超高壓輔助提取桑葚花色苷及其抗氧化活性研究

李鵬，馬劍，張宏志，王英，王愈，馬艷弘，，李志剛，袁永生

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.南京福晶農(nóng)業(yè)科技有限公司，江蘇 南京 210014）

桑葚是?？坡淙~喬木桑樹(shù)（Morus alba L.）的果實(shí)，俗稱桑果、桑棗，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源植物[1]，含有豐富的花色苷、多糖、有機(jī)酸等生物活性成分[2]，具有黑發(fā)明目、補(bǔ)益肝腎、提升人體免疫力、延緩機(jī)體衰老、降低血糖血脂、預(yù)防人體動(dòng)脈硬化、骨骼關(guān)節(jié)硬化以及促進(jìn)新陳代謝等保健功效，被譽(yù)為“二十一世紀(jì)的最佳保健圣果”[3-4]。

花色苷是一類具有苯并吡喃結(jié)構(gòu)的天然水溶性色素，廣泛存在于有色植物果實(shí)、花朵及子葉中[4-5]，可賦予果蔬、花卉等植物藍(lán)色、紅色和紫色，因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)[6]使其具有抗炎[7]、抗腫瘤[8]、降血糖[9]、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[10]、降血脂[11]等生物學(xué)功效。花色苷是桑葚中主要的食品功能因子，提取方法主要有熱浸提法[12]、超聲波輔助法[13]、微波輔助法[14]、酶提取法[15]、超臨界萃取法[16]、超高壓輔助提取[17-18]等。其中，超高壓輔助提取技術(shù)（ultra-high pressure-assisted extraction，UHP）是利用水或其它流體為媒介，將樣品在100 MPa以上壓力下保持一定時(shí)間，促使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)破壞、目標(biāo)產(chǎn)物充分釋放的一種新型提取技術(shù)[19]。與其它提取技術(shù)相比，超高壓處理時(shí)提供給物料的能量相對(duì)較低，一般只破壞對(duì)生物大分子立體結(jié)構(gòu)有貢獻(xiàn)的氫鍵、離子鍵、疏水鍵等非共價(jià)鍵，而對(duì)共價(jià)鍵沒(méi)有影響，具有能耗低、效率高、對(duì)生物活性物質(zhì)影響小等優(yōu)點(diǎn)[19-20]，目前已被應(yīng)用于多酚[21]、多糖[22]、黃酮等物質(zhì)的提取，但是超高壓輔助提取桑葚花色苷的研究仍鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以桑葚為原料，花色苷得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超高壓輔助提取桑葚花色苷的工藝條件，并評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，為桑葚及天然色素的深度開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚：句容萬(wàn)山紅遍生物科技有限公司。

DPPH、抗壞血酸（VC）：上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀、氯化鉀、過(guò)氧化氫（均為分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司；乙醇、乙酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-PB40E253C多功能榨汁機(jī)：美的集團(tuán)股份有限公司；D-Epoch全自動(dòng)酶標(biāo)儀：Bio Tek公司；PL303電子天平、FE-20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：梅特勒托利多（上海）有限公司；D-8紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HPP600MPa超高壓食品處理裝置：包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 桑葚花色苷的提取

取解凍打漿后的桑葚果漿10.00 g，按照一定的液料比與一定濃度的酸化乙醇溶液（1mol/LHCl調(diào)節(jié)pH 3）混合均勻，無(wú)損轉(zhuǎn)移于聚乙烯袋，充分混勻后封口，置于超高壓食品處理裝置中處理，提取結(jié)束后，將樣品置于離心機(jī)中以4 500 r/min離心，收集上清液，即為花色苷提取液。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱取桑葚果漿10.00 g，無(wú)損轉(zhuǎn)移至聚乙烯塑料袋中，加入酸化乙醇溶液（pH 3），混勻后封口，置于超高壓食品處理裝置中室溫（25℃）保壓處理10 min，分別考察液料比[6 ∶1、9 ∶1、12 ∶1、15 ∶1、18 ∶1（mL/g）]、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、提取壓力（100、200、300、400、500 MPa）對(duì)花色苷得率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乙醇濃度（A）、提取壓力（B）、液料比（C）為試驗(yàn)因素，以桑葚花色苷得率為響應(yīng)值（Y），采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)，根據(jù)Design-Expert 8.06軟件優(yōu)化超高壓輔助提取桑葚花色苷的工藝條件。試驗(yàn)因素與水平編碼表見(jiàn)表1。

表1 因素及水平編碼Table 1 Coded levels for factors used in Box-Behnken design

1.3.4 桑葚花色苷熱提取法

參考文獻(xiàn)[12]，準(zhǔn)確稱取10.00 g桑葚果漿于聚乙烯袋中，按照液料比15∶1（mL/g）加入60%乙醇溶液，封口，40℃水浴60 min，提取結(jié)束后，將樣品置于離心機(jī)中以4 500 r/min離心，收集上清液，將熱提取得到的花色苷得率與超高壓輔助提取得到的花色苷得率進(jìn)行比較。

1.3.5 桑葚花色苷得率的測(cè)定

采用pH值示差法測(cè)定桑葚花色苷含量[23]，取1.0mL樣品液，分別加入9.0 mL pH 1.0的KCl緩沖液與pH 4.5的乙酸鈉緩沖液，搖勻、避光靜置60 min，分別在520、700 nm處測(cè)定吸光值，按照公式（1）計(jì)算花色苷得率 Y（mg/g）。

式中：A1為樣品中加入pH 1.0的KCl緩沖液時(shí)在520 nm與700 nm處測(cè)得的吸光度差值；A2為樣品中加入pH 4.5的乙酸鈉緩沖液時(shí)在520 nm與700 nm處測(cè)得的吸光度差值；Mr為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量，449.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；V為總體積，mL；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；1為比色皿光程，cm；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.3.6 體外抗氧化能力的測(cè)定

1.3.6.1 DPPH·清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[24]，準(zhǔn)確配制終濃度為0.6 mmol/L的DPPH乙醇溶液。將2 mL DPPH溶液與1 mL不同濃度桑葚花色苷溶液（0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6 mg/mL）混合均勻，避光反應(yīng)30 min，以同濃度的VC溶液作陽(yáng)性對(duì)照，在517 nm處測(cè)定混合液的吸光度A，按照公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A1為2 mL DPPH溶液與1 mL樣品液的吸光度；A2為2 mL無(wú)水乙醇與1 mL樣品液的吸光度；A0為2 mL DPPH溶液與1 mL無(wú)水乙醇的吸光度。

1.3.6.2 羥自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[25]，稍作修改，配制2 mg/mL硫酸亞鐵溶液，取硫酸亞鐵溶液1 mL，依次加入1.5 mg/mL水楊酸-乙醇溶液1 mL、不同濃度的花色苷樣品溶液（0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL）1 mL、1% 的過(guò)氧化氫1 mL，混合均勻，37℃保溫1 h，于526 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，按公式（3）計(jì)算羥自由基清除率。

式中：A1為樣品吸光度；A2為無(wú)水乙醇溶液代替水楊酸-乙醇溶液的吸光度；A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度。

1.3.6.3 鐵離子還原力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[26]，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，取1 mL不同濃度的樣品液，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后于50℃水浴中保持20 min，迅速冷卻后加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，充分混勻后取上清液2.5 mL，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1%的氯化鐵溶液，通過(guò)測(cè)定700 nm處的吸光度，分析鐵離子還原力的強(qiáng)弱，吸光度越高表明還原能力越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行處理，Design-Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取壓力對(duì)桑葚花色苷得率的影響

在液料比為 9 ∶1（mL/g）、保壓時(shí)間為 10 min、乙醇濃度為70%（pH 3）條件下，考察提取壓力對(duì)花色苷得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 提取壓力對(duì)桑葚花色苷得率的影響Fig.1 Effect of extraction pressure on the yield of anthocyanins of mulberry

由圖1可知，壓力在100 MPa～400 MPa范圍內(nèi)，桑葚花色苷得率隨著壓力的增大而升高。這是由于壓力的增大不僅可以改變細(xì)胞膜的構(gòu)象，使得細(xì)胞膜的通透性增加，傳質(zhì)阻力降低，而且還能增大細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差，提高提取液對(duì)花色苷的浸潤(rùn)速率，進(jìn)而促進(jìn)了花色苷得率的提高[27]；當(dāng)壓力達(dá)400 MPa時(shí)，花色苷得率最高為（1.87±0.04）mg/g，此時(shí)花色苷已經(jīng)充分溶出，繼續(xù)增大提取壓力，花色苷得率趨于穩(wěn)定。

2.1.2 液料比對(duì)桑葚花色苷得率的影響

在提取壓力300 MPa、保壓時(shí)間10 min、乙醇濃度70%（pH 3）條件下，考察液料比對(duì)桑葚花色苷得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 液料比對(duì)桑葚花色苷得率的影響Fig.2 Effect of liquid to solid ratio on the yield of anthocyanins of mulberry

由圖 2 可知，液料比在 6 ∶1（mL/g）～12 ∶1（mL/g）范圍內(nèi)，桑葚花色苷得率隨溶劑體積的增加而提高，液料比為 12 ∶1（mL/g）時(shí)，花色苷得率最高（1.63±0.02）mg/g，之后花色苷得率趨于穩(wěn)定。在提取過(guò)程中，提取液中的花色苷濃度逐漸提高，且液料比越大，二者濃度梯度越大，擴(kuò)散速率越快，越有利于有效成分的溶出[27]。但進(jìn)一步提高液料比會(huì)因提取液中的花色苷濃度變化較小而趨于平緩，而且還會(huì)增大后續(xù)濃縮的難度[28]。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)桑葚花色苷得率的影響

在液料比 9 ∶1（mL/g）、提取壓力 300 MPa、保壓時(shí)間10 min條件下，考察乙醇濃度對(duì)花色苷得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)桑葚花色苷得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of anthocyanins of mulberry

由圖3可知，桑葚花色苷得率隨著乙醇濃度的提高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，花色苷得率最高（1.53±0.03）mg/g。可見(jiàn)較高濃度的乙醇溶液有利于花色苷的溶出；當(dāng)乙醇濃度高于70%時(shí)，花色苷得率反而降低。這是由于一方面醇溶性、親脂性等雜質(zhì)的溶出量增大，與花色苷形成競(jìng)爭(zhēng)，使花色苷得率降低；另一方面，較高濃度的乙醇溶液也可能會(huì)使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)變性凝固堵塞組織微孔，阻礙花色苷的溶出[29-30]。

2.2 桑葚花色苷提取條件的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乙醇濃度（A）、提取壓力（B）、液料比（C）3個(gè)因素為自變量，以花色苷得率（Y）為因變量，優(yōu)化超高壓輔助提取桑葚花色苷的提取條件，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 模型和回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test of the fitted model and its regression coefficients

續(xù)表3 模型和回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Continue table 3 Significance test of the fitted model and its regression coefficients

采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到桑葚花色苷得率Y對(duì)各因素二次回歸方程為：Y=0.077A+0.14B+0.026C-0.035AB-0.020AC+0.018BC-0.077A2-0.21B2-0.095C2+1.96。

由表3可知，模型極顯著（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（p=0.116 4＞0.05），模型決定系數(shù) R2=0.997 9，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.994 2。表明模型與試驗(yàn)值擬合性良好，試驗(yàn)誤差較小，試驗(yàn)精密度高，各因素與桑葚花色苷得率之間具有高度相關(guān)性[31]，可以對(duì)桑葚花色苷得率進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和分析。由表3還可知，3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度大小依次為B＞A＞C，因素A、B、C對(duì)桑葚花色苷得率的影響極顯著（p＜0.01），AB、AC、BC 以及 A2、B2、C2對(duì)花色苷得率的影響也顯著（p＜0.05 或 p＜0.01）。

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

各因素間交互作用對(duì)桑葚花色苷得率影響的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖4。

圖 4顯示，乙醇濃度（A）、提取壓力（B）、液料比（C）3個(gè)因素中，任意2個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面都存在最高點(diǎn)，曲面越陡峭則表明因素對(duì)花色苷得率影響越大，反之則較小[32]。兩因素間的響應(yīng)面曲面坡度陡峭，表明其交互作用對(duì)桑葚花色苷得率的影響也較為顯著。這與模型方程的各項(xiàng)方差分析結(jié)果一致。

圖4 因素間交互作用對(duì)桑葚花色苷得率的影響Fig.4 Effect of interaction between factors on the yield of anthocyanins of mulberry

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行優(yōu)化，得到桑葚花色苷最佳提取條件為：乙醇濃度74.19%、提取壓力 429.52 MPa、液料比 12.37 ∶1（mL/g），在此條件下桑葚花色苷得率的預(yù)測(cè)值為1.99 mg/g。為了方便操作，修正提取條件為：乙醇濃度75%、提取壓力430 MPa、液料比12∶1（mL/g），在此條件下驗(yàn)證模型的有效性，并與傳統(tǒng)熱提取法進(jìn)行比較，3次重復(fù)試驗(yàn)表明，傳統(tǒng)熱提取法所得桑葚花色苷得率為（1.37±0.03）mg/g，超高壓輔助提取法所得花色苷實(shí)測(cè)值得率為（1.97±0.02）mg/g，與預(yù)測(cè)理論值接近，說(shuō)明超高壓輔助提取法顯著優(yōu)于傳統(tǒng)熱提取法，所得模型的擬合程度較好，可以較好地預(yù)測(cè)提取條件與桑葚花色苷得率的關(guān)系。

2.3 桑葚花色苷抗氧化活性分析

2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用

桑葚花色苷的DPPH自由基清除率如圖5所示。

不同質(zhì)量濃度的花色苷均具有一定的DPPH自由基清除能力，在0.01 mg/mL～0.10 mg/mL濃度范圍內(nèi)時(shí)，花色苷和VC的DPPH自由基清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，且花色苷的DPPH自由基清除率高于同濃度的VC，當(dāng)花色苷質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)（93.60±2.28）%，高于同濃度VC的DPPH自由基清除率（91.30±1.64）%；桑葚花色苷與VC質(zhì)量濃度高于0.10 mg/mL時(shí)，二者對(duì)DPPH自由基的清除率趨于平緩。另外，VC的IC50為0.055 mg/mL，而桑葚花色苷的IC50為0.026 mg/mL，是VC的0.47倍，表明桑葚花色苷對(duì)DPPH自由基的清除能力優(yōu)于VC。

圖5 桑葚花色苷對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.5 DPPH radical scavenging rates of anthocyanins of mulberry

2.3.2 對(duì)羥自由基的清除作用

桑葚花色苷對(duì)羥自由基的清除能力見(jiàn)圖6。

圖6 桑葚花色苷對(duì)羥自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rates of anthocyanins of mulberry

由圖6可知，桑葚花色苷質(zhì)量濃度對(duì)羥自由基清除能力呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。在0.02 mg/mL～0.2 mg/mL濃度范圍內(nèi)，桑葚花色苷對(duì)羥自由基的清除能力隨著樣品濃度的增大逐漸增強(qiáng)，且強(qiáng)于同濃度的VC；當(dāng)桑葚花色苷與VC的質(zhì)量濃度高于0.2 mg/mL時(shí)，花色苷對(duì)羥自由基的清除能力趨于平緩，而VC對(duì)羥自由基的清除能力繼續(xù)增大，并且高于同濃度的桑葚花色苷。其中，VC的IC50為0.344 mg/mL，桑葚花色苷為0.406 mg/mL，是VC的1.18倍。當(dāng)濃度為0.8 mg/mL時(shí)，桑葚花色苷對(duì)羥自由基的清除能力達(dá)到最大值為（51.12±1.85）%，低于同質(zhì)量濃度VC對(duì)羥自由基的清除能力（63.68±1.12）%。因此，桑葚花色苷對(duì)羥自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

2.3.3 鐵離子還原力

桑葚花色苷對(duì)鐵離子的還原能力見(jiàn)圖7。

圖7 桑葚花色苷對(duì)鐵離子的還原能力Fig.7 Reducing ability to iron ions of anthocyanins of mulberry

由圖7可知，在所設(shè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，桑葚花色苷的還原力隨著質(zhì)量濃度的增大先增強(qiáng)后趨于平緩，且強(qiáng)于同濃度VC溶液的鐵離子還原能力。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，吸光度從0.42±0.024升高到 1.72±0.035，與同質(zhì)量濃度VC溶液的鐵還原力1.48±0.031相比，提高了16.22%，表明桑葚花色苷對(duì)鐵離子的還原能力明顯高于陽(yáng)性對(duì)照VC對(duì)鐵離子的還原能力[33]。

3 結(jié)論

超高壓輔助提取技術(shù)是近年快速發(fā)展的可用于活性物質(zhì)提取的新技術(shù)，與熱提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等相比，能夠有效地避免因熱效應(yīng)引起的活性成分結(jié)構(gòu)變化、損失以及生物活性的降低，也降低了傳統(tǒng)提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致的熱敏性物質(zhì)的損失[34]。本研究以桑葚為原料，采用超高壓輔助法提取桑葚中的花色苷，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面分析法，確定了超高壓輔助提取桑葚花色苷的最佳工藝條件為：提取壓力 430 MPa、液料比 12 ∶1（mL/g）、乙醇濃度75%，在此條件下桑葚花色苷得率為（1.97±0.02）mg/g。各因素對(duì)桑葚花色苷提取效果影響的主次順序?yàn)椋禾崛毫Γ疽掖紳舛龋疽毫媳?；與傳統(tǒng)熱提取法對(duì)比發(fā)現(xiàn)，超高壓輔助提取花色苷得率提高了43.80%，時(shí)間縮短了6倍。體外抗氧化試驗(yàn)表明桑葚花色苷具有較強(qiáng)的抗氧化活性，在一定的濃度范圍內(nèi)，花色苷質(zhì)量濃度與抗氧化活性呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。其中，桑葚花色苷對(duì)DPPH自由基與羥基自由基的IC50分別為0.026、0.406 mg/mL，分別是VC的0.47倍、1.18倍。本研究結(jié)果為天然色素的高效提取提供了一種有效的手段，同時(shí)為開(kāi)發(fā)具有功能活性的食品添加劑提供了理論基礎(chǔ)。