（四川、江蘇等）老窖泥和正常窖泥的主要功能菌[5，10，22]；新窖中部分菌屬如 Pseudomonas、Hydrotalea、Clostridium_sensu_stricto_1 等隨窖池位置深入豐度減少，而另一部分菌屬Methanobrevibacter、Proteiniphilum、Petrimonas等隨著窖池位置深入豐度增加成為優(yōu)勢菌屬，且老窖中大部分菌屬不會隨窖池位置深入豐度發(fā)生較大變化。此外，部分非優(yōu)勢菌屬如Bacillus、Hydrotalea等僅在新窖中占有一定的豐度，在老窖中含量極少。匯總相關文獻發(fā)現[4-5，22]，部分前十屬在窖泥生境中具有對濃香型白酒重要風味物質形成及維持窖泥微生態(tài)平衡的作用或潛力。例如，Clostridium屬是窖泥中重要功能菌之一，其相應的種（如C.kluyveri和C.tyrobutyricum）在厭氧或兼性厭氧條件下能將有機物轉化為有機酸（己酸、丁酸等），與醇類反應生成各種衍生物己酸乙酯和丁酸乙酯[10]，其為濃香型白酒中重要的呈香物質。Sedimentibacter屬能代謝氨基酸，其分解產物銨態(tài)氮可以作為窖泥中微生物的氮源[21]。Petrimonas屬具有代謝糖類生成乙酸、氫氣和CO2的功能[24]。Hydrogenispora可利用葡萄糖產乙酸、乙醇和H2[25]。Caproiciproducens會加快利用碳源轉化為乙醇、乙酸、丁酸、己酸，是窖泥中產己酸的重要菌群，其代謝副產物主要是H2。氫營養(yǎng)型甲烷菌（Methanobrevibacter）主要利用氫氣和甲基類化合物生成甲烷，實現了窖泥中氫轉移，解除窖泥中氫對微生物生長繁殖的抑制作用；其與己酸菌共生時使其反應向有利于產生己酸的方向進行[26]。

2.4 窖泥理化因子與窖泥優(yōu)勢菌屬的冗余分析（RDA）

如前所述，窖泥理化性質影響窖泥微生物組成。冗余分析進一步分析了窖泥理化性質與窖泥優(yōu)勢菌屬之間的相關性，結果見圖5。

圖5 窖泥理化因子與平均含量優(yōu)勢屬（12個）的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of physicochemical factors and dominant genus（12 numbers）with average content

圖中箭頭的長度代表相關性的大小，中心點和窖泥菌群之間的連線與箭頭的夾角為銳角表示窖泥優(yōu)勢菌屬與相應的理化因子呈正相關，鈍角表示負相關。圖5中兩個主成分總解釋度51.98%，主要集中在Axis1（32.68%）。所有窖泥樣品共聚為4類，同一類窖泥樣品單獨表明優(yōu)勢微生物群落組成相似。其中同一窖齡不同空間位置的窖泥樣品基本分布在Axis1軸0刻度垂直線的兩側；新、老窖泥在Axis2軸上能較好地區(qū)分開來，其中新窖窖泥主要分布在圖5第一象限和第二象限，老窖窖泥主要分布在圖5第三象限和第四象限。這種新老窖泥及不同位置窖泥微生物群落差異是由多種理化因子共同作用引起的，如新窖窖底泥與pH值、銨態(tài)氮和有效磷呈正相關；新窖窖壁泥與除了總酸外其它理化因子呈負相關，尤其是銨態(tài)氮和有效磷。條件限制分析（conditional term effects）揭示了每個理化因子對優(yōu)勢菌群結構影響程度，其中總酸（30.7%）對優(yōu)勢菌屬影響最大，具有極顯著貢獻（P<0.01），其次是 pH值（15.7%，P＜0.05），其它依次為銨態(tài)氮（8.5%）＞含水量（4.1%）＞有效磷（2.7%），不具有顯著性（P＞0.05）。pH值能區(qū)分不同質量等級窖泥，其與銨態(tài)氮和有效磷對窖泥質量影響最大[17，27]。目前關于新老窖泥菌群差異的研究[8，28]均表明pH值與優(yōu)質老窖泥的菌群呈強烈正相關，總酸與新窖泥或者退化窖泥的菌群呈強烈正相關。綜上，pH值、總酸和銨態(tài)氮是影響不同窖齡和不同窖池位置窖泥中優(yōu)勢微生物菌群分布的主要理化因子，尤其是總酸和pH值。

3 結論

本文分析了一家豫酒企業(yè)新、老窖池中窖壁和窖底窖泥樣品的理化性質及其原核菌群結構，其中窖泥樣品含水量（31.76%～35.29%）、pH 值（4.08～8.52）、總酸（1.19 mg/g～10.07 mg/g）、銨態(tài)氮（4.19 mg/g～60.88 mg/100g）和有效磷（2.08 mg/100g～14.04mg/100 g），在不同類窖泥中存在一定的差異。Observed OTU、Chao1指數和ACE指數在不同分組窖泥中沒有顯著性（P＞0.05）差異，除老窖窖底泥香農指數和辛普森指數顯著性（P＜0.05）低，其它組沒有顯著性差異。窖泥β-多樣性表明，窖泥中厚壁菌門（Firmicutes）占絕對優(yōu)勢，其中 Bacteroidetes（23.83%） 和 Euryarchaeota（8.35%）在新窖窖底泥和老窖窖壁泥中含量都較高；綱水平上，芽孢桿菌綱（Bacilli，74.20%）在老窖窖底泥中占絕對優(yōu)勢，梭菌綱（Clostridia）在新窖窖底泥（31.24%）和老窖窖壁泥（43.29%）中為第一大優(yōu)勢菌綱；屬水平上，12 個優(yōu)勢屬主要有 Lactobacillus、Caproiciproducens、Acinetobacter等，隸屬于 4個菌門，且有6個優(yōu)勢菌屬（除未分類的菌屬）隸屬于厚壁菌門（Firmicutes）。RDA分析表明總酸和pH值對窖泥優(yōu)勢菌群相關性解釋度最高，表明總酸和pH值是影響窖泥優(yōu)勢菌群分布的主要理化因子。