高效液相色譜法對食品中苯并芘含量測定的不確定度評定

王 邱，劉德群，周銘林，江 琦，何海彤

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東佛山 528000）

苯并芘又稱苯并（a）芘、3，4-苯并芘，英文縮寫為 Bap，是一種常見的高活性間接致癌物和突變原[1]。若被釋放至大氣中以后，容易與大氣中各種類型的微粒所形成的氣溶膠結(jié)合在一起，在8 μm以下可吸入塵粒中，易經(jīng)呼吸道吸入至肺部，進(jìn)入肺泡甚至血液，從而導(dǎo)致肺癌和心血管疾病[2-3]。

測量不確定度的評定工作是分析測試實(shí)驗(yàn)中一項(xiàng)非常重要的內(nèi)容，它能夠定量反映測量結(jié)果正確性的可疑程度[4]。一個(gè)完整的測量結(jié)果應(yīng)至少含有兩個(gè)基本量：一是被測量的最佳估計(jì)值；二是表述該測量結(jié)果的離散型程度即為測量結(jié)果不確定度[3，5-7]

本研究依據(jù) JJF 1059—1999《測量不確定度評定與表示》[8-10]和JJF 1135—2005《化學(xué)分析測量不確定度評定》[11-13]，按照GB 5009.27—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中苯并（a）芘的測定》[14]對三種不同基質(zhì)試樣（大米試樣、煙熏肉試樣、食用植物油試樣）進(jìn)行處理，分別對不同試樣中苯并芘含量測定過程中的不確定度的各個(gè)分量進(jìn)行評定，并給出擴(kuò)展不確定度，以期建立一套合理、完整的評定方案，可以作為改善食品中苯并芘含量測定的測量程序，提高其測量準(zhǔn)確性和精密度等方面的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品（批號為 H419128AL，濃度為10.00 mg/L）：德國DR公司；大米試樣：華潤五豐米業(yè)（中國）有限公司；煙熏肉試樣：佛山市順德區(qū)東龍烤鰻有限公司；食用植物油試樣：東莞魯花食用油有限公司；苯并（a）芘分子印跡柱（貨號為 50610020，規(guī)格為 200 mg，3 mL）：上海安譜公司；正己烷、二氯甲烷（均為色譜純）：美國honeywell公司；乙腈（色譜純）：美國TEDIA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀，配置熒光檢測器（型號為 LC30-AD，工作站為 LabSolution）：日本SHIMADZU公司；電子天平（感量為1 mg，0 g≤m≤50 g時(shí)，最大允許誤差為0.005 g）：廣東省中科進(jìn)出口有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

吸取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，用乙腈定容，得到100 ng/mL苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)儲備液。系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制方法見表 1。用乙腈配制成0.5、1、2、5、10、20 ng/mL 6個(gè)濃度點(diǎn)，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣三次，以期獲得峰面積與濃度之間的線性關(guān)系以考察標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合所引入的不確定度。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制Table 1 Preparation of standard working solution

1.3.2 樣品前處理方法

1.3.2.1 大米試樣 稱取1 g（精確到0.001 g）試樣（每個(gè)試樣稱2次，取兩次稱量結(jié)果的平均值），加入5 mL正己烷，旋渦混合0.5 min，40 ℃下超聲提取10 min，4 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移出上清液。再加入 5 mL正己烷重復(fù)提取一次。合并上清液，轉(zhuǎn)移至預(yù)先已活化完全的苯并芘分子印跡柱中（依次用5 mL二氯甲烷及5 mL正己烷活化柱子），將待凈化液轉(zhuǎn)移進(jìn)柱中，待液面降至柱床時(shí)，用6 mL正己烷淋洗柱子，棄去流出液。用6 mL二氯甲烷洗脫并收集凈化液到試管中。將凈化液在40 ℃下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確吸取1 mL乙腈渦旋復(fù)溶0.5 min，過微孔濾膜后供液相色譜測定。

1.3.2.2 煙熏肉試樣 提取和凈化方法同大米試樣一致。

1.3.2.3 植物油試樣 除稱樣0.4 g（精確到0.001 g）和最后用0.4 mL乙腈定容外，其余處理均與大米試樣一致[14]。

1.3.2.4 空白試樣 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)前處理方法：按照上述前處理方法選出三種不同基質(zhì)試樣的空白樣品（即含量為未檢出），在空白大米試樣、空白煙熏肉試樣、空白食用油試樣均添加 10 ng的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每種試樣各做6個(gè)平行，再按照上述前處理方法進(jìn)行提取、過柱、氮吹以及復(fù)溶等步驟后過濾膜上機(jī)。

1.3.2.5 加標(biāo)試樣 選擇其中一個(gè)加標(biāo)試樣重復(fù)上機(jī)測定6次以考察高效液相色譜儀重復(fù)進(jìn)樣引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相：乙腈-水（88∶12，v/v）等度洗脫；流速：1.0 mL/min；激發(fā)波長384 nm，發(fā)射波長406 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型以及不確定來源分析

根據(jù)公式 X=C×V ×F×1 000/(m×1 000)

其中：X：試樣中苯并（a）芘含量（μg/kg）；C：從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到被測組分的質(zhì)量濃度（ng/mL）；m：樣品稱樣量（g）；V：定容體積（mL）；F：稀釋因子，按照標(biāo)準(zhǔn)處理方法F=1；1 000：由ng/g換算成μg/kg的換算因子。

結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后一位。

從數(shù)學(xué)模型和實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程來看，食品中苯并芘含量測定的不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品前處理過程、高效液相色譜儀（重復(fù)測定）等方面。

2.2 不確定度分量的評定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(標(biāo))經(jīng)查苯并（a）芘標(biāo)準(zhǔn)品證書，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10.00 mg/L，其擴(kuò)展不確定度為0.31 mg/L(k=2)，按矩形分布處理[15]，則標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(容)和移液槍引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(槍)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中容量瓶使用情況以及不同容量瓶的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表2。單標(biāo)線10 mL容量瓶和單標(biāo)線100 mL容量瓶經(jīng)檢定均為A級，服從三角分布[16]，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為。因此，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中容量瓶引入的總相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中容量瓶引入的不確定度Table 2 Uncertainties of volumetric flasks form calibration solution preparation

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中移液槍使用情況以及不同移液槍的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表 3。按照矩形分布計(jì)算[17]，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為。因此標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中移液槍引入的總相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中移液槍的不確定度Table 3 Uncertainties of pipettes form calibration solution preparation

2.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中溫度變化引起的溶劑體積改變引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(溶劑)實(shí)驗(yàn)室溫度在（20±3）℃范圍內(nèi)波動，玻璃器具受溫度波動的影響較小，可忽略不計(jì)，但溫度波動引起溶劑體積的改變需考慮。本次標(biāo)準(zhǔn)儲備液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均由乙腈配制，20 ℃時(shí)乙腈的體積膨脹系數(shù)（a）為1.37×10-3℃-1[18]，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為，ΔT=3 ℃，n為使用次數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的全部過程均由容量瓶和移液槍完成，環(huán)境溫度變化引入的容量瓶和移液槍中溶劑體積改變的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表4。 因此，環(huán)境溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表4 環(huán)境溫度變化引入的不確定度Table 4 Uncertainties form temperature changes in the experimental environment

2.2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref（1） 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的不確定度、配制時(shí)容量瓶引入的不確定度、配制時(shí)移液槍引入的不確定度以及環(huán)境溫度變化時(shí)乙腈體積改變引入的不確定度這幾部分組成。

2.2.2 樣品前處理過程引入的不確定度

2.2.2.1 稱量試樣時(shí)天平引入的不確定度uref(天平)樣品前處理稱樣時(shí)使用的是千分之一天平，其最大允許誤差為±0.005 g，屬均勻分布[16]，且樣品稱樣量是由每個(gè)試樣的兩次稱樣所得，三種不同試樣稱量時(shí)天平引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度見表5。按照矩形公式計(jì)算，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為

表5 三種不同試樣稱量時(shí)天平引入的不確定度Table 5 Uncertainties form weighing of electronic balance of three different samples

2.2.2.2 加標(biāo)回收率引入的不確定度uref(回收)樣品前處理過程較為復(fù)雜，需經(jīng)過提取、均質(zhì)、過柱凈化、氮吹等步驟，難以對每個(gè)環(huán)節(jié)逐一進(jìn)行評定，可通過對樣品稱樣后加標(biāo)測定其回收率的方式對樣品前處理過程進(jìn)行不確定度評定。不同樣品加標(biāo)回收率結(jié)果見表 6。加標(biāo)回收率的平均值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度?！稖y量不確定度表示指南》[19]中要求校正明顯的系統(tǒng)誤差，因此應(yīng)進(jìn)行t檢驗(yàn)（公式為）以考察平均回收率R與100%之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t≥t95，5=2.57），則需要用回收率校正因子f（f=1/）校正結(jié)果，應(yīng)歸入到樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算中，否則不必進(jìn)行校正。三種不同基質(zhì)試樣加標(biāo)回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度和t檢驗(yàn)結(jié)果見表7。

表6 三種不同基質(zhì)試樣6次平行試驗(yàn)的加標(biāo)回收率Table 6 Recoveries of three different samples at six parallel experiments %

2.2.2.3 樣品前處理過程引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(2) 樣品前處理過程引入的不確定度主要由稱量試樣時(shí)天平引入的不確定度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)引入的不確定度兩部分組成：uref(2)=。因此，三種不同基質(zhì)試樣前處理過程引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表7 三種不同基質(zhì)試樣加標(biāo)回收率的不確定度和t檢驗(yàn)結(jié)果Table 7 Uncertainties and t test results of recoveries of three different samples

2.3.3 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)引入的相對不確定度uref(3)

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的不確定度由標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測定得到。峰面積Y與濃度的線性關(guān)系表8。

表8 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度-峰面積對應(yīng)表Table 8 Concentration peak area of standard solutions

以三種不同基質(zhì)的空白加標(biāo)樣品的峰面積經(jīng)過線性回歸方程計(jì)算后得到的質(zhì)量濃度C為例，見表9。

表9 三種不同基質(zhì)的空白加標(biāo)樣品的含量結(jié)果Table 9 Determine results of three different spiked samples ng/mL

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時(shí)的不確定度公式[20]為：，其中S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)偏差，公式為：b為線性回歸方程的斜率，b=6 947.7，p為樣品平行測定的次數(shù)，p=6；n為標(biāo)準(zhǔn)曲線每個(gè)濃度點(diǎn)測定的總次數(shù)，n=18；C0為樣品的平均濃度；為所有標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度平均值，=6.4ng/mL；且三種不同基質(zhì)試樣的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見表10。

表10 三種不同基質(zhì)試樣的加標(biāo)樣品含量平均值的不確定度Table 10 Uncertainties of average content results of three different spiked samples

2.2.4 高效液相色譜儀重復(fù)進(jìn)樣引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(4)

表11 加標(biāo)試樣6次重復(fù)進(jìn)樣每一針的濃度Table 11 Six concentrations of each injection of the spiked sample

2.3 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Uref

綜上所述，高效液相色譜法測定食品（大米類、煙熏肉類、食用植物油類）中苯并芘含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度由標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(1)、試樣前處理過程引入的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(2)、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合時(shí)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(3)和高效液相色譜儀重復(fù)進(jìn)樣引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uref(4)這四個(gè)主要部分構(gòu)成，不同基質(zhì)試樣的合成相對不確定度分別為：

2.5 檢測結(jié)果的表述

一般情況下，檢測結(jié)果取包含因子k=2，置信區(qū)間95%，表明被測量值的大約95%概率可望包含于此區(qū)間，則擴(kuò)展不確定度U=Uref×k×C0（C0為被測樣品含量的平均值，由數(shù)學(xué)模型獲得），因此：

大米試樣的擴(kuò)展不確定度UM=Uref(M)×k×C0(M)=0.024 82×2×8.3=0.5 μg/kg，檢測結(jié)果表述為大米試樣含量XM=(8.3±0.4) μg/kg，k=2；

煙熏肉試樣的擴(kuò)展不確定度UR=Uref(R)×k×C0(R)=0.024 99×2×8.2=0.5 μg/kg，檢測結(jié)果表述為煙熏肉試樣含量XR=(8.2±0.4) μg/kg，k=2；

食用植物油試樣的擴(kuò)展不確定度UM=Uref(M)×k×C0(M)=0.026 32×2×8.7=0.5 μg/kg，檢測結(jié)果表述為食用植物油試樣含量XY=(8.7±0.5) μg/kg，k=2；

3 討論與結(jié)論

通過高效液相色譜法對食品中苯并芘含量測定的不確定度各分量的評定，可見最終檢測結(jié)果的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程、樣品前處理過程以及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入，其次為高效液相色譜重復(fù)測定引入。因此，實(shí)際操作過程中，可通過選擇純度較高或者擴(kuò)展不確定較小的標(biāo)準(zhǔn)溶液、選擇精度更高的天平和玻璃量器、增加每個(gè)試樣的稱樣次數(shù)、優(yōu)化前處理方法提高樣品加標(biāo)回收率、增加平行樣品測定次數(shù)等方式來減小不確定度的引入，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

此外，本次對大米試樣、煙熏肉試樣和食用植物油試樣進(jìn)行平行不確定度評定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電子天平稱樣過程對食用油的不確定度貢獻(xiàn)較其它兩種試樣大，可能原因是樣品稱樣量最小為0.4 g，其它兩種為1.0 g。通過考察三種不同基質(zhì)樣品的加標(biāo)回收率，發(fā)現(xiàn)食用植物油樣品的加標(biāo)回收率最高且引入的不確定度最小，說明食用油基質(zhì)對回收率的影響最小。從最終檢測結(jié)果的表述中可以看出三種不同基質(zhì)的擴(kuò)展不確定度差別不大。