解毒消癌方對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Δ

高 爽

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院神經(jīng)外科，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦膠質(zhì)瘤是惡性程度最高的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難以完全切除，臨床一般采取手術(shù)、放療和化療等多種治療手段聯(lián)合干預(yù)，但死亡率仍高達(dá)98%，中位生存期<15個(gè)月，5年生存率<5%[1-2]。腦膠質(zhì)瘤的整體治療缺乏突破性進(jìn)展，尋找有效治療方法仍是臨床研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)藥具有悠久的歷史，目前關(guān)于中藥治療惡性腫瘤的研究也越來(lái)越多，得到了廣泛的關(guān)注。中藥成分復(fù)雜，尤其是中藥組方，能夠從多途徑、多靶點(diǎn)和多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤效果，在惡性腫瘤的治療中具有巨大的潛力和優(yōu)勢(shì)。國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授根據(jù)“癌毒理論”創(chuàng)立了解毒消癌方，其在多種惡性腫瘤的治療中顯現(xiàn)出了確切的療效。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一[3]。本研究就解毒消癌方對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲、遷移及EMT的影響展開(kāi)研究，以期為解毒消癌方在臨床治療中的應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。BALB/c Nude裸鼠，SPF級(jí)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0011。

1.2 藥品

解毒消癌方：白花蛇舌草(20 g)，山慈菇(6 g)，八月札(15 g)，僵蠶(10 g)，蜈蚣(3 g)，太子參(12 g)，麥冬(6 g)；由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國(guó)藥典：一部》(2015年版)的要求。生藥經(jīng)10倍量的雙蒸水浸泡60 min，加熱煎煮1 h(微沸狀態(tài)開(kāi)始計(jì)時(shí))后濾出藥液，加水重復(fù)煎煮1 h，將2次濾出的藥液混勻，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 000 ml時(shí)改用電磁爐加熱，至玻璃棒挑起時(shí)呈面狀滴下；放入真空干燥箱過(guò)夜，粉碎密封保存。按實(shí)驗(yàn)要求配制成各濃度溶液。

1.3 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；胰酶-EDTA購(gòu)自美國(guó)CHI Scientific公司；PBS緩沖液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；絲裂霉素C購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司；多聚甲醛購(gòu)自美國(guó)EMS公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；RIPA蛋白裂解液、瓊脂糖和DAB測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海一基實(shí)業(yè)有限公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abacm公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)自美國(guó)EZBiolab公司；PVDF膜、TGF-β、ZEB-1、snail和MMP-9抗體購(gòu)自美國(guó)millipore公司；一抗二抗去除液購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；ECL發(fā)光液購(gòu)自上海炎熙生物科技有限公司。

1.4 儀器

2406-2型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)shellab公司)；CHJH-C2109B型超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)；DYCZ-25D型蛋白電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；Fluor Chem FC2型電泳凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha Innotech公司)；CP100WX/CR22N型超速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司)；Transferpette型微量移液器(德國(guó)Brand公司)；SH 100型水平搖床(上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司)；IX73型熒光倒置顯微鏡(日本Olymplus公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞處理

將含有1 ml細(xì)胞懸液的凍存管在37 ℃水浴鍋中快速解凍，加入4 ml培養(yǎng)基混合均勻；加入離心管中以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心分離5 min，棄置上清液，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基并吹勻，標(biāo)記細(xì)胞種類和復(fù)蘇日期。接種于6孔培養(yǎng)板，于5%CO2、95%空氣，37 ℃，相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞狀態(tài)并繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到85%左右時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，棄置培養(yǎng)上清，以PBS緩沖液(不含鈣、鎂離子)清洗2次；加入0.25%胰酶1 ml，消化1～2 min；顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓并脫落時(shí)，加入少量完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。適量補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，以1 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心分離5 min，棄置上清液，再次補(bǔ)加培養(yǎng)基并吹勻，按1∶2的比例進(jìn)行傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)凍存，-80 ℃冰箱保存24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。

2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期細(xì)胞，加入胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，以每孔1×105個(gè)的密度接種于6孔板中。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組并更換培養(yǎng)液，分為空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組(分別加入0、25、50及100μg/ml解毒消癌方水提物)，每孔200 μl，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞覆蓋達(dá)到90%時(shí)，采用200 μl無(wú)菌槍頭垂直于孔板底部劃平行直線；以PBS清洗2次，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。正常條件下繼續(xù)培養(yǎng)，12、24及48 h后采用顯微鏡(100×)觀察并拍照，計(jì)算各組遷移距離。

2.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

將凍存的Matrigel基質(zhì)膠置于冰箱4 ℃過(guò)夜，變成液態(tài)后使用無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶3的比例稀釋，上室加入50 μl，37 ℃條件下于培養(yǎng)箱中放置2 h；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期細(xì)胞消化后，加入胰酶消化，計(jì)數(shù)，制成單細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸浮于含有0、25、50及100 μg/ml解毒消癌方水提物的無(wú)血清培養(yǎng)基(即為空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組)，以1×104個(gè)/孔的密度接種于上室；下室加入含20%胎牛血清培養(yǎng)基500 μl；培養(yǎng)24 h后取出小室，以PBS清洗2次，擦去上層基質(zhì)膠和細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，Giemsa染色；洗取染色液后于倒置顯微鏡(200×)下觀察侵襲至微孔膜下層的細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔均隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值作為該組侵襲細(xì)胞數(shù)。

2.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SHG44細(xì)胞注射入裸鼠背部，共20只，每只裸鼠注射的細(xì)胞保持在5×106個(gè)，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，當(dāng)腫瘤體積(1/2長(zhǎng)×寬2)[4]達(dá)到150 mm3時(shí)，將其隨機(jī)分為空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組及高劑量組4組，每組5只，分別給予0、25、50及100 μg/ml解毒消癌方喂養(yǎng)；每5 d測(cè)量1次腫瘤大小，5周后處死，取出腫瘤，消化腫瘤組織，按照蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)蛋白分子表達(dá)情況。

2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白

處理好的細(xì)胞棄上清液，以PBS清洗2次，加入細(xì)胞裂解液，使用移液器吸取混合液至EP管，冰上裂解30 min；離心機(jī)預(yù)冷至4 ℃，將混合液以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心分離10 min；按BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度。每孔40 μg蛋白，加入上樣緩沖液，2%瓊脂糖凝膠，10%SDS-PAGE電泳；80 V恒壓跑濃縮膠，蛋白跑至分離膠時(shí)調(diào)高電壓至120 V，蛋白跑至膠底端時(shí)停止電泳；裁剪PVDF膜，以甲醇浸泡后放入轉(zhuǎn)膜液中清洗，恒流300 mA轉(zhuǎn)膜90 min；完成轉(zhuǎn)膜后取出PVDF膜轉(zhuǎn)移至5%BSA封閉液中，以室溫?fù)u床慢搖1 h；加入TGF-β、ZEB-1、snail、MMP-9和GADPH抗體，4 ℃過(guò)夜；以TBST溶液清洗條帶3次，1次10 min；加入二抗，孵育1 h;再次以TBST溶液清洗3次，1次10 min；將ECL發(fā)光液(A液、B液體積比=1∶1)均勻沾到膜上后放入凝膠呈現(xiàn)系統(tǒng)中顯影拍照，收集分析數(shù)據(jù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 解毒消癌方對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞經(jīng)解毒消癌方處理后，低、中及高劑量組細(xì)胞遷移距離明顯短于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)胞遷移能力受到明顯抑制；中劑量組相對(duì)低劑量組遷移能力抑制更明顯，高劑量組遷移能力相對(duì)中劑量組遷移能力抑制更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；解毒消癌方對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的抑制呈時(shí)間和濃度依賴性，時(shí)間越長(zhǎng)、濃度越高，細(xì)胞遷移能力越弱，見(jiàn)表1、圖1。

表1 四組細(xì)胞遷移距離比較Tab 1 Comparison of cell migration distance among four groups

圖1 四組細(xì)胞遷移距離比較Fig 1 Comparison of cell migration distance among four groups

3.2 解毒消癌方對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞經(jīng)解毒消癌方處理后，低、中及高劑量組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，細(xì)胞侵襲能力受到明顯抑制；中劑量組相對(duì)低劑量組侵襲能力抑制更明顯，高劑量組侵襲能力相對(duì)中劑量組遷移能力抑制更明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且解毒消癌方對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲能力的抑制呈濃度依賴性，濃度越高，細(xì)胞侵襲能力越弱，見(jiàn)表2、圖2。

表2 四組侵襲細(xì)胞數(shù)比較Tab 2 Comparison of invasive cells among four groups

圖2 四組侵襲細(xì)胞數(shù)比較Fig 2 Comparison of invasive cells among four groups

3.3 解毒消癌方對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞TGF-β、ZEB-1、snail及MMP-9蛋白表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)解毒消癌方喂養(yǎng)后，大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞TGF-β、ZEB-1、snail及MMP-9蛋白表達(dá)明顯降低，低、中及高劑量組均低于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TGF-β、ZEB-1、snail及MMP-9蛋白表達(dá)受到抑制；且中劑量組明顯低于低劑量組，高劑量組明顯低于中劑量組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；解毒消癌方對(duì)TGF-β、ZEB-1、snail及MMP-9蛋白表達(dá)的抑制呈濃度依賴性，濃度越高，表達(dá)水平越低，見(jiàn)表3、圖3—4。

表3 四組細(xì)胞TGF-β、ZEB-1、snail、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Tab 3 Comparison of relative expression levels of TGF-β, ZEB-1, snail and MMP-9 among four groups

圖3 四組細(xì)胞TGF-β、ZEB-1、snail、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Fig 3 Comparison of relative expression levels of TGF-β, ZEB-1, snail and MMP-9 among four groups

圖4 蛋白電泳圖Fig 4 Protein electropherogram

4 討論

膠質(zhì)瘤在顱內(nèi)腫瘤等級(jí)劃分中始終處于最高級(jí)(Ⅳ級(jí))，具有侵襲能力強(qiáng)、復(fù)發(fā)率和死亡率高的特點(diǎn)[5]。如何延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤患者的生存期，提高患者的生活質(zhì)量，始終是臨床研究的熱點(diǎn)。

中醫(yī)理論并無(wú)膠質(zhì)瘤這一名詞，可納入“真頭痛”“眩暈”等范疇[6]。血?dú)獠煌▌t停留為瘀，津液無(wú)法正常輸布則留結(jié)為痰[7]。癌毒留結(jié)是腫瘤發(fā)病的根本，在損傷臟腑功能、損耗人體正氣的同時(shí)還會(huì)流竄到其他臟腑，形成原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶[8]。虛實(shí)兩端是膠質(zhì)瘤病機(jī)要素，虛者以氣虛、陰傷為主，實(shí)者以血瘀、痰濁為主[9]。根據(jù)癌毒特點(diǎn)，結(jié)合病機(jī)要素，以“扶正祛邪”為基本治療原則。在膠質(zhì)瘤的治療中應(yīng)以解毒消癌法為主導(dǎo)，以扶正姑息治療為輔。

本研究所采用的解毒消癌方由清熱解毒藥白花蛇舌草、山慈菇，理氣活血藥八月札，息風(fēng)止痙藥僵蠶、蜈蚣和扶正補(bǔ)氣藥太子參、麥冬組成。其中，白花蛇舌草清熱解毒、利濕通淋；山慈菇清熱解毒、化痰散結(jié)；僵蠶祛風(fēng)止痛、化痰散結(jié)；蜈蚣熄風(fēng)鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛；八月札舒肝理氣、活血散瘀；太子參益氣健脾、潤(rùn)肺生津；麥冬養(yǎng)陰生津、潤(rùn)肺清心。全方攻補(bǔ)兼施，共奏清熱解毒、祛邪扶正、化痰散結(jié)之功。該方是臨床實(shí)踐中治療惡性腫瘤頗具療效的經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用。馬艷霞等[10]經(jīng)研究證實(shí)，“消癌解毒方”能夠抑制H22荷瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng)，降低腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的可能性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)解毒消癌方水提物培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SHG44的遷移距離和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯縮短和降低，且隨著藥物濃度升高，縮短和降低幅度越明顯，證實(shí)解毒消癌方在抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲方面具有良好的效果，且呈劑量依賴性。

膠質(zhì)瘤細(xì)胞是否發(fā)生經(jīng)典EMT一直存在爭(zhēng)論，這是由于在大部分膠質(zhì)瘤細(xì)胞中無(wú)法檢測(cè)到上皮鈣黏素(E-cadherin)，而上皮鈣黏素是上皮細(xì)胞最主要的表型分子[2,11-13]。本研究中也并未檢測(cè)到該分子。EMT過(guò)程中除了上皮鈣黏素下調(diào)，也表現(xiàn)為其他間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記分子上調(diào)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，snail mRNA在多種間質(zhì)轉(zhuǎn)變的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，其不但能抑制細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變，還能夠提高腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力[14]。ZEB-1是EMT的重要調(diào)控基因之一，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT，增強(qiáng)遷移、侵襲能力的同時(shí)還能使腫瘤細(xì)胞具備肝細(xì)胞的特征[15]。趙麗艷等[16]的研究結(jié)果顯示，沉默ZEB1基因表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞EMT。ZEB-1和snail是EMT的2個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，各自獨(dú)立進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)的同時(shí)還能形成雙向負(fù)反饋調(diào)節(jié)，共同在EMT發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到調(diào)控作用。本研究中，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)25、50及100 μg/ml解毒消癌方喂養(yǎng)的裸鼠移植瘤內(nèi)ZEB-1、snail蛋白水平均低于空白對(duì)照組，證實(shí)解毒消癌方能夠抑制EMT轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制EMT的發(fā)生。

MMP-9降解細(xì)胞外基質(zhì)是膠質(zhì)瘤遷移、侵襲的重要原因[17]。通常MMP-9高表達(dá)的膠質(zhì)瘤患者預(yù)后較差。研究結(jié)果證實(shí)，MMP-9高表達(dá)會(huì)促進(jìn)EMT的發(fā)生，EMT的發(fā)生也會(huì)反向促進(jìn)MMP-9表達(dá)升高[18]。因此，下調(diào)MMP-9水平對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移具有較好的抑制效果。本研究結(jié)果顯示，解毒消癌方能夠下調(diào)MMP-9水平，且呈劑量依賴性，提示其具有抑制細(xì)胞遷移和侵襲的作用，也與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。TGF-β是一種多肽性生長(zhǎng)因子，早期能抑制腫瘤生長(zhǎng)，但會(huì)促進(jìn)晚期腫瘤的發(fā)展。在膠質(zhì)瘤等部分惡性腫瘤中，TGF-β呈高表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[19]。本研究結(jié)果顯示，解毒消癌方能夠降低TGF-β蛋白表達(dá)水平，提示解毒消癌方可能通過(guò)下調(diào)TGF-β表達(dá)而發(fā)揮作用。但本研究并未就TGF-β是否為解毒消癌方調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT的上游作用靶點(diǎn)展開(kāi)研究，期望在今后的實(shí)驗(yàn)中展開(kāi)更深入的研究。

綜上所述，解毒消癌方能夠阻止膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT，進(jìn)而抑制細(xì)胞侵襲、遷移，其作用機(jī)制與下調(diào)細(xì)胞中TGF-β、ZEB-1、snail及MMP-9等多種效應(yīng)蛋白表達(dá)有關(guān)。