甘薯莖葉多酚分離純化及降血糖活性研究進(jìn)展

羅 丹 木泰華 孫紅男

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

據(jù)FAO 統(tǒng)計(jì)，2017年世界甘薯總產(chǎn)量為1.13 億t，其中，我國甘薯產(chǎn)量為0.72 億t，占世界甘薯總產(chǎn)量的63.72%，居世界首位[1]。甘薯莖葉是甘薯的地上蔓生部分，一年可多次采收，與地下部分的甘薯塊根產(chǎn)量相當(dāng)，遠(yuǎn)高于其他種類的綠葉蔬菜，且甘薯具有抗旱、抗臺(tái)風(fēng)和洪水、抗病蟲侵害等特點(diǎn)，能在惡劣環(huán)境下生長。甘薯中多酚含量因甘薯品種和甘薯部位的不同而存在差異，對(duì)于同一品種，甘薯莖葉多酚含量顯著高于甘薯塊根[2]。甘薯品種數(shù)量龐大，研究表明世界各地1 389 種基因型的甘薯莖葉的總酚含量范圍為1.42%～17.10%[3]，Wang 等[4]報(bào)道中國116 個(gè)品種的甘薯莖葉多酚含量為0.89%～2.70%，Sun 等[5]研究發(fā)現(xiàn)中國40 個(gè)品種的甘薯莖葉多酚含量為2.73%～12.46%。甘薯莖葉多酚類物質(zhì)具有抗氧化、降血糖、抗菌消炎、抗腫瘤、保護(hù)肝臟和免疫調(diào)節(jié)等作用，且甘薯莖葉多酚類物質(zhì)的降血糖作用已成為天然產(chǎn)物活性研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[6-7]。本文從甘薯莖葉多酚類物質(zhì)的提取、分離純化、組分構(gòu)成及降血糖活性等方面進(jìn)行綜述，旨在為甘薯莖葉多酚類物質(zhì)在食品和醫(yī)療保健領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

1 甘薯莖葉多酚類物質(zhì)的提取、分離純化研究進(jìn)展

1.1 甘薯莖葉多酚類物質(zhì)的提取

目前甘薯莖葉多酚類物質(zhì)的提取方法較多，如水提法、有機(jī)溶劑提取法、酶解法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、動(dòng)態(tài)高壓微射流輔助法、微波-超聲波協(xié)同輔助法、超聲-酶協(xié)同輔助法、超聲耦合雙水相法、微波協(xié)同雙水相法、超臨界流體萃取法和離子液體提取法等，各提取方法的原理、應(yīng)用實(shí)例和優(yōu)缺點(diǎn)如表1 所示。其中以乙醇為溶劑的有機(jī)溶劑提取法使用范圍最廣，輔以超聲波和微波協(xié)同使用，可以有效利用3種方法的優(yōu)勢，彌補(bǔ)單一提取方法的不足，提高甘薯莖葉多酚類物質(zhì)的提取率。因此，不同提取方法的協(xié)同使用是未來甘薯莖葉多酚類物質(zhì)提取的發(fā)展方向。

1.2 甘薯莖葉多酚類物質(zhì)的分離純化

目前甘薯莖葉多酚類物質(zhì)分離純化方法主要包括有機(jī)溶劑萃取法、大孔樹脂吸附法、柱層析法、凝膠色譜法、高速逆流色譜法和高效液相色譜法，各純化方法的原理、應(yīng)用實(shí)例和優(yōu)缺點(diǎn)如表2 所示。其中大孔樹脂吸附分離法因操作簡單、綠色環(huán)保，適合產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)，在分離純化甘薯莖葉多酚類物質(zhì)方面應(yīng)用最廣泛。

表1 甘薯莖葉多酚類物質(zhì)的提取方法Table 1 The extraction methods of sweet potato leaf polyphenols

表1(續(xù))

表2 甘薯莖葉多酚類物質(zhì)的分離純化的方法Table 2 The separation and purification methods of sweet potato leaf polyphenols

2 甘薯莖葉多酚類物質(zhì)的組分構(gòu)成

多酚類物質(zhì)是指分子結(jié)構(gòu)中含有芳香結(jié)構(gòu)和一個(gè)或多個(gè)羥基的化合物。甘薯莖葉多酚類物質(zhì)主要由酚酸類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)組成。酚酸類物質(zhì)以自由或結(jié)合形式存在，通過酯、醚或乙酸鍵與其他組分相連。目前甘薯莖葉中已發(fā)現(xiàn)的酚酸類物質(zhì)有42 種，各物質(zhì)的名稱、化學(xué)式、相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)式如表3 所示。黃酮類物質(zhì)都具有2-苯基氧雜萘的母核結(jié)構(gòu)，即按C6-C3-C6 結(jié)構(gòu)排列的三環(huán)組成，芳香環(huán)A 和芳香環(huán)B 通過3C 橋連接。目前甘薯莖葉中已發(fā)現(xiàn)的黃酮類物質(zhì)有42 種，各物質(zhì)的名稱、化學(xué)式、相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)式如表4 所示。

表3 甘薯莖葉中已發(fā)現(xiàn)的酚酸類物質(zhì)Table 3 The phenolic acid composition of sweet potato leaves

表3(續(xù))

表3(續(xù))

表4(續(xù))

表4(續(xù))

表4(續(xù))

3 甘薯莖葉多酚類物質(zhì)降血糖活性研究進(jìn)展

甘薯莖葉多酚類物質(zhì)具有良好的降血糖活性，能有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，改善HepG2 肝癌細(xì)胞胰島素抵抗模型糖異生代謝，改善3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)和2 型糖尿病動(dòng)物模型的狀態(tài)。

3.1 體外試驗(yàn)

α-葡萄糖苷酶是分布在人體和動(dòng)物小腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜表面的碳水化合物酶，主要功能是在碳水化合物水解的最后階段，催化低聚糖水解成人體和動(dòng)物可吸收的葡萄糖。當(dāng)小腸中的α-葡萄糖苷酶活性被抑制時(shí)，碳水化合物的水解速率下降，從而降低腸道對(duì)葡萄糖的吸收，達(dá)到降低餐后血糖水平的目的。劉冉等[56]通過比較7 個(gè)品種甘薯葉多酚提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性存在劑量依賴關(guān)系，商薯19 和蘇薯8 多酚提取物的抑制作用分別是陽性對(duì)照阿卡波糖的3.39 和1.86倍。Peng 等[57]研究了甘薯莖葉黃酮單體山奈酚對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用及其機(jī)制，結(jié)果表明山奈酚抑制α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制率(50% inhibitory concentration，IC50)是1.16×10-5mol·L-1，其效果是陽性對(duì)照阿卡波糖的17.24 倍，并認(rèn)為其機(jī)制是山奈酚能與位于α-葡萄糖苷酶活性位點(diǎn)內(nèi)的一些氨基酸殘基相互作用，占據(jù)酶的催化中心，能避免底物對(duì)硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷結(jié)合，從而抑制酶活性。Zhang等[58]從甘薯莖葉中分離出15 種多酚單體并分別研究其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，結(jié)果表明15 種多酚單體對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制的強(qiáng)弱順序?yàn)?反式-N-(對(duì)-香豆?；?酪胺＞3，4，5-triCQA＞順式-N-阿魏酰酪胺＞順式-N-氟乙胺＞槲皮素-3-O-葡萄糖苷＞7-羥基-5-甲氧基香豆素＞4，5-CQA＞3，4-CQA＞3，5-CQA＞4，5-阿魏酰奎寧酸＞咖啡酸乙酯＞鼠李黃素＞咖啡酸＞7，30-二甲基槲皮素=吲哚-3-甲醛。Zeng 等[59]研究了甘薯莖葉多酚單體芹菜素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性和抑制動(dòng)力學(xué)，結(jié)果表明芹菜素對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50為2.75×10-4mol·L-1，其抑制作用顯著高于陽性對(duì)照阿卡波糖(IC50=4.02×10-4mol·L-1)，抑制類型為非競爭型可逆抑制。Zengin 等[47]通過索氏抽提法提取的甘薯莖葉中綠原酸類物質(zhì)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用為陽性對(duì)照阿卡波糖的4.60 倍。這些研究表明甘薯莖葉多酚類物質(zhì)能明顯抑制α-葡萄糖苷酶活性，延緩餐后血糖水平的升高，其作用機(jī)制已被初步闡明，有望在降血糖藥物的研發(fā)中得到廣泛重視和應(yīng)用。

肝臟是機(jī)體葡萄糖代謝中心，對(duì)體內(nèi)葡萄糖水平的調(diào)節(jié)有著非常重要的作用。HepG2 肝癌細(xì)胞有正常糖代謝功能，易于培養(yǎng)，繁殖較快，在胰島素、高糖或地塞米松等外界條件誘導(dǎo)下，形成HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗模型，用于研究胰島素信號(hào)通路，篩選改善胰島素抵抗的物質(zhì)[60]。Eid 等[61]采用甘薯莖葉多酚中存在的黃酮單體槲皮素處理HepG2 肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)槲皮素可使其細(xì)胞內(nèi)的糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK-3)磷酸化，保持糖原合成酶(glycogen synthase，GS)的活性，加快葡萄糖轉(zhuǎn)化成糖原，減少肝糖原異生，對(duì)肝臟中的糖代謝有積極作用，可用于治療2 型糖尿病。Chen 等[62]發(fā)現(xiàn)甘薯莖葉多酚中存在的酚酸單體綠原酸和咖啡酸能減弱胰島素抵抗并調(diào)節(jié)HepG2 細(xì)胞中的葡萄糖攝取，改善其胰島素敏感性，保持PI3K/AKT 信號(hào)通路(絲氨酸/蘇氨酸激酶)能正常傳遞胰島素信號(hào)，調(diào)節(jié)葡萄糖的代謝，從而預(yù)防或治療肝功能障礙。以上研究證實(shí)甘薯莖葉多酚類物質(zhì)能改善HepG2 肝癌細(xì)胞胰島素抵抗模型的胰島素敏感性，初步闡明其作用機(jī)制是通過控制相關(guān)肝糖原代謝酶的合成實(shí)現(xiàn)的，但具體的作用機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系仍需進(jìn)一步探究。

脂肪能在葡萄糖供應(yīng)不足的情況下分解供能。3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞是一種前脂肪細(xì)胞，可誘導(dǎo)分化成成熟的脂肪細(xì)胞，通過胰島素、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)或白細(xì)胞介素(interleukin，IL)等外界條件誘導(dǎo)形成3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞胰島素抵抗模型，用于研究胰島素信號(hào)通路，篩選改善胰島素抵抗的物質(zhì)。Lee 等[63]研究了紫甘薯莖葉的沸水提取物對(duì)體外3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞的細(xì)胞增殖和脂肪生成的影響，結(jié)果表明紫甘薯莖葉沸水提取物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用呈劑量依賴性，使前脂肪細(xì)胞時(shí)期的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)失活，導(dǎo)致分化的脂肪細(xì)胞中脂肪含量減少，其機(jī)制可能是紫甘薯莖葉沸水提取物中的多酚在細(xì)胞分化期間下調(diào)了細(xì)胞內(nèi)的CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins，C/EBPs)和甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBP-1)等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，從而抑制脂肪的生成。Lee 等[64]發(fā)現(xiàn)紫甘薯莖葉沸水提取物中的多酚不僅會(huì)導(dǎo)致分化后的3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞凋亡，還會(huì)增加切割型半胱天冬酶(cleaved caspase-3)和多聚ADP 核糖聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase，PARP]的表達(dá)，誘導(dǎo)分化后的3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞中IL-6 和TNF-α基因表達(dá)下調(diào)。Lee 等[65]測定紫甘薯莖葉正丁醇粗提物對(duì)3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞葡萄糖攝取的影響，結(jié)果表明提取物中的槲皮素、槲皮素3-Oβ-D-槐糖苷、芐基β-D-葡萄糖苷、4-羥基-3-甲氧基苯甲醛和癸酸甲酯能通過激活脂肪細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4，Glut4)和調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶和PI3K/AKT 途徑增加對(duì)葡萄糖的攝取，產(chǎn)生降血糖作用。國內(nèi)外關(guān)于甘薯莖葉多酚類物質(zhì)對(duì)3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞胰島素抵抗模型的作用效果及機(jī)制研究較少，尤其是缺乏各類甘薯莖葉多酚單體對(duì)該模型作用效果及其構(gòu)效關(guān)系的研究，未能為降血糖活性研究提供充足的理論支撐。

此外，Toong 等[66]通過體外模擬胃腸消化模型來評(píng)估甘薯莖葉綠原酸類物質(zhì)對(duì)淀粉消化的抑制作用，結(jié)果表明純度為45.2%的甘薯莖葉綠原酸類物質(zhì)在體外消化模型中能抑制淀粉的消化，調(diào)節(jié)葡萄糖的釋放，對(duì)淀粉消化的IC50為4.91 mg·mL-1。Lin 等[67]研究了甘薯莖葉70%乙醇提取物對(duì)FL83B 肝細(xì)胞葡萄糖攝取能力的影響，結(jié)果表明甘薯莖葉提取物能改善FL83B 肝細(xì)胞的胰島素抵抗，細(xì)胞中的胰島素受體-1和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2 的表達(dá)水平顯著增加，其作用機(jī)制可能是甘薯莖葉提取物中的多酚、黃酮和花青素通過激活胰島素信號(hào)傳導(dǎo)改善TNF-α 誘導(dǎo)的胰島素抵抗，從而導(dǎo)致葡萄糖攝取增加。以上體外試驗(yàn)均說明甘薯莖葉多酚類物質(zhì)具有良好的降血糖活性。

3.2 動(dòng)物試驗(yàn)

體外試驗(yàn)對(duì)甘薯莖葉多酚類物質(zhì)的降血糖活性評(píng)估方便快速，成本較低，但人體是一個(gè)復(fù)雜的三維有機(jī)體，因此甘薯莖葉多酚類物質(zhì)降血糖活性的動(dòng)物模型驗(yàn)證必不可少。目前廣泛應(yīng)用的模型是誘導(dǎo)型2 型糖尿病動(dòng)物模型，即通過物理化學(xué)或生物手段損傷動(dòng)物的胰島，模擬胰島素分泌的減少，再輔以高糖高脂飼料，使外周組織對(duì)胰島素敏感度下降，進(jìn)而建立2 型糖尿病動(dòng)物模型[68-69]。Nagamine 等[70]用甘薯莖葉60%乙醇提取物飼喂2 型糖尿病小鼠，5 周后顯著降低了小鼠的血糖水平，其作用機(jī)制為甘薯莖葉中的綠原酸類物質(zhì)刺激小鼠體內(nèi)的胰高血糖素樣肽-1(glucagonlike peptide-1，GLP-1)的分泌，從而促進(jìn)胰島素分泌，降低餐后血糖水平。Chang 等[71]研究了咖啡酸對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的高血糖大鼠碳水化合物代謝的影響，結(jié)果表明咖啡酸能顯著降低大鼠的血糖和胰島素水平，并減輕了胰島素抵抗作用，其機(jī)制是咖啡酸增加了胰島素受體、磷脂酰肌醇-3-激酶和胰島素降解酶等胰島素信號(hào)相關(guān)蛋白的表達(dá)。Ogunrinola 等[72]探討了甘薯莖葉多酚提取物對(duì)四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖、肝酶，轉(zhuǎn)錄蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)以150 mg·kg-1體重灌胃給藥14 d 能顯著降低大鼠血糖水平，并降低堿性磷酸酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性，增加相關(guān)轉(zhuǎn)錄蛋白的含量，表明甘薯莖葉多酚提取物無毒，且具有抗糖尿病特性。Vivek 等[73]研究了桑色素在調(diào)節(jié)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2 型糖尿病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用，結(jié)果表明桑色素能與蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶

(protein kinase RNA like endoplasmic reticulum kinase，PERK)相互作用，下調(diào)PERK-eIF2α-ATF4 途徑，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的還原環(huán)境，通過抑制PERK 依賴性促凋亡蛋白的表達(dá)來預(yù)防細(xì)胞死亡，由此證實(shí)了桑色素在高血糖誘導(dǎo)的糖代謝異常和肝損傷中的作用，可用于靶向治療高血糖導(dǎo)致的肝損傷。目前國內(nèi)外研究均表明甘薯莖葉多酚類物質(zhì)對(duì)2 型糖尿病動(dòng)物模型具有明顯的改善作用，繼續(xù)完善各類甘薯莖葉多酚單體的體內(nèi)降血糖活性研究，闡明其作用機(jī)制，將會(huì)促進(jìn)甘薯莖葉多酚類物質(zhì)在食品和醫(yī)療保健領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用。

4 結(jié)語

綜上所述，甘薯莖葉富含多酚類物質(zhì)，國內(nèi)外關(guān)于甘薯莖葉多酚類物質(zhì)提取、分離純化、組分構(gòu)成等方面的研究日趨成熟，通過體外試驗(yàn)和動(dòng)物試驗(yàn)已證明甘薯莖葉多酚類物質(zhì)具有良好的降血糖活性。然而隨著研究的不斷深入和市場天然降血糖藥物的迫切需求，有些方面仍有提升的空間:1)甘薯莖葉多酚類物質(zhì)不同組分間降血糖活性的差異性，以及各組分對(duì)α-葡萄糖苷酶模型、HepG2 肝癌細(xì)胞胰島素模型和3T3-L1 脂肪前體細(xì)胞胰島素抵抗模型的作用機(jī)制及構(gòu)效關(guān)系亟待深入研究；2)甘薯莖葉多酚類物質(zhì)體內(nèi)降血糖活性的作用機(jī)制亟待闡明；3)甘薯莖葉多酚類物質(zhì)在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)應(yīng)用途徑有待進(jìn)一步拓寬。