抗炎合劑通過TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的過表達高遷移率蛋白-1轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞炎癥反應(yīng)的機制研究※

閆國良 李淑芳 王馨璐 孫 雪 汪?；?/p>

(上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院急診科，上海 200070)

膿毒癥是臨床較為常見的急危重癥疾病。流行病學調(diào)查顯示，全世界膿毒癥患者超過3 000萬，嚴重膿毒癥患者超過2 000萬[1]，是ICU中首位死亡原因，其中膿毒性休克的死亡率超過40%[2]。膿毒癥進展過程復(fù)雜，不僅與全身炎癥反應(yīng)有關(guān)，也與代償性抗炎反應(yīng)綜合征以及兩者失衡導(dǎo)致的免疫功能紊亂有關(guān)，尤其是膿毒癥出現(xiàn)器官功能障礙者，更與機體免疫功能紊亂密切相關(guān)[3]。高遷移率蛋白-1(HMGB1)為體內(nèi)非常重要的晚期炎癥因子，還與機體免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，其主要功能是介導(dǎo)晚期炎癥反應(yīng)和參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答，與膿毒癥、膿毒性休克進展、預(yù)后都關(guān)系密切，其干預(yù)的時間窗相對更長[4-5]，近年來成為膿毒癥治療的新熱點。Toll樣受體4(TLR4)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是膿毒癥炎癥激活及促炎反應(yīng)的重要路徑。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥時各器官存在TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑異常高表達，TLR4與HMGB1結(jié)合后可通過髓樣分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)或p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑促使核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)活化，進而調(diào)控各種炎癥介質(zhì)釋放，參與膿毒癥炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。因此，HMGB1是治療膿毒癥的關(guān)鍵靶點之一。

膿毒癥屬中醫(yī)學“熱病”“溫毒”范疇，基本病機為毒熱互結(jié)，脈絡(luò)瘀阻。本課題組多年來從事膿毒癥的臨床及基礎(chǔ)研究工作，研制開發(fā)了抗炎合劑。臨床研究表明，抗炎合劑治療膿毒癥療效確切，能抑制患者炎癥反應(yīng)，減輕肺損傷[6-7]。動物實驗研究提示，抗炎合劑可能通過抑制膿毒癥大鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，減少炎癥介質(zhì)釋放，從而減輕膿毒癥大鼠急性肺損傷[8-9]。為了進一步明確抗炎合劑干預(yù)膿毒癥的分子機制，本研究選取小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞，并通過慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定的過表達HMGB1和沉默HMGB1(HMGB1 RNAi)的RAW264.7細胞，觀察HMGB1與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的關(guān)系，進一步探討抗炎合劑對TLR4/MyD88/NF-κB信號通路干預(yù)的作用，從而為膿毒癥的治療、抗炎合劑的臨床應(yīng)用和藥理研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠10只，6～7月齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK(滬)2017-0005，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院實驗動物中心，溫度22～25 ℃，濕度40%～60%，自由飲水和進食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，體質(zhì)量200～230 g。

1.1.2 藥物與試劑 抗炎合劑(藥物組成：生大黃9 g，黃芩20 g，黃連6 g，厚樸12 g，敗醬草30 g)，所有藥物均為符合2010版《中華人民共和國藥典》規(guī)定并加工炮制合格的飲片，由上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，并由制劑中心制備成藥物濃度為1.0 g/mL的湯劑，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0%胎牛血清，購自德國PAN-Biotech公司；Dulbecco's改良培養(yǎng)基(DMEM)、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶消化液、脂多糖(LPS)、二甲基亞砜(DMSO)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、IL-10酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法試劑盒，購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；引物探針由華大基因合成；總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒，購自上海紐思格生物科技公司。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(型號V-5060)，德國Heraeus公司；多功能酶標儀(型號ELX800)，美國BioTek公司；低溫冷凍離心機(型號1-15K3K15)，美國Sigma公司；實時熒光定量PCR儀(型號StepOnePlusTMReal-Time PCR system)，英國Thermo Fisher Scientific公司；倒置電子顯微鏡(型號：萊卡DMI8)，德國萊卡顯微系統(tǒng)上海有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清制備 取10只SD雄性大鼠，予抗炎合劑9.9 g/kg(1.0 mL/100 g)灌胃，每日2次，連續(xù)7 d。末次灌胃給藥后2 h(灌胃前12 h禁食不禁水)以10%水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉，開腹后腹主動脈采血2 mL，4 ℃靜置1 h后3 000 r/min離心15 min，分離血清，0.22 μm微孔濾膜過濾，56 ℃水浴滅活，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。待細胞融合達80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每周傳代或換液3～4次，第3傳代用于實驗。

1.2.3 通過慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定的過表達HMGB1和HMGB1 RNAi的RAW264.7細胞株 將傳代后的RAW264.7細胞接種于6個小皿中，每個小皿中接種5×104個細胞，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。其中3個小皿中的RAW264.7細胞用10 μL過表達HMGB1慢病毒載體轉(zhuǎn)染，另外3個小皿中的RAW264.7細胞用10 μL HMGB1 RNAi慢病毒載體轉(zhuǎn)染，均轉(zhuǎn)染24 h后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基。48 h后加入含1 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，待細胞穩(wěn)定生長后，對細胞進行篩選，反復(fù)篩選3次，通過熒光顯微鏡觀察細胞的轉(zhuǎn)染情況，最終形成過表達HMGB1和HMGB1 RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞穩(wěn)定株(上述慢病毒載體由上海吉凱基因科技有限公司提供)。

1.3 分組與干預(yù) 以培養(yǎng)后的巨噬細胞系RAW264.7細胞為研究對象，取對數(shù)生長的細胞，按1×105個/mL濃度接種于12孔板中，每孔加1 mL細胞懸液，分為3組，每組設(shè)3個復(fù)孔。①空白對照組：用DMEM(900 μL)和10%胎牛血清(100 μL)處理RAW264.7細胞4 h。②LPS組：用DMEM(900 μL)+10%胎牛血清(100 μL)+終濃度為100 ng/mL的LPS處理RAW264.7細胞4 h。③LPS+中藥血清組：含有10%胎牛血清的DMEM 975 μL+中藥血清25 μL預(yù)處理RAW264.7細胞24 h，再加終濃度100 ng/mL的LPS處理4 h。

以過表達HMGB1慢病毒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞穩(wěn)定株為研究對象，取對數(shù)生長的細胞，按照1×105個/mL濃度接種于6孔板中，每孔加1 mL細胞懸液,分為2組，每組設(shè)3個復(fù)孔。①LPS+HMGB1組：用DMEM(900 μL)+10%胎牛血清(100 μL)+終濃度為100 ng/mL的LPS處理過表達HMGB1慢病毒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞穩(wěn)定株4 h。②LPS+HMGB1+中藥血清組：含有10%胎牛血清的DMEM 975 μL+中藥血清25 μL預(yù)處理過表達HMGB1慢病毒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞穩(wěn)定株24 h，再加入終濃度為100 ng/mL的LPS處理4 h。

以HMGB1 RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞穩(wěn)定株為研究對象，取對數(shù)生長的細胞，按1×105個/mL濃度接種于6孔板中，每孔加1 mL細胞懸液，分為2組，每組設(shè)3個復(fù)孔。①LPS+HMGB1 RNAi組：用DMEM(900 μL)+10%胎牛血清(100 μL)+終濃度為100 ng/mL的LPS處理HMGB1 RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞穩(wěn)定株4 h。②LPS+HMGB1 RNAi +中藥血清組：含有10%胎牛血清的DMEM 975 μL+中藥血清25 μL預(yù)處理HMGB1 RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞穩(wěn)定株24 h，再加入終濃度為100 ng/mL的LPS處理4 h。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 細胞形態(tài)學觀察 干預(yù)前對RAW 264.7細胞、過表達HMGB1慢病毒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞及HMGB1 RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞于倒置電子顯微鏡下(20×)進行形態(tài)學觀察。然后按照1.3項分組處理方案對上述3種細胞進行相應(yīng)的干預(yù)處理，將細胞置于倒置電子顯微鏡下(20×)拍照記錄，進行細胞形態(tài)學觀察。

經(jīng)以上分析，選用西門子S7-200PLC系列中的緊湊型單元CPU 224XP CN和一個擴展模塊EM232，分別型號為6ES7 214-2BD23-0XB8和6ES7 232-0HB22-0XA8。

1.4.2 ELISA檢測TNF-α、IL-6、IL-10水平 1.3項各組細胞經(jīng)過相應(yīng)的處理后24 h，收集細胞上清，按ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-6、IL-10水平。

1.4.3 實時熒光定量PCR檢測TRL4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表達 按照1.3項方案處理各組細胞后，終止培養(yǎng)，離心收集各組細胞，加入Trizol試劑提取總RNA，測定并調(diào)整各組細胞樣本RNA濃度后，加入5×PrimeScript及重蒸水，逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，進行熒光定量PCR擴增，檢測各組細胞中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA的表達水平。引物由上海吉凱基因科技有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 min，循環(huán)1次；95 ℃變性5 s，60 ℃變性30 s，循環(huán)40次；95 ℃變性15 s，循環(huán)1次；50 ℃退火30 s，循環(huán)1次；95 ℃延伸15 s，循環(huán)1次。以2-△△Ct法計算各目的基因的相對表達量。

表1 各目的基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 各組細胞形態(tài)學觀察結(jié)果 干預(yù)前鏡下可見，RAW264.7細胞、過表達HMGB1慢病毒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞和HMGB1 RNAi慢病毒轉(zhuǎn)染的RAW264.7細胞均呈圓形或橢圓形，有偽足，增殖狀態(tài)無明顯區(qū)別(見封3，圖1)。干預(yù)后鏡下可見，各不同干預(yù)組之間細胞增殖狀態(tài)無明顯區(qū)別，而細胞分化區(qū)別較為明顯，空白對照組細胞無分化，LPS組、LPS+HMGB1組細胞分化程度較高，LPS+中藥血清組、LPS+HMGB1 RNAi組、LPS+ HMGB1+中藥血清組、LPS+HMGB1 RNAi+中藥血清組細胞分化程度略低(見封3，圖2)。

2.2 各組細胞上清IL-6、IL-10、TNF-α水平比較 見表2。

由表2可見，與空白對照組比較，LPS組、LPS+HMGB1組、LPS+HMGB1+中藥血清組IL-6、IL-10、TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)。與LPS組比較，LPS+HMGB1組IL-6、TNF-α、IL-10水平均升高(P<0.05)；LPS+HMGB1 RNAi組IL-6、IL-10、TNF-α水平均降低(P<0.05)；LPS+中藥血清組IL-6、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，IL-10水平明顯升高(P<0.05)。與LPS+HMGB1組比較，LPS+HMGB1+中藥血清組IL-6、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，IL-10水平明顯升高(P<0.05)。與LPS+HMGB1 RNAi組比較，LPS+HMGB1 RNAi+中藥血清組中IL-6、TNF-α水平明顯降低(P<0.05)，IL-10水平明顯升高(P<0.05)。

表2 各組細胞上清IL-6、IL-10、TNF-α水平比較

2.3 各組細胞中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表達量比較 見表3。

表3 各組細胞中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表達量比較

由表3可見，與空白對照組比較，LPS組、LPS+HMGB1組、LPS+HMGB1+中藥血清組中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表達量均明顯升高(P<0.05)。與LPS組比較，LPS+HMGB1組TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表達量均升高(P<0.05)，LPS+HMGB1 RNAi組、LPS+中藥血清組均降低(P<0.05)。與LPS+HMGB1組比較，LPS+HMGB1+中藥血清組中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表達量均明顯降低(P<0.05)。與LPS+HMGB1 RNAi組比較，LPS+HMGB1 RNAi+中藥血清組中TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表達量均明顯降低(P<0.05)。

3 討 論

膿毒癥病情發(fā)展迅速，病死率居高不下，屬中醫(yī)學“傷寒溫病”“外感熱病”“厥證”“脫證”“溫毒”等范疇，發(fā)病機制可概述為“虛、毒、瘀”[10]，病因包括內(nèi)因(正氣虛弱，抗邪無力)和外因(外感六淫、疫戾之氣)，基本病機是正虛毒損，脈絡(luò)瘀滯。膿毒癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素主要有3條：其一是正氣不足；其二是毒邪(痰濁、瘀血、熱毒)內(nèi)蘊；其三是氣血運行不暢，瘀阻脈絡(luò)，臟腑功能障礙[11-12]?？寡缀蟿┛嗪⒂?，清熱利濕，通腑活血，排毒泄?jié)?，主治熱毒互結(jié)的膿毒癥。方中生大黃瀉下攻積，清熱瀉火，活血祛瘀，利濕退黃，涼血解毒，為君藥。黃芩、黃連清熱燥濕，瀉火解毒，清上焦、中焦熱，為臣藥。厚樸行氣消積，燥濕平喘；敗醬草清熱解毒，消癰排膿，祛瘀止痛，為佐藥。

近年來，越來越多的研究認識到內(nèi)源性物質(zhì)警報素在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中有重要作用。HMGB1為警報素的代表性物質(zhì)[13]，其在真核生物細胞中可與細胞DNA結(jié)合，全程參與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程[14]。有研究表明，HMGB1是膿毒癥發(fā)揮致死效應(yīng)的關(guān)鍵促炎因子，既可主動分泌，也可被動分泌[15]。主動分泌是由受感染的免疫細胞或受損傷的免疫細胞分泌，被動分泌是由壞死的細胞分泌。HMGB1在人體所有細胞中均有表達，其中肝臟和大腦細胞的細胞質(zhì)中表達比較集中，而其他組織細胞的細胞核中富集HMGB1。HMGB1的作用主要包括：①介導(dǎo)早期炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝臟缺血—再灌注模型中，HMGB1通過介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與了肝損傷過程。大鼠肝臟再灌注2 h后，HMGB1蛋白表達隨時間呈上升趨勢，在24 h時達到峰值[16]。②介導(dǎo)晚期炎癥反應(yīng)。在炎癥、組織損傷、肺損傷中，細胞外早期炎癥因子如TNF-α、IL-1b、IL-6等早于HMGB1表達。48 h后對注射過LPS的小鼠進行檢測，發(fā)現(xiàn)其血清中仍存在高水平的HMGB1[17]。③參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。HMGB1有2種啟動方式，一種是激活樹突細胞，促進適應(yīng)性免疫應(yīng)答；另外一種是直接與T淋巴細胞、B細胞結(jié)合，參與相關(guān)免疫反應(yīng)。釋放到細胞外的HMGB1主要識別并結(jié)合的受體為晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)和TLRs等受體[18]，啟動相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中TLR4被認為是HMGB1主要的結(jié)合受體[19]。研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中，各個器官中都存在TLR4調(diào)控的信號通路高表達[20]。TLR4與HMGB1結(jié)合后，可能通過MyD88，也有可能是通過p38MAPK途徑以促使NF-κB激活，進而促進各種炎癥介質(zhì)激活和釋放，所以說HMGB1參與了膿毒癥炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，進一步影響各器官功能，是膿毒癥發(fā)病的重要因子[21]。

MyD88是TLRs信號通路的關(guān)鍵接頭蛋白，TLR4調(diào)控的LPS信號通路主要通過MyD88依賴性和非依賴性2個途徑來激活下游信號。LPS通過與髓樣分化蛋白-2(MD-2)識別而與TLR結(jié)合，使得TLR4二聚體化，即被激活，形成LPS/TLR4/MD-2復(fù)合物，參與并介導(dǎo)炎癥細胞因子的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，復(fù)合物與MyD88結(jié)構(gòu)中的TIR區(qū)域結(jié)合，繼而腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF-6)被激活，活化后的TRAF-6抑制IκB激酶(IκB Kinase，IKK)，使其與NF-κB解離，從而激活NF-κB?；罨蟮腘F-κB進一步促進IL-1、TNF-α等炎癥因子表達，最終導(dǎo)致炎癥因子的瀑布樣釋放[22]。伴隨促炎因子的增加，抗炎因子分泌也增加，機體表現(xiàn)為免疫紊亂狀態(tài)。IL-10是主要的抗炎因子和免疫抑制因子，主要由巨噬細胞和輔助性T細胞2(Th2)合成，能夠抑制炎癥細胞增殖[23]。

本研究中，與空白對照組比較，LPS組IL-6、IL-10、TNF-α水平和TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA表達量均明顯升高(P<0.05)，說明濃度為100 ng/mL的LPS可以刺激RAW264.7細胞構(gòu)建細胞膿毒癥的模型，也說明膿毒癥發(fā)生時，TLR4可以通過識別LPS，并通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使促炎因子釋放。與LPS組比較，LPS+HMGB1組中IL-6、IL-10、TNF-α水平及TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA的表達量升高(P<0.05)，提示當LPS誘導(dǎo)過表達HMGB1慢病毒轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞株發(fā)生炎癥反應(yīng)時，信號通路TLR4/MyD88/NF-κB參與了免疫應(yīng)答，炎癥反應(yīng)增強。而干擾HMGB1后的LPS+HMGB1 RNAi組IL-6、IL-10、TNF-α水平及TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA的表達量降低(P<0.05)，證明HMGB1是啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)。而LPS+中藥血清組與LPS組比較、LPS+HMGB1+中藥血清組與LPS+HMGB1組比較、LPS+HMGB1 RNAi+中藥血清組與LPS+HMGB1 RNAi組比較分別顯示，IL-6、TNF-α水平及TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB mRNA的表達量均明顯降低(P<0.05)，IL-10水平明顯升高(P<0.05)。說明抗炎合劑可能通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制TLR4使MyD88和NF-κB的表達減少，減少促炎因子IL-6、TNF-α釋放，促進抗炎因子IL-10合成，從而減輕炎癥反應(yīng)。

綜上可見，膿毒癥時HMGB1能夠促進TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活化，加速炎癥反應(yīng)的發(fā)生，抗炎合劑能夠抑制該信號通路減輕膿毒癥的炎癥反應(yīng)，但此作用并不是通過抑制HMGB1取得的，其機制還待以后進一步研究。