異花授粉對柚果實代謝產(chǎn)物的影響及其與內(nèi)裂的關(guān)系

劉冬峰 林紹生 陳 巍 朱祝軍 宋 洋 郭秀珠 李發(fā)勇

(1浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005；2江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400，3 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300)

裂果是柚果實發(fā)育過程中重要的生理病害，主要分外裂和內(nèi)裂兩種類型[1]。外裂是從果頂開始沿果實縱向由外向內(nèi)開裂，開裂果實裂口較大，喪失商品性；內(nèi)裂是果實囊瓣在腹線處開裂，主要是種子敗育后果皮、囊瓣、中心柱生長不協(xié)調(diào)導(dǎo)致，內(nèi)裂果實外觀表現(xiàn)正常，但易枯水?；痆2-3]。前人關(guān)于多種果實的研究表明，裂果與果肉、果皮中的代謝物含量變化密切相關(guān)。隨著果實發(fā)育，果肉中可溶性糖、有機酸等物質(zhì)含量增加，果肉薄壁細胞滲透勢降低、吸水能力增強[4-6]，而果皮中不溶性果膠逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄怨z使果皮韌性降低[7-8]，果肉、果皮生長不協(xié)調(diào)導(dǎo)致裂果[9-11]。

異花授粉是減輕柚裂果的有效措施，其作用機制可能與花粉直感效應(yīng)有關(guān)[12-13]。異花授粉后，由于花粉直感現(xiàn)象，雜交當代果實在生長發(fā)育和品質(zhì)形成過程中發(fā)生明顯變異[14-16]。柑橘果實形狀、果皮厚度、種子數(shù)量及可溶性糖、有機酸、揮發(fā)性物質(zhì)等內(nèi)在品質(zhì)性狀均表現(xiàn)明顯的花粉直感效應(yīng)[17-19]。種子是花粉直感效應(yīng)的重要載體，前人研究認為父本花粉可通過種子影響果實組織從而引起果實性狀變異，種子合成的內(nèi)源激素、多胺等物質(zhì)可調(diào)節(jié)細胞代謝和果實發(fā)育過程，起到提高庫容、促進果實生長的作用[20]。柚異花授粉后產(chǎn)生大量飽滿種子，有研究認為大量種子排列在中心柱周圍，能夠緩沖汁胞發(fā)育產(chǎn)生的膨壓，起到保護中心柱的物理性作用，從而減輕果實內(nèi)裂[21]。但柚異花授粉果實種子數(shù)較多，導(dǎo)致商品性下降，而種子產(chǎn)生的內(nèi)源物質(zhì)對中心柱和汁胞發(fā)育的影響，以及汁胞代謝變化與果實內(nèi)裂的關(guān)系還有待進一步研究。本研究分析了早香柚果實種子數(shù)與內(nèi)裂的關(guān)系，利用氣相色 譜 -質(zhì) 譜 技 術(shù) ( gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)測定早香柚無籽內(nèi)裂果實和多籽不內(nèi)裂果實汁胞代謝組，從代謝組水平分析異花授粉對柚果實汁胞代謝產(chǎn)物的影響，以期為研究柚內(nèi)裂發(fā)生機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗在浙江省永嘉縣碧蓮鎮(zhèn)早香柚中心產(chǎn)區(qū)開展，樹齡25年，處于穩(wěn)定結(jié)果期?；ǚ蹃碜援?shù)胤N植的琯溪蜜柚，采集大蕾期花朵的花藥，利用白熾燈烘烤干燥的方法收集花粉。開花期，選取8 株正常早香柚結(jié)果樹，其中4 株進行異花授粉，另外4 株疏花后直接套袋作為對照。第二次生理落果后去除套袋，之后田間常規(guī)管理。根據(jù)前期研究結(jié)果，早香柚未授粉果實裂瓣在盛花后105 d 及其后1 個月內(nèi)發(fā)生并結(jié)束[22]，即8月中下旬至9月上旬為早香柚果實內(nèi)裂發(fā)生期。因此于早香柚內(nèi)裂起始期(8月20日)采集自花授粉的無籽內(nèi)裂果實和異花授粉的多籽不內(nèi)裂果實，采用GC-MS 方法檢測代謝產(chǎn)物，每個處理測定8 個樣本，分析兩組樣本的代謝產(chǎn)物差異。果實成熟后，采集自花授粉和異花授粉果實各100 個，自花授粉的無籽果實橫切后統(tǒng)計果實裂瓣數(shù)，剝?nèi)‘惢ㄊ诜酃麑嵉娘枬M種子，統(tǒng)計異花授粉果實種子數(shù)，并分析其與果實內(nèi)裂的關(guān)系。

1.2 樣本制備

代謝組樣品制備參照Lisec 等[23]的方法，稱取液氮研磨的果肉粉末30 mg 于1.2 mL 預(yù)冷甲醇中，渦旋10 s。加入60 μL 核糖醇(0.2 g·L-1)作為內(nèi)標，渦旋10 s，70℃超聲提取30 min。11 000×g離心10 min，取1 mL 上清液于離心管中，加入0.75 mL 氯仿(-20℃預(yù)冷)和1.5 mL 蒸餾水(4℃預(yù)冷)，渦旋30 s，3 000 ×g離心15 min。取上清液400 μL 于離心管中，氮氣吹干。加入50 μL 15 g·L-1甲氧基吡啶溶液，室溫反應(yīng)16 h，然后加入50 μL N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氯乙酰胺(含1%三甲基氯硅烷)，室溫反應(yīng)60 min，再于10 000×g條件下離心10 min。最后取90 μL 上清液進樣，檢測設(shè)備為Agilent 7890A/5975C 氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent 公司)，色譜柱為HP-5 MS 毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

1.3 GC/MS 分析

氣相色譜條件:分流進樣，進樣量1.0 μL，分流比10 ∶1。進樣口溫度280℃，離子源溫度250℃，接口溫度150℃。程序升溫，起始溫度40℃，保持6 min，以10℃·min-1升至300℃，保持6 min。載氣為氦氣，載氣流速1.0 mL·min-1。質(zhì)譜條件:電噴霧電離(ESI)源，電子能量為70 eV，全方式掃描，四級桿掃描范圍m/z 35～780。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將原始GC/MS 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成CDF 格式(Net Channel Definition Format)，利用XCMS 程序(www.bioconductor.org/)進行峰識別、峰過濾、峰對齊，通過手動提取任意質(zhì)量色譜峰進行驗證并確定XCMS 參數(shù)，除默認參數(shù)外還進行了如下調(diào)整:xcmsSet (fwhm=3，snthresh=3，mzdiff=0.5，step=0.1，steps=2，max=300)，retcor [method = obiwarp，plottype = c(deviation)]，bandwidth=2，minfrac=0.3。利用總和標準比(www.metaboanalyst.ca)方法對原始數(shù)據(jù)進行歸一化處理。對獲得的保留時間(retention time)、質(zhì)核比(m/z)、峰強(intensity)等信息的數(shù)據(jù)矩陣進行代謝物注釋，注釋所用數(shù)據(jù)庫為NIST 商業(yè)數(shù)據(jù)庫(NIST 2008)和Golm Metabolome Database(GMD)，大量物質(zhì)由于信號低或沒有數(shù)據(jù)庫收錄沒被注釋到。利用Simca-P 11.0 軟件進行主成分分析( principal component analysis，PCA)和偏最小二乘方-判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)，根據(jù)PLS-DA 變量對分組貢獻值(variable importance in the projection，VIP)大小(閾值＞1)和組間變化的顯著性(P＜0.05)篩選顯著差異代謝物，并進行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)化合物和代謝途徑注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 早香柚果實種子數(shù)與內(nèi)裂的關(guān)系

果實成熟期，調(diào)查種子數(shù)與果實內(nèi)裂的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)自花授粉的無籽果實全部內(nèi)裂，異花授粉果實內(nèi)裂率與種子數(shù)量有關(guān)。異花授粉果實種子數(shù)介于11 ～115粒之間，平均種子數(shù)為55 粒/果，種子數(shù)少于30 粒時內(nèi)裂率為100%，高于80 粒時中心柱充實、不內(nèi)裂，大部分異花授粉果實的種子數(shù)介于30 ～80 粒之間，所占比例為72.0%，其中內(nèi)裂率為51.4%(圖1)。早香柚自花授粉果實的裂瓣數(shù)多為2、3 瓣，占內(nèi)裂果實的57.2%，其次為1、4 瓣，裂瓣數(shù)超過5 瓣的果實較少(圖2)，且裂瓣多處于對稱位置，說明果實橫向生長拉力是果實中心柱開裂的直接原因。

2.2 GC-MS 數(shù)據(jù)多元變量分析

圖1 早香柚異花授粉果實種子數(shù)與內(nèi)裂的關(guān)系Fig.1 The relationship between seed numbers and fruit inner-cracking in cross-pollinated Zaoxiang pomelo

圖2 早香柚自花授粉果實裂瓣數(shù)Fig.2 The number of cracked-segments in self-pollinated Zaoxiang pomelo

利用Simca-P 11.0 軟件對所有樣本采用PCA 進行無監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析，樣品分型前首先對數(shù)據(jù)進行單位方差縮放(unit variance scaling，UV)，以獲得更加可靠直觀的效果。如PCA 得分圖(圖3-a)所示，所有樣本均處于95%置信區(qū)間內(nèi)，說明模型可用于數(shù)據(jù)分析。為篩選組間差異代謝物，用PLS-DA 進行有監(jiān)督的數(shù)據(jù)分析，并對模型的質(zhì)量用交叉驗證法進行檢驗，交叉驗證后得到的R2X(模型可解釋的變量)和Q2(模型的可預(yù)測度)對模型有效性進行評判。如PLS-DA 得分圖(圖3-b)所示，PLS-DA 模型可以很好地解釋兩組樣本間的差異。對PLS-DA 模型進行置換檢驗(permutation test)驗證模型是否過度擬合，得到PLS-DA 置換檢驗圖，100 次驗證結(jié)果顯示，R2 在Y 軸上的截距為0.343，Q2 在Y 軸上的截距為-0.289(圖4)。從各組的模型預(yù)測參數(shù)的R2X、R2Y、Q2Y 來看，上述評估模型是有效、可靠的，可用于差異變量篩選。

2.3 早香柚果實內(nèi)裂起始期代謝產(chǎn)物的鑒定

圖3 PCA 得分圖和PLS-DA 得分圖Fig.3 PCA score plot and PLS-DA score plot

圖4 PLS-DA 模型的置換檢驗圖Fig.4 PLS-DA permutation test graph

根據(jù)保留時間、質(zhì)核比和峰強矩陣進行代謝產(chǎn)物注釋，共鑒定到66 種代謝物，包括10 種氨基酸、29 種有機酸、17 種糖類物質(zhì)、8 種含氮化合物和2種其他物質(zhì)(表1)。在檢測到的333 個目標化合物中，大量物質(zhì)由于信號低或數(shù)據(jù)庫未收錄而沒有注釋到。采用PLS-DA 模型第一主成分的VIP 值(閾值＞1)結(jié)合S-plot 和t 檢驗的P值(P＜0.05)尋找差異代謝物。

2.4 異花授粉對早香柚果實代謝產(chǎn)物的影響

由表2 可知，果實內(nèi)裂起始期，在異花授粉果實中鑒定到12 種顯著差異的代謝產(chǎn)物，包括7 種有機酸(奎寧酸、琥珀酸、檸康酸等)、3 種含氮化合物(2-咪唑烷酮-4-羧酸、2-硫代巴比妥酸和2-羥基吡啶)和2種糖類物質(zhì)(阿拉伯糖和山梨醇)，其中阿拉伯糖和2-咪唑烷酮-4-羧酸含量顯著上升，奎寧酸、山梨醇等10種代謝物含量顯著下降。

表1 早香柚果實內(nèi)裂起始期代謝產(chǎn)物鑒定結(jié)果Table 1 Identified metabolites from Zaoxiang pomelo during initiation period of inner-cracking

表1(續(xù))

表2 早香柚異花授粉果實中顯著差異代謝物Table 2 Matebolites with significant difference in cross-pollinated Zaoxiang pomelo

2.5 異花授粉對早香柚果實代謝途徑的影響

從外觀上看，種子有無及多少是早香柚果實內(nèi)裂的重要影響因素。代謝物含量分析結(jié)果表明，異花授粉后果實中多個代謝途徑發(fā)生變化(圖5)。在鑒定到的10 種氨基酸中，9 種為呈味氨基酸[24]，包括5 種甜味氨基酸、3 種酸味氨基酸和1 種苦味氨基酸，其中甜味和苦味氨基酸的含量均有所增加，3 種酸味氨基酸中天冬氨酸和天冬酰胺含量增加、谷氨酸含量降低。在鑒定到的29 種有機酸物質(zhì)中，4 種有機酸參與莽草酸途徑及其下游次生代謝過程，4 種有機酸富集在三羧酸循環(huán)代謝通路上，其他大部分有機酸，包括還原糖氧化生成的糖酸、長鏈脂肪酸等含量有所增加。異花授粉后果實糖代謝也發(fā)生變化，蔗糖、果糖和葡萄糖3種主要糖分的含量下降，阿拉伯糖、甘露糖、蔗果三糖、核糖等含量有所增加。此外，在有籽果實中還發(fā)現(xiàn)腐胺、乙醇胺、碳二亞胺、咪唑衍生物、吡咯啉衍生物等含氮化合物含量增加。

圖5 異花授粉對早香柚果實代謝通路的影響Fig.5 The changes of main metabolic pathways in cross-pollinated Zaoxiang pomelo

3 討論

有些文旦系列柚類品種具有自交不親和、單性結(jié)實能力強的特性，所結(jié)的無籽果實存在較為嚴重的果實外裂或內(nèi)裂問題。前期研究發(fā)現(xiàn)早香柚自花授粉的無籽果實幾乎全部內(nèi)裂，而異花授粉的有籽果實內(nèi)裂指數(shù)顯著下降[22]，但受花期天氣及人工授粉技術(shù)的影響，授粉受精不良、果實種子數(shù)較少的果實內(nèi)裂現(xiàn)象仍然比較嚴重。本研究發(fā)現(xiàn)，早香柚果實內(nèi)裂與種子有無及多少密切相關(guān)，低于30 粒時內(nèi)裂率為100%，超過80 粒時果實中心柱充實、不內(nèi)裂，大部分異花授粉果實的種子數(shù)介于30 ～80 粒之間，其中內(nèi)裂果實占51.4%。

有研究認為裂果與果肉、果皮生長不協(xié)調(diào)有關(guān)[9]。柚果實發(fā)育過程中果肉和果皮生長不同步進行，前期以果皮發(fā)育為主，玉環(huán)柚在7月中旬果皮厚度達到最大，此時果肉僅占總體積的3%～5%，之后果肉發(fā)育加快，果皮被壓縮變薄，9月下旬果實縱向生長基本停止，而橫徑繼續(xù)擴大導(dǎo)致中心柱開裂[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，早香柚自花授粉果實裂瓣數(shù)多為2、3 瓣，且裂瓣多處于對稱位置，表明果實縱向生長緩慢后果實橫向生長拉力是果實中心柱開裂的直接原因，而在異花授粉果實中，大量飽滿種子排列在中心柱周圍，可緩沖果實橫向生長拉力，使果實內(nèi)裂率降低，這是種子在減輕果實內(nèi)裂上發(fā)揮的物理性作用。

在代謝水平上，異花授粉后種子產(chǎn)生的激素、多胺等內(nèi)源物質(zhì)可調(diào)控果實生長發(fā)育過程。沙田柚異花授粉后果實中生長促進類激素和多胺含量顯著增加[25-26]，本研究利用GC-MS 非靶向代謝組方法未檢測到內(nèi)源激素，但發(fā)現(xiàn)異花授粉果實中腐胺含量增加。大量研究表明，多胺可促進幼果細胞分裂，與果實膨大密切相關(guān)[27]。本研究結(jié)果表明，早香柚異花授粉后果實內(nèi)裂率降低，除種子起到保護中心柱的物理性作用外，可能還與多胺促進細胞分裂使中心柱發(fā)育充實有關(guān)。

前人研究表明，異花授粉后果實中可溶性糖、有機酸、油脂、蛋白、維生素、揮發(fā)性物質(zhì)以及木質(zhì)素等物質(zhì)的含量及組分發(fā)生變化，直接影響果實內(nèi)在品質(zhì)[19，28-29]。本研究中，早香柚異花授粉后汁胞中可溶性糖、有機酸和氨基酸含量均發(fā)生變化，這些物質(zhì)含量的變化不僅直接影響果實風(fēng)味，還能作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)參與果肉汁胞發(fā)育，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量變化可能與果實膨大和內(nèi)裂有關(guān)。除初級代謝外，異花授粉產(chǎn)生的大量種子中還含有多種次生代謝物質(zhì)，包括類檸檬苦素、生物堿、酚酸、類黃酮等[30-31]，這些生物活性物質(zhì)的合成大多與莽草酸代謝途徑有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，早香柚異花授粉后果實中莽草酸、芥子酸、奎寧酸和苯甲酸含量降低，表明異花授粉后果實中莽草酸途徑及其下游的次生代謝發(fā)生變化，但這些代謝變化與果實內(nèi)裂及果實品質(zhì)形成的關(guān)系還有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，早香柚果實內(nèi)裂與種子有無及多少密切相關(guān)；果實縱向生長緩慢后，果實橫向生長拉力是中心柱開裂的直接原因；異花授粉后，種子不僅具有保護中心柱的物理作用，還可通過激素、多胺等內(nèi)源物質(zhì)調(diào)控汁胞可溶性糖、有機酸、氨基酸以及莽草酸途徑及其下游次生代謝過程，使果實在外觀和風(fēng)味性狀上表現(xiàn)明顯的花粉直感效應(yīng)，其中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量變化可能與果實膨大和內(nèi)裂有關(guān)。本研究為異花授粉在柚生產(chǎn)中的合理應(yīng)用以及進一步研究柚果實內(nèi)裂調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。