不同劑量納米TiO2對(duì)小鼠腸道微生物的影響

董萌，楊晨，史婷婷，楊柳，劉東青，丘漢青，林影，路福平，趙化冰*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006）

二氧化鈦（TiO2）是鈦元素的一種天然氧化物。這種物質(zhì)在自然界中以3種礦物化合物的形式出現(xiàn)，即銳鈦礦、金紅石和板鈦礦。近年來(lái)，TiO2納米粒子由于其良好的理化性能，在涂料、廢水處理、殺菌、化妝品、食品添加劑、生物醫(yī)用陶瓷和植入生物材料等領(lǐng)域得到了越來(lái)越多的應(yīng)用[1]。在食品行業(yè)中，TiO2作為食品添加劑應(yīng)用于糖果、奶酪、醬料、脫脂牛奶和冰淇淋等產(chǎn)品中。同時(shí)，它也被用作風(fēng)味增強(qiáng)劑應(yīng)用于各種非白色食品，包括干蔬菜、堅(jiān)果、種子、湯、芥末以及啤酒和葡萄酒[2]。此外，TiO2可直接用于與食品接觸的包裝材料，如瓶子、牛奶盒和包裝箔等[3-6]。2012年，Weir等[7]檢測(cè)了89種食品的總TiO2含量，結(jié)果顯示平均鈦含量達(dá)3.59 mg/g。并且研究發(fā)現(xiàn)，糖果、口香糖和蛋糕等甜食類副食品中含有更高劑量的TiO2，其中約1/3顆粒的粒徑屬于納米級(jí)別。1966年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）提出，允許將TiO2作為色素添加劑加入食品中，其含量不應(yīng)超過(guò)食品總重量的1%[8]。我國(guó)對(duì)于食品中TiO2的最大使用量有著嚴(yán)格的規(guī)定：蛋黃醬、沙拉醬不超過(guò)0.5 g/kg，可可制品等不超過(guò)2.0 g/kg[9]。但目前缺乏專門(mén)針對(duì)顆粒形態(tài)和粒徑的限制[10-11]。納米TiO2因其體積小、單位質(zhì)量表面積大、反應(yīng)活性高等特點(diǎn)，不僅能夠通過(guò)食品遷移至人體內(nèi)，還能夠?qū)θ梭w腸道微生態(tài)造成影響，給人類的健康帶來(lái)更大的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

納米TiO2顆粒進(jìn)入體循環(huán)后，會(huì)遷移到各種器官和組織，使人體的腎臟、肺、腦等組織和器官產(chǎn)生病變[12]。納米TiO2的暴露會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺部炎癥反應(yīng)，進(jìn)而增加肺癌的患病幾率[13]。Ze等研究表明，納米TiO2可以在腦內(nèi)移位和積聚，導(dǎo)致氧化應(yīng)激、膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖、組織壞死以及海馬細(xì)胞凋亡[14]。Gui等報(bào)道了納米TiO2在腎臟內(nèi)積累，可引起腎臟炎癥、細(xì)胞壞死和功能障礙[15]。而腸道作為納米TiO2攝入后的停留時(shí)間最久的器官，更易受影響。在上皮細(xì)胞和動(dòng)物身上進(jìn)行的毒性評(píng)估表明，納米TiO2可以在腸道內(nèi)積聚，通過(guò)腸道屏障，氧化應(yīng)激和遺傳毒性誘導(dǎo)毒性，并破壞腸道和全身免疫穩(wěn)態(tài)[16-20]。此外，長(zhǎng)期大量口服含納米TiO2添加劑的食品可能會(huì)增加直腸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[21]。

腸道微生物組已經(jīng)是公認(rèn)的類器官，對(duì)人類健康至關(guān)重要，在特定條件下，微生物失調(diào)可導(dǎo)致多種疾病[22-23]。有研究顯示，納米TiO2可引起腸道菌群失衡，降低雙歧桿菌和乳酸菌兩種典型益生菌的豐度[24]。納米TiO2對(duì)腸道微生物的影響與染毒劑量、粒徑、晶型等因素密切相關(guān)，所以不同的實(shí)驗(yàn)條件可能會(huì)產(chǎn)生相互矛盾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，有必要進(jìn)一步積累相關(guān)研究數(shù)據(jù)，加強(qiáng)對(duì)納米TiO2在食品領(lǐng)域應(yīng)用的安全性及風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。

本研究以C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，利用不同劑量的納米TiO2懸浮液進(jìn)行連續(xù)灌胃染毒實(shí)驗(yàn)，持續(xù)28 d，建立納米TiO2單一亞急性暴露模型，并采用宏基因組學(xué)方法探究其對(duì)C57BL/6小鼠腸道微生物群落的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

銳鈦礦型納米TiO2：Sigma-Aldrich，粒徑小于25nm。實(shí)驗(yàn)選用三周齡C57BL/6小鼠，24只，雌雄各半，體重18 g～22 g。小鼠飼養(yǎng)在聚丙烯籠中，做好標(biāo)識(shí)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在20℃～22℃，相對(duì)濕度50%～70%，小鼠置于12 h/12 h光照與黑暗交替周期循環(huán)的環(huán)境中飼養(yǎng)，并保證環(huán)境的干凈衛(wèi)生。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，小鼠需提前適應(yīng)環(huán)境7 d，所有的相關(guān)操作按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范操作。小鼠被隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組和暴露組，連續(xù)28 d進(jìn)行灌胃。暴露劑量分別為10、100、1 000 mg/（kg·BW）。其中，100 mg/（kg·BW）相當(dāng)于愛(ài)吃甜食的青少年的攝入量[25]。對(duì)照組每天灌胃同等體積的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）。使用 PBS配制納米 TiO2懸浮液，每次灌胃前進(jìn)行超聲破碎，并充分振蕩混勻。在飼養(yǎng)期間，每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食飲水情況及死亡率，每周記錄小鼠的體重。

1.2 儀器與設(shè)備

-80℃超低溫冰箱：美國(guó)Thermo Scientific Forma公司；SCIENTA-950E超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；恒桂牌DT系列電子天平：常熟市佳衡天平儀器有限公司；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科技儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 臟器系數(shù)

實(shí)驗(yàn)建模成功后，眼球取血處死小鼠，皮膚用酒精消毒后，立即打開(kāi)腹腔取其臟器組織，用生理鹽水洗滌兩次，濾紙吸干后稱重，按公式C/%=（m1/m2）×100計(jì)算臟器系數(shù)。

式中：C 為臟器系數(shù)，%；m1為器官濕重，g；m2為小鼠體重，g。臟器組織置于-80℃冰箱保存。

1.3.2 糞便樣品的采集及保存

采樣者佩戴口罩和無(wú)菌手套，每周定期用已滅菌的鑷子收集小鼠新鮮糞便（灌胃后2 h?。?。稱重后，將糞便平均分成兩份，一份直接放置于-80℃冰箱保存。另一份則放在生理鹽水∶甘油（7∶3，體積比）混合液中振蕩混勻（100 mL混合液中約10 g糞便），放置-80℃冰箱中保存。前者適于短期保存，后者適于長(zhǎng)期保存。這樣的方式可以更好的保證糞便中的菌活性。使用QIAampDNA糞便迷你試劑盒，提取細(xì)菌總DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量，采用分光光度計(jì)測(cè)量DNA純度及濃度，保存于-20℃冰箱中備用。

1.3.3 腸道微生物組分析

為了探究納米TiO2不同的染毒劑量對(duì)小鼠腸道微生物群落的影響，對(duì)小鼠腸道微生物進(jìn)行了16S rDNA基因測(cè)序分析。測(cè)序部分由深圳華大股份有限公司執(zhí)行，主要測(cè)序?qū)嶒?yàn)過(guò)程如下：取質(zhì)量合格的小鼠糞便DNA樣品及對(duì)應(yīng)融合引物配置聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。使用Hiseq平臺(tái)對(duì)16S rDNA的V3～V4區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行過(guò)濾，將高質(zhì)量的Clean data用于后期數(shù)據(jù)分析，通過(guò)reads之間的重疊關(guān)系將其拼接成Tags，并聚類成操作分類學(xué)單元（operational taxonomic units，OTU）并與 Greengenes和 R DP 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)和物種注釋?；谏鲜鰷y(cè)序結(jié)果進(jìn)行后續(xù)樣品物種復(fù)雜度分析，組間物種差異分析等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 16.0處理，各組以變異數(shù)ANOVA進(jìn)行比較分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米TiO2對(duì)小鼠體重的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，每周記錄一次小鼠體重。圖1為小鼠連續(xù)28 d暴露于不同染毒劑量組的體重增長(zhǎng)變化圖。

由圖1可以看出，小鼠的體重均有所上漲。其中，雌性小鼠隨著染毒劑量的增加，體重的增加量整體呈下降趨勢(shì)。Chen等對(duì)SD大鼠脂質(zhì)代謝的研究也同樣發(fā)現(xiàn)了這種趨勢(shì)，大鼠暴露于納米TiO2連續(xù)90 d，隨著時(shí)間推移，與對(duì)照組相比，較大劑量組的大鼠體重增加逐漸變緩[26]。但本實(shí)驗(yàn)中，類似的趨勢(shì)在雄性小鼠中并不明顯，考慮可能是由于納米TiO2對(duì)雄性小鼠激素水平造成的影響不如對(duì)雌性小鼠大，或者是小鼠個(gè)體間差異造成的。另外，不排除可能由于攝入納米TiO2而減少了小鼠對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，導(dǎo)致了小鼠體重增長(zhǎng)緩慢。

圖1 小鼠體重增長(zhǎng)變化Fig.1 Changes in weight gain of mice

2.2 納米TiO2對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

臟器指數(shù)是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某臟器的重量與其體重之比。正常時(shí)各臟器與體重的比值比較恒定。動(dòng)物染毒后，受損臟器重量可能會(huì)發(fā)生改變，所以臟器指數(shù)也隨之變化。臟器指數(shù)增大，說(shuō)明臟器充血、水腫或者增生等；臟器指數(shù)減少，說(shuō)明臟器萎縮或者其它病理學(xué)的改變[27]。據(jù)前人的研究報(bào)道，納米TiO2的暴露會(huì)對(duì)脾臟、腎臟等臟器造成損傷[28-29]。臟器指數(shù)見(jiàn)表1。本文研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，各染毒組均對(duì)小鼠心、肝、脾、肺和腎的臟器指數(shù)差異不顯著。這可能是由于暴露方式、劑量不同以及材料本身等差異造成的。雖然本結(jié)果表明口服納米TiO2顆粒28 d還不足以引起明顯可見(jiàn)的器官損傷，但是不排除器官功能的惡化。

表1 臟器指數(shù)Table 1 Viscera indices

2.3 腸道微生物組分析

2.3.1 α多樣性稀釋曲線

α多樣性稀釋曲線是用來(lái)驗(yàn)證數(shù)據(jù)量是否足以反映物種多樣性，間接反映樣品的豐富度程度。當(dāng)曲線趨于平坦時(shí)，說(shuō)明測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中所有的物種；反之則表示樣品中物種多樣性較高，還存在較多未被測(cè)序檢測(cè)到的物種。各樣品的稀釋曲線見(jiàn)圖2。

根據(jù)研究結(jié)果，觀察到香農(nóng)指數(shù)（圖2a）和辛普森指數(shù)（圖2b）稀釋曲線隨著序列的增多趨于平緩，表明數(shù)據(jù)量基本覆蓋了腸道樣本中所有群落物種。

圖2 各樣品的稀釋曲線Fig.2 Dilution curves of each sample

2.3.2 OTU聚類及分析

根據(jù)16s rDNA基因測(cè)序結(jié)果，共獲得1 535 340條序列。其中檢測(cè)到對(duì)照組（Ti.0）序列383 573條，10 mg/（kg·BW）染毒組（Ti.10）序列382 469 條，100 mg/（kg·BW）染毒組（Ti.100）序列383 898條，1000 mg/（kg·BW）染毒組（Ti.1000）序列385 400條。利用操作分類學(xué)單元（operational taxonomic units，OTU）根據(jù)rRNA序列相似性對(duì)微生物多樣性進(jìn)行菌株分類。圖3為OTU的比較結(jié)果。

圖3 OTU的比較Fig.3 Comparison of OTU

圖中不同顏色圖形代表不同組別，兩兩交疊部分?jǐn)?shù)字為兩組之間共有的OTU個(gè)數(shù)，多重交疊部分?jǐn)?shù)字為多個(gè)組別之間共有的OTU個(gè)數(shù)。共獲得1 914個(gè)OTU，其中對(duì)照組482個(gè)OTU，10 mg/（kg·BW）染毒劑量組496個(gè)OTU，100 mg/（kg·BW）染毒劑量組453個(gè)OTU，1 000 mg/（kg·BW）染毒劑量組483個(gè)OTU。

2.3.3 α多樣性盒形圖

人和動(dòng)物腸道內(nèi)定植著龐大的微生物群體，這些微生物在代謝膳食營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育、抵抗病原微生物入侵等方面發(fā)揮重要作用[30]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，許多的腸道疾病可能與腸道微生物多樣性或者豐度的變化有關(guān)。α多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析，包括香農(nóng)指數(shù)、辛普森指數(shù)等。其中，香農(nóng)指數(shù)來(lái)源于信息熵，指數(shù)越大，表明不確定性越大，不確定性越大，則表明群落未知因素越大也就是多樣性高。辛普森指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低。α多樣性盒形圖見(jiàn)圖4。

圖4 α多樣性盒形圖Fig.4 α diversity box diagram

比較群落的物種多樣性后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，10、100、1 000 mg/（kg·BW）的染毒劑量組的香農(nóng)指數(shù)升高（圖4a），辛普森指數(shù)降低（圖4b），這表明攝入不同劑量的納米TiO2均有可能導(dǎo)致動(dòng)物腸道微生物群落物種多樣性的增加。并且隨著納米TiO2攝入劑量的增加，物種的多樣性也隨之增加。這與Li等[31]的研究結(jié)果相似。

2.3.4 納米TiO2對(duì)小鼠腸道微生物菌落組成的影響

為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。各樣品的物種豐度柱狀圖見(jiàn)圖5。通過(guò)物種柱狀圖直觀地展示了由門(mén)到種各樣本物種組成及比例，反映了樣本間物種的變化情況。比較了微生物組在門(mén)和屬水平上的組成。

基于門(mén)水平上的微生物菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)主要菌門(mén)，分別是擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）。與對(duì)照組相比，隨著納米TiO2染毒劑量的增加，疣微菌門(mén)和變形菌門(mén)的相對(duì)豐度減少，厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度增加。此前有研究表明，小鼠腸道菌群失調(diào)，腸道內(nèi)變形菌門(mén)數(shù)量會(huì)減少，厚壁菌門(mén)數(shù)量會(huì)增加[32]。并且，變形菌門(mén)的增加是腸道損傷和腸道功能障礙的常見(jiàn)現(xiàn)象[33]。

圖5 各樣品的物種豐度柱狀圖Fig.5 Histogram of species abundance of samples

此外，部分小鼠攝入納米TiO2后，腸道菌群中出現(xiàn)TM7細(xì)菌（圖5a）。有研究表明，TM7細(xì)菌在人類結(jié)腸中存在，可能在具有環(huán)境影響的炎癥性胃腸疾病中扮演炎癥促進(jìn)因子的角色[34]。

基于屬水平上的微生物菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，暴露組的小鼠腸道中出現(xiàn)了微生物群落的共同適應(yīng)，包括梭菌屬（Clostridium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、薩特氏菌屬（Sutterella）和阿爾曼菌屬（Akkermansia）的相對(duì)豐度減少，普雷沃氏菌（Prevotella）的相對(duì)豐度增加（圖5b）。其中，普雷沃氏菌可在某些葡萄糖代謝中發(fā)揮作用，促進(jìn)糖原的儲(chǔ)存，從而導(dǎo)致血糖增加[35]。阿爾曼菌是從人糞便樣品中分離出的一種細(xì)菌，也是目前唯一可培養(yǎng)的疣微菌門(mén)腸道微生物。有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在人類許多疾病中（如炎癥性腸病、孤獨(dú)癥、肥胖等）阿克曼菌豐度均減少[36-38]。

綜上所述，研究結(jié)果支持了以下觀點(diǎn)：攝入納米TiO2可能會(huì)改變腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，且隨著納米TiO2染毒劑量的增加，對(duì)小鼠腸道產(chǎn)生了一定的消極影響。

2.3.5 小鼠腸道微生物菌群物種差異分析

為了確定微生物標(biāo)志物，通過(guò)LEfSe分析（LDA>2）檢測(cè)到由門(mén)到種共17種細(xì)菌顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在分支進(jìn)化圖中，由內(nèi)至外每一圈代表一個(gè)層級(jí)，依次為門(mén)、綱、目、科、屬水平。小圓圈直徑和相對(duì)豐度大小成正比。LEfSe分析聚類圖見(jiàn)圖6。

如圖6所示，對(duì)照組、Ti.10組、Ti.100組和Ti.1000組之間有17個(gè)顯著差異的生物類群。其中4個(gè)菌在對(duì)照組富集，包括Bifidobacterium（雙歧桿菌屬）、Bifidobacteriaceae（雙歧桿菌科）、Bifidobacteriales（雙歧桿菌目）、Actinobacteria（放線菌）；5個(gè)菌在Ti.10組富集，包括Bacteroidales（擬桿菌屬）、Bacteroidia（擬桿菌目）、Bacteroidetes（擬桿菌門(mén)）、Coprococcus（糞球菌屬）、Desulfovibrio（脫硫弧菌屬）；4個(gè)菌在Ti.100組富集，包括 Prevotellaceae（普雷沃氏菌科）、Prevotella（普氏菌屬）、Enterococcaceae（腸球菌科）、Enterococcus（腸球菌屬）；4個(gè)菌在Ti.1000組富集，包括Helicobacteraceae（螺桿菌科）、Flexispira（螺桿菌屬）、Campylobac terales（彎曲菌目）、Epsilonproteobacteria（ε-變形細(xì)菌）。由此可以看出，隨染毒劑量的變化，所富集的具有代表性的微生物各不相同。

圖6 LEfSe分析聚類圖Fig.6 LEfSe analysis cluster diagram

在對(duì)照組中腸道有益菌雙歧桿菌（Bifidobacterium）起重要作用。在Ti.100組中，普雷沃氏菌（Prevotellaceae）富集。普雷沃氏菌通常與慢性炎癥相關(guān)，在炎癥性腸病患者糞便中相對(duì)豐度較高[39-40]。而幽門(mén)螺旋桿菌（Helicobacter pylori）在Ti.1000組影響較大。幽門(mén)螺旋桿菌是慢性幽門(mén)螺旋桿菌胃炎、消化性潰瘍等疾病的致病因素之一。上述結(jié)果表明了納米TiO2可能會(huì)誘發(fā)小鼠胃腸道炎癥，增加小鼠患病風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

食品添加劑的不當(dāng)使用會(huì)給人體健康帶來(lái)很多潛在的危害。納米TiO2作為常見(jiàn)的食品添加劑，對(duì)人體的影響不容忽視。TiO2納米顆粒在奶酪、糖果和布丁等食物中的廣泛存在極大地增加了它們的攝取和積累，特別是在年輕人中。腸道作為人體吸收食物營(yíng)養(yǎng)的第一道關(guān)卡，易受外源性物質(zhì)的影響。納米TiO2對(duì)腸道微生物的影響十分復(fù)雜，其毒理機(jī)制也尚不清楚。因此，研究納米TiO2對(duì)小鼠腸道微生物的影響，不僅是重要的科學(xué)問(wèn)題，也是食品行業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)和重要保障。

本文針對(duì)不同劑量的納米TiO2對(duì)小鼠進(jìn)行單一亞急性暴露染毒實(shí)驗(yàn)，闡述了納米TiO2對(duì)腸道微生態(tài)的潛在影響?？诜侨祟惤佑|日常環(huán)境中存在的納米顆粒的主要途徑，所以選定的給藥方式是口服灌胃給藥。對(duì)于染毒劑量，選擇了相當(dāng)于喜歡糖果和巧克力的兒童的攝入量。研究結(jié)果表明，納米TiO2增加了小鼠腸道微生物群落的多樣性。且隨著染毒劑量的增加，小鼠腸道微生物群落組成也隨之變化，主要表現(xiàn)為厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度增加，雙歧桿菌屬和擬桿菌屬相對(duì)豐度減少。在100 mg/kg·BW和1 000 mg/kg·BW的暴露組中，普雷沃氏菌和幽門(mén)螺旋桿菌的相對(duì)豐度顯著增加。結(jié)果表明納米TiO2顆粒會(huì)改變?nèi)梭w腸道微生物區(qū)系，并可能會(huì)增加胃腸道疾病的患病幾率。

本研究結(jié)果顯示納米TiO2會(huì)對(duì)腸道菌群相對(duì)豐度產(chǎn)生不同程度的影響，這為T(mén)iO2納米顆粒的進(jìn)一步的安全應(yīng)用提供了參考依據(jù)。然而，對(duì)于慢性攝入納米TiO2的累積效應(yīng)以及高濃度納米TiO2對(duì)腸道微生態(tài)的影響尚不明確。并且，市面上納米材料種類繁多，暴露的途徑、時(shí)間等不確定性都給人類健康帶來(lái)威脅。因此，對(duì)有關(guān)含有納米材料生物安全性再評(píng)價(jià)的研究工作刻不容緩。