一株紅霉素降解菌的篩選、鑒定與降解特性

許雙燕，張 濤，張 成，2，林 輝，水賢磊，鄭華寶，2，*

(1.浙江農(nóng)林大學 環(huán)境與資源學院，浙江 杭州 311300； 2.浙江省土壤污染生物修復重點實驗室，浙江 杭州 311300； 3.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 環(huán)境資源與土壤肥料研究所，浙江 杭州 310021)

抗生素是一種低到中分子量的化合物，具有多種化學和生物學特性，可用來治療細菌感染?？股噩F(xiàn)已廣泛應用于規(guī)模化畜禽養(yǎng)殖，包括四環(huán)素類[1]、磺胺類[2]、氟喹諾酮類[3]、大環(huán)內(nèi)酯類[4]、氨基類等[5]。我國每年約生產(chǎn)21萬t抗生素，約占世界總量的60%，涉及36種抗生素化合物，其中過半的抗生素被用于養(yǎng)殖業(yè)。據(jù)報道，養(yǎng)殖業(yè)大約90%的抗生素都是在亞治療濃度下使用的，其中70%是為了預防疾病，30%是為了促進生長[6-7]。養(yǎng)殖業(yè)中過剩的抗生素主要通過排泄物、污水灌溉和污泥堆肥等途徑直接和間接地排放進入環(huán)境[8-10]。環(huán)境中的抗生素殘留不僅會改變環(huán)境微生物的群落結構和豐度，還會影響微生物群落的正常功能[11-12]。長期接觸低毒性和亞毒性的抗生素，可改變微生物生態(tài)，促進抗生素耐藥性細菌的發(fā)展和傳播[13-14]。另外，抗生素甚至可以通過食物鏈途徑直接威脅人類健康[15-16]。目前，環(huán)境中的抗生素微量污染、耐藥菌，及抗性基因的存在和傳播已經(jīng)演變成全球性問題。

當前，養(yǎng)殖業(yè)廢棄物資源化的過程中普遍采用好氧高溫堆肥、厭氧發(fā)酵等技術消減糞便中殘留的抗生素、病原菌和蟲卵。我國養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模普遍較小且分散，這就使得我國畜禽抗生素污染呈現(xiàn)出分布廣、易積累擴散和環(huán)境生態(tài)風險大的特點。如果養(yǎng)殖業(yè)廢棄物未能得到科學的處理，很容易造成大面積的農(nóng)業(yè)面源污染問題。

近年來，利用微生物降解抗生素的方法受到越來越多的關注[17-18]。紅霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有很強的抗菌作用，應用廣泛，而且是一種多組分抗生素，臨床上主要應用紅霉素A，其化學結構由具有14元環(huán)的紅霉內(nèi)酯(erythronolide)、脫氧氨基乙糖(desosamine)和紅霉糖(cladnose)3部分組成。紅霉素結構穩(wěn)定，很難通過水解或光解等自然降解途徑去除，易在環(huán)境中不斷積聚，達到一定濃度后會抑制植物生長，特別不利于農(nóng)作物的生長，甚至會影響農(nóng)作物的產(chǎn)量[19]。但因為紅霉素藥效好、成本低，現(xiàn)已廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。研究發(fā)現(xiàn)，在魚體組織中脫水紅霉素的殘留量明顯高于其他抗生素，其殘留質(zhì)量分數(shù)在9.8～20 ng·g-1，且在蝦塘底泥和水體中均存在一定比例的紅霉素耐藥細菌[20-21]。來自孟加拉國、印度、印度尼西亞等地的研究報告顯示，在海產(chǎn)養(yǎng)殖水中也可檢測到紅霉素，其質(zhì)量濃度達到180 ng·L-1[22]。在一些養(yǎng)殖場周圍和污水處理池中，紅霉素殘留的質(zhì)量濃度高達6 mg·L-1[23]。在自然界的生態(tài)系統(tǒng)中，微生物與微生物的相互作用和它們對有機污染物的共代謝，可加快或促進有機污染物的降解速度[24]；因此，利用微生物對各類有機污染物進行降解和轉(zhuǎn)化極具潛力。現(xiàn)有的處理工藝，如曝氣生物濾池[25]，只能消減廢水中的微量紅霉素，若要更有效地降解環(huán)境中的紅霉素殘留，還要依靠特定的微生物[26-27]。因此，生產(chǎn)中亟需篩選到可有效降解紅霉素的微生物，并投入使用。有研究發(fā)現(xiàn)，紅酵母屬的黏性紅圓酵母(Rhodotorulasp.)在適宜條件下對紅霉素的降解率可以達到100%[28]。但是，目前國內(nèi)外針對紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素造成的污染，篩選紅霉素降解菌進行治理的報道甚少，已經(jīng)報道的菌種資源也非常有限，極大地阻礙了紅霉素污染微生物修復技術的應用，也限制了對紅霉素降解酶、降解途徑等的闡明[28-29]。本研究以長期堆放雞糞的有機肥生產(chǎn)車間土壤為材料，經(jīng)多次馴化，篩選到一株能夠以紅霉素作為唯一碳源的高效降解菌株Ery-6，并對其降解特性進行系統(tǒng)研究，以期為紅霉素污染的微生物修復提供菌種資源，為闡明微生物降解紅霉素的分子機制提供物質(zhì)基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

UltiMate 3000型高效液相色譜儀(HPLC，美國賽默飛世爾公司)，配DAD(二極管陣列)檢測器；XTERRA RP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國Waters公司；UV-5100型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；THZ-98AB型搖床，上海一恒科學儀器有限公司；DHP-9082型恒溫培養(yǎng)箱，沙鷹科學(上海)儀器有限公司；YXQ-50SIⅠ型高壓滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；DS-5510DTH型超聲波清洗機，上海生析超聲儀器有限公司；Mini-15K型高速離心機，杭州奧盛儀器有限公司；YR-PTB型真空泵，上海亞榮生化儀器廠；0.22 μm針筒式微孔濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司。

紅霉素(純度98%)，上海源葉生物科技有限公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，德國Tedia公司；磷酸二氫銨(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司。其余化學藥品均為分析純試劑。試驗用水系由哇哈哈純凈水經(jīng)Milli-Q型超純水機(美國Millipore公司)制備的超純水(18.2 MΩ·cm)。

無機鹽液體培養(yǎng)基：NH4Cl 1 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，MgSO40.2 g，NaCl 1 g，微量元素溶液(每1 L溶液中含F(xiàn)eCl31.6 g、CoCl2·6H2O 0.1 g、MnCl2·4H2O 0.425 g、ZnCl20.05 g、NiCl2·6H2O 0.01 g、CuSO4·5H2O 0.015 g、H3BO30.05 g、Na2MoO4·2H2O 0.01 g、CaCl20.05 g)2 mL，加超純水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0，121 ℃滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株馴化、分離和純化

以Qian等[26]報道的浙江省有機肥中抗生素殘留現(xiàn)狀為依據(jù)，選擇浙江省德清縣某有機肥生產(chǎn)車間為紅霉素降解菌篩選來源，采集該有機肥生產(chǎn)車間內(nèi)長期堆放雞糞的場地土壤開展后續(xù)菌株馴化分離工作，具體步驟如下。在裝有100 mL無機鹽液體培養(yǎng)基的錐形瓶中加入10 g土壤，同時加入紅霉素50 mg·L-1、酵母膏0.2 g、葡萄糖0.1 g，30 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d；補加100 mg·L-1紅霉素，30 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d；補加100 mL無機鹽液體培養(yǎng)基和100 mg·L-1紅霉素，30 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d；補加100 mg·L-1紅霉素，30 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 d。經(jīng)過4輪馴化后的菌液，以10%的接種量接入裝有5 mL無機鹽液體培養(yǎng)基的試管中，并以梯度壓力式馴化法繼續(xù)馴化，紅霉素質(zhì)量濃度依次為100、200、300、400、500、600、800、900、1 000 mg·L-1，以紅霉素為唯一碳源，在30 ℃、120 r·min-1條件下避光培養(yǎng)48 h。取馴化后的菌液，接種于含有對應紅霉素質(zhì)量濃度的無機鹽固體培養(yǎng)基，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)48 h，觀察生長情況，挑取單菌落，接種至含1 000 mg·L-1紅霉素的無機鹽固體培養(yǎng)基，經(jīng)過4次分離純化，得到純培養(yǎng)的菌株。

1.2.2 菌株鑒定

觀察菌落形態(tài)，包括菌株在平板上生長的形態(tài)、光澤、大小等。挑取對數(shù)生長期的菌株，送至浙江省農(nóng)業(yè)科學院測試中心進行電子顯微鏡觀察，對菌株個體形態(tài)做進一步完善。同時，挑取對數(shù)期菌株進行16S rDNA基因序列分析，以細菌總DNA為模版，利用細菌16S rDNA通用引物(正向引物27F，5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′；反向引物1492R，5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)進行PCR擴增。反應體系25 μL：模版DNA 2 μL，通用引物27F和1492R各5 μL，Taq酶 0.2 μL，10×TaqBuffer緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，dNTPs(各2.5 mmol·L-1)2 μL，ddH2O 8.3 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至有康生物工程有限公司進行測序。將所得序列通過BLAST程序與GenBank中的已知序列進行同源性分析比較，確定與該紅霉素降解菌同源程度最高的序列?；讷@得的該菌株的16S rDNA片段序列(1 392 bp)，利用Mega 7.0軟件對該菌株及其近緣屬種進行遺傳距離分析，采用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.3 生長曲線與菌體對紅霉素吸附量的測定

將分離純化后的菌株接種至含100 mg·L-1紅霉素的無機鹽液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min-1條件下進行培養(yǎng)，于不同時間取樣，采用分光光度法在600 nm波長下測定菌液的D600值，確定菌株的生長曲線。將菌株滅活后，加入含100 mg·L-1紅霉素的無機鹽液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)6 h，分別在0、6 h測定紅霉素含量，以確定菌株本身對紅霉素的吸附量。

需指出，并非所有乘坐慢車的乘客均會延誤時間，僅為越過慢車待避車站的乘客才會延誤時間(約3 min)。被耽擱的客流量可由到達避讓站前的區(qū)間斷面流量減去避讓站的下客量得出。以遠期早高峰為例，根據(jù)運行圖鋪畫結果顯示，遠期早高峰慢車需在白芒站、羅租站、同觀路站、東周路站、長春北站待避，每趟慢車在上述避讓站待避的概率為1/3，遠期早高峰慢車效益預測如表4所示[3]。由表4可知，遠期早高峰慢車延誤時間約3 276.5 h。按照上述方法計算，遠期晚高峰、平峰延誤時間分別增加2 967.35 h、12 337 h，可得到慢車全日延誤時間為1.86萬h。

1.2.4 菌株對紅霉素的降解特性分析

采用單因素試驗，將分離純化后的菌株按照5%(體積分數(shù))的接種量接種于含有不同質(zhì)量濃度(分別設置10、50、100、200、400、800、1 000 mg·L-1和10、30、50、70、90、110 mg·L-12個區(qū)間)紅霉素、溫度(20、25、30、35、40、45 ℃)、轉(zhuǎn)速(100、120、140、160、180、200 r·min-1)、pH值(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)、外加碳氮源(50 mg·L-1的葡萄糖、蔗糖、酵母膏或蛋白胨)、金屬離子(10 mg·L-1的Fe3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+)等條件下進行培養(yǎng)，測定培養(yǎng)基中紅霉素的殘留量。每個處理均設置1個不接菌的對照和3個重復。

1.3 紅霉素含量檢測

紅霉素含量采用液相色譜法進行檢測，流動相A相為0.02 mol·L-1的pH值3.0的磷酸二氫銨、B相為乙腈，洗脫程序詳見表1，流速為1 mL·min-1，柱溫35 ℃，進樣量20 μL，檢測波長210 nm。根據(jù)構建的線性回歸方程測算樣品中紅霉素的含量，并采用以下公式計算紅霉素降解率：

降解率(%)=(對照樣品殘留量-試驗樣品殘留量)/對照樣品殘留量×100。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013和GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)整理和圖表繪制，應用SPSS 22.0進行單因素方差分析，對有顯著(P<0.05)差異的，采用最小顯著差法(LSD)進行檢驗。

表1 液相色譜測定紅霉素時的梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定

經(jīng)過多重馴化分離和富集篩選，得到一株能夠降解高濃度紅霉素的菌株Ery-6。其菌落形態(tài)(圖1-A)呈圓形，直徑2～3 mm，乳白色，不透明，表面光滑、濕潤，且邊緣整齊。在透射電鏡下觀察菌株形態(tài)(圖1-B)發(fā)現(xiàn)，該菌以鞭毛運動，無芽孢。該菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹如圖1-C所示。Ery-6與甲基菌屬(Methylobacillussp.)的模式菌株位于進化樹的同一類群，結果顯示，Ery-6與甲基菌屬菌株MethylobacillusflagellatusKT(NC 007947.1)的親緣關系最近。結合細菌表型特征，將菌株Ery-6鑒定為甲基菌屬。

2.2 Ery-6菌株的生長曲線及其對紅霉素的降解動力學

測定Ery-6菌株在含有100 mg·L-1紅霉素的無機鹽液體培養(yǎng)基中的生長曲線，結果如圖2-A所示，0～14 h為菌株的生長遲緩期，14～60 h菌株進入對數(shù)生長期，60 h后進入穩(wěn)定期。

Ery-6菌株對紅霉素的吸附試驗結果顯示，0 h液體培養(yǎng)基中的紅霉素質(zhì)量濃度為97.52 mg·L-1，6 h后紅霉素質(zhì)量濃度為96.08 mg·L-1。這說明，菌體本身對紅霉素的吸附量很少。在試驗條件下，Ery-6菌株對紅霉素的降解動力學曲線如圖2-B所示。菌株對紅霉素的降解率隨培養(yǎng)時間延長而增加，在0～48 h快速增長，最大降解率達74.10%，之后趨于平穩(wěn)。采用準一級動力學方程擬合接菌和不接菌條件下的紅霉素降解過程(表2)，決定系數(shù)(R2)均在0.9以上，說明擬合度較好。從擬合結果看，紅霉素的自然降解較弱，接種Ery-6菌株可大幅提高紅霉素的降解速率，使其半衰期縮短一半以上。

圖1 Ery-6的菌落形態(tài)(A)、透射電鏡圖(B)和系統(tǒng)發(fā)育樹(C)Fig.1 Colony morphology (A)， transmission electron microscopy (B) and phylogenetic tree (C) of Ery-6 strain

2.3 環(huán)境因素對Ery-6菌株降解紅霉素的影響

2.3.1 紅霉素質(zhì)量濃度

將Ery-6菌株按照5%(體積分數(shù))的接種量接種于含有不同質(zhì)量濃度紅霉素(底物)的無機鹽液體培養(yǎng)基中，設置初始條件為30 ℃、pH 7.0、120 r·min-1，振蕩培養(yǎng)48 h。如圖3所示，當紅霉素質(zhì)量濃度為90～200 mg·L-1時，菌株對紅霉素的降解效果最明顯。在該范圍內(nèi)，菌株的D600值均大于1，當紅霉素的質(zhì)量濃度過低或過高時均會抑制菌株的生長。測算單位菌量對紅霉素的去除量，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度紅霉素條件下相差不大。這說明，在一定程度上，不同質(zhì)量濃度的紅霉素是通過影響菌體生長從而影響紅霉素降解的。當紅霉素質(zhì)量濃度達到1 000 mg·L-1時，紅霉素降解率為31.95%，說明Ery-6菌株可以在高濃度紅霉素條件下生存，并產(chǎn)生可觀的降解效果。

Ct/C0為t時體系中紅霉素質(zhì)量濃度與初始紅霉素質(zhì)量濃度之比。CK為不加菌的對照。Ct/C0 was the ratio of erythromycin concentration at t time to the initial concentrution.CK, Control withow Ery-6 strain inoculation.圖2 Ery-6菌株的生長曲線(A)和對紅霉素的生物降解動力學曲線(B)Fig.2 Growth curve (A) and biodegradation kinetic curve (B) of Ery-6 strain

表2 紅霉素降解的動力學方程與動力參數(shù)

圖3 初始紅霉素質(zhì)量濃度對Ery-6菌株降解紅霉素的影響Fig.3 Effect of initial erythromycin concentration on erythromycin degradation by Ery-6 strain

2.3.2 溫度

按照5%(體積分數(shù))的接種量將菌株接種到含100 mg·L-1紅霉素的無機鹽液體培養(yǎng)基中，在pH 7.0、120 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)48 h。如圖4所示，菌液的D600與紅霉素降解率變化趨勢相近。當溫度為30～35 ℃時，菌液的D600在1以上?？偟膩砜矗摼曜钸m宜生長的溫度為35 ℃。在此條件下，紅霉素降解率為79.59%。測算單位菌量對紅霉素的去除量可知，當溫度在30 ℃以上時，紅霉素降解率受菌體生長量的影響較大；在20～25 ℃，菌液的D600值較低，但紅霉素降解率卻能達到65%左右，說明此時菌的生長情況對降解率的影響較小。

圖4 溫度對Ery-6菌株降解紅霉素的影響Fig.4 Effect of temperature on erythromycin degradation by Ery-6 strain

2.3.3 轉(zhuǎn)速

將Ery-6菌株按照5%(體積分數(shù))的接種量接種于含有100 mg·L-1紅霉素的無機鹽液體培養(yǎng)基中，在最適溫度35 ℃，pH 7.0的條件下按照不同的搖床轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)48 h。如圖5所示，發(fā)現(xiàn)紅霉素降解率變化與菌株的生長量曲線趨同，各轉(zhuǎn)速下單位菌量對紅霉素的去除量相近，說明轉(zhuǎn)速通過影響菌的生長情況而作用于紅霉素降解率。當轉(zhuǎn)速為120 r·min-1時，菌液的D600值最大，紅霉素降解率最高(79.17%)。

2.3.4 初始pH值

按照5%(體積分數(shù))的接種量將菌株接種到含100 mg·L-1紅霉素的無機鹽液體培養(yǎng)基中，在最適溫度35 ℃和最適轉(zhuǎn)速120 r·min-1的條件下，調(diào)節(jié)pH值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，振蕩培養(yǎng)48 h。如圖6所示，當初始pH值為5.5～7.5時，該菌株均能有效降解紅霉素，且降解效果以中性條件下最佳，降解率達79.91%。此時，菌株的生長量也最大。當初始pH值低于5.5時，菌液的D600值小于0.4，說明菌株生長受到抑制，但此時紅霉素仍有一定的降解率。推測是因為紅霉素偏堿性，遇酸易分解。Ery-6菌株對堿性環(huán)境較敏感，當初始pH值為8.5時，菌株幾乎不生長，對紅霉素的降解率也僅為7.32%。

圖5 轉(zhuǎn)速對Ery-6菌株降解紅霉素的影響Fig.5 Effect of rotation speed on erythromycin degradation by Ery-6 strain

圖6 初始pH值對Ery-6菌株降解紅霉素的影響Fig.6 Effect of initial pH on erythromycin degradation by Ery-6 strain

2.3.5 外加碳氮源

柱上無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。對照中不外源添加碳氮源。Bars marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as below. No exogenous carbon or nitrogen source was added in the control.圖7 外源添加碳氮源對Ery-6菌株降解紅霉素的影響Fig.7 Effect of exogenous carbon or nitrogen source on erythromycin degradation by Ery-6 strain

對照中不外源添加金屬離子。No exogenous metal ion was added in the control.圖8 外加金屬離子對Ery-6菌株降解紅霉素的影響Fig.8 Effect of exogenous metal ions on erythromycin degradation by Ery-6 strain

按照5%(體積分數(shù))的接種量將菌株接種到含100 mg·L-1紅霉素的無機鹽液體培養(yǎng)基中，向培養(yǎng)基中分別加入50 mg·L-1的葡萄糖、蔗糖、酵母膏、蛋白胨作為外加碳氮源，在35 ℃、pH 7.0、120 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)，48 h后測定紅霉素含量。由圖7可知，添加不同碳氮源對紅霉素的降解率有顯著影響，含有蔗糖或酵母膏的處理的紅霉素降解率顯著(P<0.05)高于不外源添加碳氮源的對照。當外源添加蔗糖時，紅霉素降解率最高，達到88.68%。同時，菌液的D600值達到1.4，高于對照。測算單位菌量的紅霉素去除率可知，外源添加適宜的碳氮源不僅有利于Ery-6菌株的生長，還能提高菌株對紅霉素的降解率。

2.3.6 外加金屬離子

將Ery-6菌株按照5%(體積分數(shù))的接種量接種于含有100 mg·L-1紅霉素的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于35 ℃、pH 7.0、120 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)48 h。如圖8所示，除Cu2+外，其他外加金屬離子對Ery-6菌株降解紅霉素無顯著影響，說明該菌株的耐受性較強。測算單位菌量對紅霉素的去除量可知，除Zn2+和Cu2+對紅霉素降解產(chǎn)生直接影響外，其他金屬離子均通過抑制菌的生長從而降低紅霉素去除量。同時，Cu2+還能顯著抑制Ery-6的生長，從而對該降解菌降解紅霉素的效果產(chǎn)生較大影響。

3 討論

目前，國內(nèi)外關于微生物降解紅霉素的研究較少，已篩選到的紅霉素降解菌有紅酵母屬(Rhodotorulasp.)[28]、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)[29]、克雷伯氏菌屬(Klebsiellasp.)、氨基酸球菌屬(Acidaminococcussp.)和變形菌屬(Proteussp.)[30]等。本研究首次發(fā)現(xiàn)甲基菌屬(Methylobacillussp.)菌株有紅霉素降解能力。在適宜條件下，Ery-6菌株對于100 mg·L-1的紅霉素在48 h內(nèi)降解率可達88.68%。

目前，關于抗生素在堆肥過程中的降解研究主要集中在抗生素的降解動力學，以及在抗生素污染環(huán)境中分離抗生素降解菌等方面[31]。據(jù)報道，牛糞堆肥過程中最高溫度可達到50 ℃以上[32]。污泥堆肥物料中，氟喹諾酮類抗生素(FQs)在中溫期(35 ℃)物料中的去除率為38.43%，但在高溫期(50 ℃)物料中的去除率僅為29.97%[33]。溫度被普遍認為是影響抗生素降解的主要因素[34]。由此推測，抗生素降解菌能耐受的溫度越高，越有利于菌種的投入使用。在已報道的紅霉素降解菌中，大多數(shù)菌株的適宜溫度在20～30 ℃[28-29]。毛菲菲等[29]篩選到的惡臭假單胞菌在30 mg·L-1的初始紅霉素濃度下培養(yǎng)5 d，降解率為76.6%，但該菌不能適應高溫環(huán)境，當溫度高于35 ℃時便難以生長。本研究中，Ery-6菌株可在45 ℃的環(huán)境中生長，且48 h內(nèi)對100 mg·L-1紅霉素的降解率仍可達到45.11%，推測其在高溫堆肥領域頗具應用潛力。

酶促反應，即微生物本身所固有的或經(jīng)誘導產(chǎn)生的某些酶可使相應的抗生素失活[35]，是微生物降解抗生素的主要機理之一。本研究中，外源添加Cu2+的反應體系中，Ery-6菌株的生長受到一定程度的抑制，但紅霉素降解率仍達到60%左右，推測Cu2+只是對菌株本身的生長產(chǎn)生了一定的消極影響，但并沒有完全抑制菌株固有的或經(jīng)誘導產(chǎn)生的某種酶的降解作用。Wondrack等[36]發(fā)現(xiàn)一株金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的酯酶能使14、16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素失活。Kim等[37]從一株假單胞菌分離純化到一種相對分子質(zhì)量為51 200 u的紅霉素酯酶。微生物在生長過程中會產(chǎn)生各種酶，在這些酶的作用下，經(jīng)過一系列的生理生化反應，最終可將抗生素完全降解或分解成分子量較小的無抗菌活性或抗菌活性較小的化合物。周顯勇等[38]發(fā)現(xiàn)，Zn、Cd、Pb等重金屬和大部分抗生素的含量都與土壤細菌、脲酶和磷酸酶活性呈負相關關系，復合污染會抑制土壤的生物活性。但也有研究發(fā)現(xiàn)，強力霉素(DOX)和Cu復合污染對脲酶活性表現(xiàn)出促進作用，對蔗糖酶、過氧化氫酶活性則表現(xiàn)出抑制作用[39]。以上結果說明，復合污染可能會對土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生較為復雜的影響。本試驗結果顯示，多種金屬離子對Ery-6菌株降解紅霉素的能力無顯著影響，該菌株對多種金屬離子具有較好的耐受性，可以較好地緩解復合污染給酶活帶來的負面效應。鑒于目前環(huán)境中大多數(shù)抗生素污染發(fā)生的同時，也都伴隨著重金屬污染[38]，且重金屬種類豐富[40]，預計該菌株在此方面的應用頗具優(yōu)勢。

本研究發(fā)現(xiàn)，反應體系的溫度、初始pH值對該菌降解紅霉素的影響較明顯。適宜的pH條件下，Ery-6菌株生長迅速，可能與菌體內(nèi)降解紅霉素的酶系活力有關[41]。總體來看，Ery-6菌株對溫度、pH和金屬離子等都具有較廣泛的耐受能力，這可能與該菌的理化性質(zhì)和結構相關[42]。試驗結果表明，當Ery-6菌株以紅霉素為唯一碳源生長時，能有效降解紅霉素。當紅霉素質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時，最佳降解條件為溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速120 r·min-1、初始pH值7.0，反應48 h的降解率為79.91%。

Fan等[43]研究發(fā)現(xiàn)，污水中紅霉素的生物降解有賴于外加碳氮源，認為紅霉素的生物降解屬于共代謝機制。共代謝是指，一些難降解有機物需要在微生物從其他底物獲取碳源和能源的過程中被降解[44]。本研究以50 mg·L-1的蔗糖作為外加碳源時，Ery-6菌株48 h對紅霉素的降解率可達88.68%，對紅霉素的降解效果大幅提高，推測其對紅霉素的降解也存在共代謝機制。

本研究采用梯度式壓力馴化法，從長期堆放雞糞的有機肥生產(chǎn)車間土壤中篩選到一株能夠有效降解紅霉素的菌株Ery-6。該菌株對環(huán)境的適應能力優(yōu)于普通菌株。目前，已報道的紅霉素降解菌大多對紅霉素的耐受濃度不高，而本研究得到的Ery-6菌株可以在以高濃度紅霉素為唯一碳源的環(huán)境中生長，在最佳降解條件(35 ℃、pH 7.0、120 r·min-1)下，降解菌對于質(zhì)量濃度高達1 000 mg·L-1的紅霉素，降解率仍可達31.95%。綜上，該菌株可望應用于紅霉素制藥廠等具有高濃度紅霉素污染的環(huán)境治理當中。

致謝：感謝浙江農(nóng)林大學環(huán)境與資源學院章海波教授提供液相色譜并指導檢測，感謝中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所李兆君研究員對試驗的指導。