雜質(zhì)吸附固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定糧食中15種真菌毒素

劉笑笑 ，丁 輝 ，吳福祥 ，苗 茜 ，姬良亮 ，彭 濤 ，張菁菁 ?

（1. 蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州 741250；2. 甘肅省種植中藥材外源性污染物監(jiān)測(cè)工程研究中心，甘肅 蘭州 741250）

真菌毒素是由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物，目前已知的真菌毒素有400多種[1]。糧食作物比較容易被真菌霉毒素污染，對(duì)人類健康影響較大的有黃曲霉毒素（AFT）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）等[2]，超過(guò)一定攝入量后會(huì)損壞人的肝功能、致癌、致畸并誘發(fā)免疫抑制性疾病[3]。世界衛(wèi)生組織已將真菌毒素納入食品安全體系重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象[4]，我國(guó) GB2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》也對(duì)上述幾種真菌毒素在食品中的限量指標(biāo)有嚴(yán)格的規(guī)定[5-8]。在自然情況下作物常常遭受多種真菌毒素污染，根據(jù)國(guó)家現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，需要同時(shí)采用幾種檢測(cè)方法進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)分析，才能測(cè)得不同真菌毒素的含量，測(cè)定方法不僅繁瑣，而且效率較低，因此，亟需建立多種真菌毒素同步檢測(cè)方法[9-12]。

Anastassiades等提出 QuEChERS（Quick， Easy，Cheap， Effective， Rugged， Safe）法，即分散固相萃取法，但是針對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中多種毒素的提取仍有不足，雜質(zhì)吸附固相萃取法被廣泛應(yīng)用于食品中有機(jī)殘留污染物的檢測(cè)，其中包括復(fù)雜的糧食及其制品[10-13]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC-MSMS）具有更高的選擇性和靈敏度，逐漸成為同步檢測(cè)多種真菌毒素的主要手段[15]。

本研究將樣品經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單提取和稀釋，利用雜質(zhì)吸附固相萃取凈化，優(yōu)化了液相色譜與質(zhì)譜條件，利用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，建立了UPLC-MS-MS檢測(cè)糧食中多種真菌毒素的方法[12，14-16]。本方法簡(jiǎn)單、快速、通量高、成本低，適用于大批量糧食樣品中多毒素的快速、準(zhǔn)確定量檢測(cè)，可為糧食中真菌毒素的檢測(cè)和污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作提供技術(shù)保障，減少因真菌毒素殘留帶來(lái)的食品安全問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC-MS/MS液相色譜-三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源：美國(guó)安捷倫1290-G6460；Milli-Q超純水儀：德國(guó)默克密理博公司；氮吹儀：美國(guó)Organomation公司；Eppendorf5810R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德曼公司；BSA2202S- CW分析天平：梅特勒公司。

15種真菌霉毒素：黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素 B2（aflatoxin B2，AFB2）、黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（aflatoxin G2，AFG2）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-deoxynivalenol，3-AcDON）、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-deoxynivalenol，15-AcDON）、展青霉毒素（patulin，PAT）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）、赭曲霉毒素（orchatoxin A，OTA）、T2毒素（T-2）、HT2毒素（HT-2），伏馬毒素 B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）、伏馬毒素B2（fumonisin B2，F(xiàn)B2）、伏馬毒素B3（fumonisin B3，F(xiàn)B3）：奧地利 Biopure和美國(guó)Sigma公司；[13C15]DON、[13C17]-3-AcDON、[13C17]AFB1、[13C17]AFB2、[13C17]AFG1、[13C17]AFG2、[13C34]FB1、[13C20]OTA、[13C34]FB2、[13C24]T-2、[13C22]HT-2、[13C18]ZEN12種全碳同位素內(nèi)標(biāo)溶液：奧地利Biopure公司。

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純：德國(guó)默克公司；乙酸銨（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)；乙酸（色譜純）：賽默飛；0.22 μm水系濾膜：天津津滕公司；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別精密量取OTA、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、ZEN、FB1、FB2、FB3、T-2、HT-2、PAT、3-AcDON、15-AcDON毒素標(biāo)準(zhǔn)品1.000 mL，用乙腈各自定容至10 mL配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量用乙腈稀釋成濃度分別為100 ng/mL，10 ng/mL，3.0 ng/mL，10 ng/mL，3.0 ng/mL，500 ng/mL，250 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL，200 ng/mL，500 ng/mL，500 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。加入一定濃度同位素內(nèi)標(biāo)，配置成系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 樣品前處理

制備：抽取有代表性的樣品，用四分法縮減取200 g，粉碎后過(guò)0.4 mm孔徑的分析篩，混勻，裝入自封袋中，避光，備用。

提取：準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的樣品5 g（精確至0.001 g），于50 mL離心管中，加入25 mL1%乙酸酸化的 84%乙腈水溶液溶解，勻漿 1 min，加入3 g無(wú)水硫酸鎂、2 g氯化鈉脫水鹽提取，震蕩提取20 min，以提高提取率，震蕩后立即渦旋混合1 min，在4 ℃、4 900 r/min離心10 min，使得完全分離，取10.0 mL上清液待凈化。

凈化：加入裝有不同填料的凈化管中，HLB柱先活化，再移取10 mL上清液過(guò)柱，棄去凈化液，淋洗一邊，甲醇洗脫，收集洗脫液，加入12種同位素內(nèi)標(biāo)混合液；PrimeHLB柱直接移取10 mL上清液過(guò)柱，收集凈化液，加入12種同位素內(nèi)標(biāo)混合液；分別渦旋震蕩混勻，于 40 ℃水浴，氮吹至近干，1.00 mL甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 um濾膜過(guò)濾，上機(jī)測(cè)定。對(duì)比不同組成及配比的凈化柱，以目標(biāo)物的回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.2.3.1 液相色譜條件 Kinetex 2.6 μm Bipheny l100A 色譜柱（LCColumn 50×2.1 mm，2.7 μm，phenomenon），流動(dòng)相：A：0.1%（V/V）甲酸的2 mmol/L 甲酸銨溶液、B：甲醇，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣體積：5 μL，柱溫：35 ℃。液相色譜梯度洗脫程序如表1所示。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子（electrosprayionization，ESI）源：正離子、負(fù)離子分別掃描；離子源溫度：正離子模式650 ℃，負(fù)離子模式600 ℃；氣簾氣：35 psi；碰撞氣：中等；電噴霧電壓：正離子模式：5 000，負(fù)離子模式：-4 500；Gas1：60，Gas2：65；其他質(zhì)譜條件參見(jiàn)表2。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradientelution program

表2 質(zhì)譜條件Table 2 Mass spectrometry conditions

續(xù)表2

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣的方式，分別對(duì) 15種濃度為100 μg/L的目標(biāo)化合物優(yōu)化其質(zhì)譜條件。本試驗(yàn)分別在ESI+模式和ESI-模式下對(duì)15種真菌毒素進(jìn)行全掃描，大多數(shù)化合物在ESI正極模式下都顯示了大量的[M+H]+離子，HT-2毒素和T-2毒屬于單端孢霉烯族毒素，其母離子都形成了[M+Na]+的形式，[M+Na]+的結(jié)合物靈敏度更高，因此上述2種毒素選擇[M+Na]+作為母離子。試驗(yàn)表明，玉米赤霉烯酮和展青霉毒素在ESI-模式下響應(yīng)更顯著，其余 13種毒素均在ESI+下有響應(yīng)，確定母離子后，母離子進(jìn)入二級(jí)質(zhì)譜得到各目標(biāo)分析物碎片離子信息，確定定量離子對(duì)和定性離子對(duì)，優(yōu)化各質(zhì)譜參數(shù)，考慮到正負(fù)離子模式頻繁轉(zhuǎn)換易造成儀器不穩(wěn)定，因此選擇分段采集模式試驗(yàn)。15種真菌毒素優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表 2，MRM 色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)性的選擇

由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)下電離，因此流動(dòng)相的種類和比例不僅影響目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和峰形，還會(huì)影響到目標(biāo)化合物的離子化效率，從而影響靈敏度，本文考察了對(duì)比流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液-甲醇，B：乙酸銨0.1%甲酸水溶液-甲醇，C：甲酸銨 0.1%甲酸水溶液-甲醇對(duì)15種真菌毒素質(zhì)譜響應(yīng)的影響。結(jié)果表明，A為流動(dòng)相，各毒素均有質(zhì)譜響應(yīng)。當(dāng)流動(dòng)相中存在乙酸銨且濃度增至5 mmol/L時(shí)，雖然大部分對(duì)照品離子響應(yīng)加強(qiáng)，但FB1和FB2無(wú)響應(yīng)。用C作為流動(dòng)相時(shí)，各真菌毒素的色譜峰信號(hào)強(qiáng)度明顯高于A和B，本文最終選擇2 mmol/L甲酸銨0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動(dòng)相。

2.2.2 色譜柱的選擇

圖1 15種真菌毒素的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the 15 mycotoxins

同分異構(gòu)體有相同的母離子和子離子，在質(zhì)譜檢測(cè)上會(huì)產(chǎn)生干擾，因此必須在色譜上實(shí)現(xiàn)基線分離才能準(zhǔn)確的定性、定量分析。本研究比較了不同類型的C18色譜柱對(duì)兩種毒素的分離效果，考察Aglient ZORBAX Elipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Phenomenon Kinetex Bipheny l100A 色譜柱(LCColumn 50×2.1 mm，2.7 μm)，3種色譜柱對(duì)15種真菌毒素的分離。Phenomenon Kinetex Bipheny l100A色譜柱對(duì)15種真菌毒素達(dá)到基線分離、峰形尖銳。同時(shí)也可以看出Phenomenon Kinetex Bipheny l100A色譜柱在20 min的洗脫梯度內(nèi)對(duì)多數(shù)毒素能夠?qū)崿F(xiàn)較好地分離（見(jiàn)圖 2中 C），因此最終選擇Phenomenon Kinetex Bipheny l100A 色譜柱(LCColumn 50×2.1 mm，2.7 μm)。

圖2 不同初始流動(dòng)相對(duì)真菌毒素出峰的影響Fig.2 Effects of that gradient condition on the peak of the mycotoxins

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相起始的比例對(duì)目標(biāo)物的分離有較大的影響，圖2為三種梯度條件下15種真菌毒素的總離子流圖。由圖 2可知，A（起始比例為甲醇90%）和B（起始比例為甲醇50%）條件下，所有目標(biāo)物出峰時(shí)間重疊，影響峰形，且無(wú)法分段采集，導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)降低。當(dāng)水相起始比例為90%，按流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)（見(jiàn)表1），各化合物在15 min內(nèi)依次分離（見(jiàn)圖2中C），泵壓在20 min時(shí)達(dá)到平衡。

2.3 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.3.1 提取條件優(yōu)化

2.3.1.1 提取溶劑的選擇 真菌毒素主要采用甲醇、乙腈或這兩種溶劑與水以不同比例混合后作為提取劑。由于不同基質(zhì)適應(yīng)性不同，且15種真菌毒素理化性質(zhì)差異較大，選擇合適15種真菌毒素的提取溶劑至關(guān)重要，經(jīng)查閱文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)，比較了 8種較為常見(jiàn)的提取溶劑：80%甲醇（MeOH）、50%乙腈（ACN）、70%ACN、84%ACN、80%MeOH 加入 1%乙酸（AA）、50%ACN 加入1%AA、70%ACN加入 1%AA、84%ACN加入1%AA對(duì)中藥材中15種真菌霉毒素的提取效率，結(jié)果表明，大部分真菌毒素乙腈的提取率要顯著優(yōu)于甲醇的，乙酸的加入對(duì) ZEN、OTA、FB3、DON、HT-2的提取率有顯著提高，綜合考慮8種提取劑對(duì) 15種真菌霉毒素的提取效果，選擇84%ACN+1%AA作為提取劑。

2.3.1.2 助提取劑的選擇 本試驗(yàn)中，選擇84%ACN加入1%AA作為提取劑，向提取液中加入助提劑，可以提高提取效率。選擇無(wú)機(jī)鹽NaCl+MgSO4作為本試驗(yàn)的助提劑，可以促進(jìn)分層，促使目標(biāo)物進(jìn)入有機(jī)相。分別考察當(dāng)添加量為 NaCl（0、1、2、3、4、5 g）和 MgSO4（0、1、2、3、4、5 g）的添加量對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表明：當(dāng)NaCl為2 g時(shí)鹽析效果最好，大部分真菌毒素能達(dá)到較高回收率，NaCl添加量再增加時(shí)提取率無(wú)顯著變化，見(jiàn)圖 4；MgSO4添加量為3 g時(shí)除水效果較好，大部分真菌毒素能達(dá)到較高回收率，MgSO4添加量再增加時(shí)提取率無(wú)顯著變化，見(jiàn)圖5；因此，綜合考慮助提劑無(wú)機(jī)鹽NaCl+MgSO4的添加量對(duì)15種真菌霉毒素的提取效果，選擇2 gNaCl+3 gMgSO4作為本試驗(yàn)的助提劑。

2.3.2 凈化條件的優(yōu)化

圖3 不同提取溶劑對(duì)15種真菌毒素的回收率的影響Fig.3 Effect of different extraction solvents on the recoveries of 15 mycotoxins

圖4 不同NaCl添加量對(duì)15種真菌毒素的回收率的影響Fig.4 Effect of different NaCl add on the recoveries of 15 mycotoxins

圖5 不同MgSO4添加量對(duì)15種真菌毒素的回收率的影響Fig.5 Effect of different MgSO4 add on the recoveries of 15 mycotoxins

本研究以糧食為基質(zhì)，利用 84%ACN加入1%AA作為提取劑，勻漿提取，并加入 2 gNaCl和3 gMgSO4助提劑，充分震蕩萃取后，3 900 r/min離心，移取上清液，考察2種不同的固相萃取凈化柱，考察添加標(biāo)準(zhǔn)下多種真菌毒素的回收率。HLB為反相固相萃取柱，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行吸附，將雜質(zhì)進(jìn)行淋洗除去，而Prime-HLB主要是將雜質(zhì)吸附使目標(biāo)物流出，不需要平衡活化可直接上樣，簡(jiǎn)化和加速SPE流程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種凈化柱對(duì)15種真菌毒素回收率較好，其中Prime-HLB對(duì)這2類真菌毒素的加標(biāo)回收率范圍為78.9%～101.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.9%～5.1%，HLB柱凈化獲得的回收率在 58.5%～94.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在 2.3%～12.0%。對(duì)比2種固相萃取柱，雜質(zhì)吸附型固相萃取柱除HT-2毒素外，回收率均優(yōu)于目標(biāo)物吸附性固相萃取柱，主要是由于HLB柱并非對(duì)特定毒素具有專一吸附性，所以回收率的損失在凈化過(guò)程中的目標(biāo)物吸附以及雜質(zhì)淋洗過(guò)程中都容易產(chǎn)生，具體結(jié)果見(jiàn)表 3。而玉米赤霉烯酮類毒素則需在酸性條件下凈化獲得的回收率較高，因此本試驗(yàn)選擇Prime- HLB柱作為凈化柱。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是在提取基質(zhì)中的目標(biāo)物時(shí)，基質(zhì)中的干擾物影響目標(biāo)化合物的離子化，主要源于樣品中的內(nèi)源性組分和樣品處理后引入的雜質(zhì)。在ESI離子化模式下，化合物的質(zhì)譜響應(yīng)容易受到基質(zhì)的干擾，影響定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性。13C標(biāo)記的穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)與目標(biāo)物有相同結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)和色譜質(zhì)譜行為，因此也具有相同的基質(zhì)效應(yīng)，在進(jìn)樣之前加入穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)能夠補(bǔ)償進(jìn)樣體積、ESI源的離子化效率、離子傳輸導(dǎo)致的目標(biāo)物偏移，保證了質(zhì)譜分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。本研究將毒素的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用空白樣品經(jīng)處理所得提取液和甲醇溶液分別稀釋，制得一定質(zhì)量濃度的2種標(biāo)準(zhǔn)工作液，用相對(duì)響應(yīng)值法（基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值×100%，基質(zhì)效應(yīng)大于 1時(shí)，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；基質(zhì)效應(yīng)小于1時(shí)，為基質(zhì)抑制效應(yīng)）評(píng)價(jià)了15種真菌毒素在玉米、小麥和藜麥中的基質(zhì)效應(yīng)見(jiàn)表 4。結(jié)果表面黃曲霉毒素、脫氧鐮刀雪腐菌烯醇毒素及伏馬毒素等在三種基質(zhì)中均有較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，T-2毒素和HT-2毒素在三種基質(zhì)中均有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，在所有樣品和標(biāo)液中加入穩(wěn)定同位素，以毒素峰面積與對(duì)應(yīng)毒素內(nèi)標(biāo)的峰面積比進(jìn)行定量從而彌補(bǔ)真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)影響，考慮到 15-AcDon市面上沒(méi)有穩(wěn)定同位素出售，選擇[13C17-3-AcDon作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用的分散固相萃取技術(shù)提取 15種真菌毒素的提取率很高，提取回收率基本在 80%～120%之間，同時(shí)穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)價(jià)格昂貴，因此選擇在上機(jī)進(jìn)樣前加入穩(wěn)定同位素。相比于樣品提取前加入同位素內(nèi)標(biāo)，本方法大大減少了穩(wěn)定同位素的使用量，節(jié)約了檢測(cè)成本，又能夠有效地補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的影響，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。

表3 不同凈化柱對(duì)15種真菌毒素的回收率的影響Table 3 Effect of different Multifunction Clean-up Column on the recoveries of 15 mycotoxin %

表4 玉米、小麥和藜麥的基質(zhì)效應(yīng)Table 4 Matrlx effects of 15 mycotoxins in maize, wheat and quinoa

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 方法的線性范圍及檢出限

將2.1中對(duì)照品配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，向空白玉米、小麥及藜麥樣品中添加不同量的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品處理方法進(jìn)行前處理和檢測(cè)，采用空白基質(zhì)液逐級(jí)稀釋方法獲得各真菌毒素的檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10），表 5列出 15種真菌毒素的線性范圍、檢出限、定量限。在各自的線性范圍內(nèi)，15種真菌毒素線性良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于 0.996，檢出限和定量限均低于歐盟及我國(guó)規(guī)定的糧食中真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)，滿足限量檢出要求。

表5 15 種真菌毒素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限Table 5 Linear relationships, LODs and LOQs of 15 mycotoxins

2.5.2 不同基質(zhì)回收率及精密度

分別取藜麥、小麥、玉米的空白基質(zhì)，添加低、中、高三個(gè)水平的15種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行前處理，測(cè)定回收率，每個(gè)水平均測(cè)定6次，計(jì)算 RSD，結(jié)果見(jiàn)表 5，15種真菌毒素 3個(gè)添加水平的回收率為 76.9%～116.1%，RSD為1.4%～10%。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法準(zhǔn)確性，采用建立的檢測(cè)方法對(duì)玉米基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（FAPAS04319玉米）進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果如表 7所示，8種真菌毒素的檢測(cè)值均在標(biāo)示范圍內(nèi)，表明本文所建立方法準(zhǔn)確可靠。

表6 玉米、小麥和藜麥中15種真菌毒素的加標(biāo)回收率和精密度（n=6）Table 6 Recoveries and ralativest and arddeviations (RSDs) of 15 mycotoxins in Maize, Wheatand Quinoa sample (n=6)

表7 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)玉米中8種真菌毒素的檢測(cè)結(jié)果Table 7 Analytical results for the determination of 8 mycotoxins in maize reference materials ug/kg

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

隨機(jī)購(gòu)買市售糧食 135批，在本文優(yōu)化條件下進(jìn)行測(cè)定，共有97批樣品檢出真菌毒素，檢出率為71%，其中小麥中主要的污染毒素為DON、3-AcDON、15-ACDON、ZEN、FB1和FB2，玉米中主要污染毒素為DON、15-AcDON、ZEN、FB1，藜麥中主要污染毒素為 DON、OTA和 ZEN，多毒素同時(shí)污染現(xiàn)象較為普遍。最大濃度分別為小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為1 425 μg/kg、3乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為512.0 μg/kg、玉米中玉米赤霉烯酮為189.1 μg/kg、15乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為451.0 μg/kg，見(jiàn)表8，同時(shí)檢出脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和黃曲霉 B1的玉米樣品和空白樣品的總離子流圖見(jiàn)圖 6，對(duì)于真菌毒素產(chǎn)生的原因及其對(duì)在糧食作物中的殘留對(duì)人體的危害需進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表8 實(shí)際樣品中15種真菌毒素的檢測(cè)結(jié)果Table 8 Analyt ical results for the determination of 15 mycotoxins in real sample ug/kg

圖6 檢出多毒素的玉米樣品和空白樣品的總離子流圖Fig.6 Total ionflow diagrams of Maize samples and blank samples were obtained

3 結(jié)論

本研究通過(guò)優(yōu)化提取溶液體系，有效提高糧食基質(zhì)中15種真菌毒素殘留的回收率，通過(guò)固相萃取凈化，建立了回收率高、穩(wěn)定性強(qiáng)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩查和定量測(cè)定糧食中15種真菌毒素的方法。樣品采用電噴霧多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，以同位素內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，15種真菌毒素在各自濃度范圍內(nèi)線性良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于 0.996，檢出限為 0.2～10，定量限為0.8～30，以藜麥、小麥、玉米三種基質(zhì)分別進(jìn)行3水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率在76.9%～116.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.4%～10.4%，通過(guò)對(duì)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果均落在證書(shū)范圍內(nèi)，本方法實(shí)現(xiàn)多種真菌毒素的同時(shí)分析檢測(cè)，穩(wěn)定性高、靈敏度高、專一性強(qiáng)、再現(xiàn)性好，可實(shí)現(xiàn)糧食中15種真菌毒素的快速篩查和準(zhǔn)確定量，為真菌毒素的檢驗(yàn)檢測(cè)提供了實(shí)用的技術(shù)手段。針對(duì)隨機(jī)購(gòu)買市售糧食135批，共有97批樣品檢出真菌毒素，檢出率為71%，多毒素同時(shí)污染現(xiàn)象比較普遍，應(yīng)當(dāng)引起監(jiān)管的重視。