全反式維甲酸對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

羅興永， 董源源， 龍 娟， 童 英

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生長(zhǎng)代謝與衰老研究中心, 成都 610064 )

1 引 言

全反式維甲酸(All-trans-retinoic acid，ATRA) 屬于類維甲酸家族成員，是維生素A的活性代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡和胚胎發(fā)育中具有重要作用[1].ATRA被認(rèn)為是第一個(gè)腫瘤治療的靶向藥物，在臨床上主要用于治療急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)[1].APL是急性髓系白血病的一種獨(dú)特亞型，表達(dá)早幼粒細(xì)胞白血病-維甲酸受體α(PML-RAR-α)癌蛋白，其特征在于纖溶酶產(chǎn)量增加導(dǎo)致嚴(yán)重出血.ATRA通過(guò)抑制纖溶酶的產(chǎn)生和降低膜聯(lián)蛋白A2和S100A100的表達(dá)在誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及改善出血癥狀等方面發(fā)揮了重要作用[1].ATRA的臨床應(yīng)用將APL從一種高度致命的癌癥轉(zhuǎn)化為一種高度可治愈的疾病[2].

由于ATRA在APL中的臨床應(yīng)用取得了巨大的成功，ATRA在治療多種人類惡性腫瘤方面得到了廣泛的研究.然而，APL的遺傳和生理病理簡(jiǎn)單性在人類腫瘤中是相當(dāng)罕見(jiàn)的，APL因此是目前發(fā)現(xiàn)的唯一對(duì)ATRA作出有效反應(yīng)的惡性腫瘤[2].越來(lái)越多的研究表明，ATRA可以增強(qiáng)其它化療藥物的抗癌效應(yīng)：在體外，ATRA與順鉑聯(lián)合應(yīng)用可顯著抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡[3].ATRA與多西他奇(docetaxel)或泰索帝(taxotere)聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)[4].有機(jī)砷化三聚氰胺(Organic arsenical melarsoprol)與ATRA聯(lián)合使用可明顯抑制人乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞的體外和體內(nèi)生長(zhǎng)[2].ATO(arsenic trioxide)還可與ATRA協(xié)同抑制人肝癌、乳腺癌和肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡[2].

受細(xì)胞系以及培養(yǎng)條件的影響，不同細(xì)胞對(duì)特定藥物的耐受性不同，在ATRA的使用中發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞的ATRA有效濃度不同：類維生素A 6-OH-11-O-羥基菲汀(6-OH-11-O-hydroxyphenantrene，IIF)是ATRA的合成衍生物[5].體外研究表明IIF可有效抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6].40 μmol/L和80 μmol/L的IIF處理24h可顯著誘導(dǎo)SaOS-2細(xì)胞凋亡，但對(duì)U2OS細(xì)胞沒(méi)有明顯效應(yīng)[7].用5～50 μmol/L的ATRA處理PANC-1細(xì)胞1-6 d，可呈劑量/時(shí)間依賴性抑制PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)[8].1～10 μmol/L維甲酸衍生物在多種腫瘤細(xì)胞中具有顯著的抗腫瘤作用，也有文獻(xiàn)報(bào)道10倍低濃度(100～500nm的)ATRA可以抑制人髓母細(xì)胞(Medulloblastoma ，MB)的增殖[2].但是，一些研究發(fā)現(xiàn)吸煙者如果攝入維甲酸會(huì)導(dǎo)致肺癌發(fā)病率增高[9]，暗示維甲酸可能具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用.在五種鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinom，SCC)細(xì)胞中，20 nmol/L ATRA可導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)增加30%，而40～100 nmol/L ATRA則可將細(xì)胞增殖減少20～30%[10].

硼替佐米(Bortezomib，BTZ，商品名Velcade，PS-341)是用于治療多發(fā)性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)的臨床藥物.研究表明BTZ通過(guò)可逆地抑制蛋白酶體β5亞基的糜蛋白酶樣活性，從而抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng)[11]，進(jìn)而通過(guò)各種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，包括抑制核因子-Kβ的活性，激活p53，積累錯(cuò)折疊蛋白等[11].

不同濃度的ATRA是否會(huì)對(duì)胰腺癌PANC-1和骨肉瘤U2OS細(xì)胞產(chǎn)生不同的影響還未有研究，因此在本文中我們用濃度跨度較大的ATRA處理這兩種細(xì)胞.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的ATRA對(duì)PANC-1和U2OS細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不同，低濃度的ATRA促進(jìn)PANC-1和U2OS細(xì)胞生長(zhǎng)，高濃度則抑制其生長(zhǎng).我們還發(fā)現(xiàn)，BTZ可以通過(guò)凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞死亡，ATRA的促生長(zhǎng)或抑生長(zhǎng)的作用都可被BTZ調(diào)控，同時(shí)低濃度ATRA與BTZ聯(lián)合應(yīng)用會(huì)降低凋亡前蛋白Procaspase3的表達(dá)，表明聯(lián)合用藥可能影響細(xì)胞的凋亡途徑.

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 骨肉瘤細(xì)胞U2OS和胰腺癌細(xì)胞PANC-1購(gòu)買自CCTCC，保存在四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生長(zhǎng)代謝衰老研究中心.

2.1.2 主要試劑 ATRA購(gòu)于sigma公司(R2625)；BTZ購(gòu)于sigma公司(S1013)；MTS購(gòu)于普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)、0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)hyclone公司；二甲亞砜(DMSO) 購(gòu)于Sigma公司；ECL 顯影液，PVDF 膜購(gòu)于Milipore 公司；蛋白分子 Marker購(gòu)于Fermentas 公司；PMSF購(gòu)自MERCK公司；蛋白定量試劑盒購(gòu)自BIO-RAD公司；甘氨酸、SDS購(gòu)自Amresco公司；APS，TEMED，pH 6.8 Tis-HCl 與pH 8.8 Tis-HCl，脫脂奶粉，10%SDS溶液，30% 丙烯酰胺ACR購(gòu)于Thermo公司；相關(guān)抗體：Actin(Sungene biotech-6G3；1：6000稀釋)；Caspase3(CST-9662；1：1000稀釋)，羊抗兔IgG購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology.

2.2 方 法

2.2.1 細(xì)胞存活率的檢測(cè) 骨髓瘤細(xì)胞U2OS和胰腺癌細(xì)胞PANC-1培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%雙抗DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，使用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，使用臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，96孔板中每孔加入10 000個(gè)細(xì)胞，37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育12 h，細(xì)胞密度為80%左右加入ATRA處理24 h，換液之后每孔加入10 μL的MTS，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育指定時(shí)間(U2OS 2 h，PANC-1 3 h)，然后在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光值.

實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3組：藥物實(shí)驗(yàn)組(培養(yǎng)基+細(xì)胞+藥物)，藥物對(duì)照組(培養(yǎng)基+細(xì)胞+DMSO)和空白對(duì)照組(培養(yǎng)基)，每個(gè)組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔.

細(xì)胞存活率的計(jì)算：細(xì)胞存活率=(藥物實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值)/(藥物對(duì)照組吸光度值-空白對(duì)照組吸光度值)*100%

2.2.2 Western-blotting(WB) 常規(guī)方法進(jìn)行Western雜交.收集細(xì)胞沉淀置于冰上，EBC裂解液裂解30 min，期間每間隔10 min漩渦震蕩儀震蕩30 s然后4 ℃15 000 g離心20 min，將上清移入新EP管并測(cè)定蛋白濃度.蛋白樣品經(jīng)12%SDS-PAGE膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜， 5%脫脂牛奶封閉1h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST漂洗3×10 min，二抗室溫孵育1h，TBST漂洗3×10 min.最后經(jīng)ECL顯影液，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像.

2.2.3 數(shù)據(jù)處理 采用Graphpad prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在結(jié)果圖中以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)至少2次，組間設(shè)置6個(gè)重復(fù)組，以one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)方法分析組間差異，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 ATRA濃度不同對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不同

實(shí)驗(yàn)中用不同濃度的ATRA(5、10、20、40、80、100、150、200 μmol/L)分別處理PANC-1和U2OS細(xì)胞24h，采用MTS法檢測(cè)ATRA對(duì)細(xì)胞活力的影響.結(jié)果顯示，ATRA對(duì)PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)依據(jù)濃度的不同而有不同的效果.在PANC-1細(xì)胞中，低濃度(20，40，80，100 μmol/L)的ATRA表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)生長(zhǎng)的趨勢(shì)(P<0.001).相反的，高濃度(200 μmol/L)ATRA可明顯抑制PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng).有趣的是，極低濃度的ATRA(5 μmol/L)則表現(xiàn)出對(duì)PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(P<0.05)，抑制率為89.50%±0.199(圖1A，表1).在U2OS細(xì)胞中，我們也觀察到類似的現(xiàn)象.低濃度(10，20，40，80 μmol/L)的ATRA可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，特別是20，40 μmol/L(P<0.01).隨著濃度的升高， 150，200 μmol/L的ATRA表現(xiàn)出對(duì)U2OS細(xì)胞生長(zhǎng)的顯著抑制作用(P<0.001)(圖1B，表1).與PANC-1細(xì)胞不同的是，5 μmol/L的ATRA并不能抑制U2OS細(xì)胞的生長(zhǎng)，這個(gè)獨(dú)特現(xiàn)象暗示PANC-1細(xì)胞中可能存在與U2OS細(xì)胞不同的ATRA應(yīng)答方式.

圖1 ATRA對(duì)PANC-1和U2OS細(xì)胞活力的影響

3.2 低濃度ATRA的促生長(zhǎng)效應(yīng)可被BTZ抑制

蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib，BTZ)是常用的一種臨床抗癌藥物，聯(lián)合應(yīng)用BTZ和其它化療藥物顯示出較強(qiáng)的抗癌活性.為了檢測(cè)ATRA和BTZ聯(lián)合應(yīng)用對(duì)細(xì)胞活力的影響，用40 nmol/L的BTZ和40 μmol/L的ATRA聯(lián)合或單獨(dú)處理PANC-1細(xì)胞或U2OS細(xì)胞24h，MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力.結(jié)果表明，單獨(dú)使用40 nmol/L 的BTZ可以明顯抑制PANC-1和U2OS細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.001)，當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用ATRA和BTZ時(shí)，細(xì)胞活力同樣受到明顯抑制(P<0.001)(圖2，表2).聯(lián)合用藥組和ATRA單獨(dú)用藥組相比有顯著差異，而與BTZ單獨(dú)用藥組相比沒(méi)有顯著差異(圖2)，這表明40 μmol/L ATRA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可被40 nmol/L的BTZ抹平，因此，BTZ可以抑制低濃度ATRA的促生長(zhǎng)效應(yīng).

表1 不同濃度ATRA處理后 PANC-1和U2OS細(xì)胞的活力

圖2 低濃度ATRA單獨(dú)或聯(lián)合BTZ對(duì)PANC-1和U2OS細(xì)胞活力的影響

表2 低濃度ATRA單獨(dú)或聯(lián)合BTZ用藥對(duì)PANC-1和U2OS細(xì)胞活力的影響

3.3 高濃度ATRA抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力可被BTZ增強(qiáng)

為進(jìn)一步檢測(cè)BTZ對(duì)ATRA作用的影響，我們繼續(xù)進(jìn)行了高濃度ATRA聯(lián)合BTZ的用藥實(shí)驗(yàn).采用200 μmol/L ATRA和40 nmol/L BTZ單獨(dú)或聯(lián)合處理PANC-1或U2OS細(xì)胞24 h，MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力.結(jié)果顯示，高濃度的ATRA可以顯著抑制PANC-1和U2OS細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.001)，聯(lián)合應(yīng)用ATRA和BTZ可明顯抑制PANC-1和U2OS細(xì)胞的生長(zhǎng)(P<0.001)(圖3，表3)，與單獨(dú)應(yīng)用ATRA相比，聯(lián)合用藥組都具有顯著差異(PANC-1,P<0.001;U2OS,P<0.01)；與單獨(dú)應(yīng)用BTZ相比，聯(lián)合用藥同樣具有顯著差異(P<0.01)(圖3).

3.4 ATRA和BTZ聯(lián)合用藥可調(diào)控凋亡前體蛋白的水平

BTZ能夠可逆地抑制蛋白酶體β5亞基的糜蛋白酶樣活性，從而抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng)以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20-21].我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在U2OS細(xì)胞中， BTZ處理可誘導(dǎo)凋亡蛋白的切割以增加活性Caspase3的水平，并且這種作用呈劑量依賴性.40 μmol/L的ATRA并不影響凋亡前體蛋白Procaspase3的含量和切割成熟(圖4).而40 μmol/L ATRA與40 nmol/L BTZ聯(lián)合處理細(xì)胞時(shí)，雖然并不影響活性Caspase3的水平，卻可以明顯降低凋亡前體蛋白Procaspase3的表達(dá)，表明聯(lián)合用藥有可能通過(guò)非Caspase3切割途徑影響細(xì)胞的凋亡.

圖3 高濃度ATRA單獨(dú)或聯(lián)合BTZ對(duì)PANC-1和U2OS細(xì)胞活力的影響

表3 高濃度ATRA單獨(dú)或聯(lián)合BTZ對(duì)PANC-1和U2OS細(xì)胞活力的影響

圖4 ATRA和BTZ聯(lián)合用藥可降低凋亡前體蛋白的水平

ATRA作為一種維生素A的活性代謝物，目前在臨床上用于治療急性早幼粒白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)[1].ATRA通常被認(rèn)為是一種抗癌化療藥物，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用.但隨著研究的深入，卻發(fā)現(xiàn)了一些有趣的現(xiàn)象.一些臨床研究表明膳食維甲酸具有促進(jìn)腫瘤的作用：每天高劑量的β-胡蘿卜素可加速DMBA和TPA -誘導(dǎo)的皮膚乳頭瘤形成并增加腫瘤的產(chǎn)生[12]；給benzo[a]pyrene-治療的倉(cāng)鼠補(bǔ)充高β-胡蘿卜素飲食增加了其呼吸道癌的發(fā)生率[13]. ATRA衍生物IIF對(duì)骨肉瘤細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)也呈時(shí)間和劑量依賴性，但對(duì)U2OS細(xì)胞凋亡則沒(méi)有明顯影響[7].與這些結(jié)果類似的是，我們的結(jié)果表明，在胰腺癌PANC-1和骨肉瘤U2OS細(xì)胞中，ATRA對(duì)細(xì)胞活力的影響呈現(xiàn)雙面效應(yīng)：低濃度促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)而高濃度則抑制生長(zhǎng).

與我們的結(jié)果不同的是，Guo曾報(bào)道5～50 μmol/L的ATRA可抑制PANC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)[8].這種不同可能與應(yīng)用的培養(yǎng)基有關(guān). Guo的實(shí)驗(yàn)采用RPMI-1640培養(yǎng)基，而我們采用的是DMEM培養(yǎng)基.PANC-1細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下對(duì)ATRA應(yīng)答方式的不同值得深入研究.

ATRA抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)分化的作用讓它在癌癥治療方面獲得了廣泛的研究，特別是聯(lián)合用藥的探索.5 μmol/L ATRA通過(guò)增加肝細(xì)胞癌腫瘤起始細(xì)胞(HCC TICs)分化，能有效增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)順鉑(cisplatin)的敏感性[3].5 μmol/L ATRA可增加多西他賽(docetaxel)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡[14].在紫杉醇治療之前，將乳腺癌細(xì)胞與0.01 μmol/L的ATRA孵育3天，可增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞死亡[15]. 0.1、1和10 μmol/L ATRA能強(qiáng)烈增強(qiáng)As2O3誘導(dǎo)的人肝癌、乳腺癌和肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16].不同的細(xì)胞對(duì)ATRA的敏感性不同.在本文中我們發(fā)現(xiàn)，低濃度的ATRA與BTZ聯(lián)合應(yīng)用可以逆轉(zhuǎn)ATRA的促生長(zhǎng)效應(yīng)，高濃度的ATRA與BTZ聯(lián)合應(yīng)用可以顯著增強(qiáng)ATRA抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，表明在PANC-1和U2OS細(xì)胞中，高濃度ATRA和BTZ聯(lián)合使用才有顯著的協(xié)同作用，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療的敏感性，達(dá)到更好的治療效果.