下調(diào)miR-616-3p對(duì)補(bǔ)體攻擊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

周建國(guó)，劉如月，韓 楓，劉一亮

（1.商丘市第一人民醫(yī)院骨一科，河南商丘476000；2.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院手足顯微外科，湖南衡陽(yáng)421002）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）作為一類多功能干細(xì)胞，具有分化成多種細(xì)胞的潛能，如心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂細(xì)胞等［1］。因而B(niǎo)MSCs能作為同種異體移植的種子細(xì)胞，參與多種細(xì)胞以及器官損傷等疾病的治療［2］。但BMSCs的臨床應(yīng)用面臨較多困難，例如BMSCs異體移植后存活率較低等。針對(duì)存活率較低的原因，目前認(rèn)為可能是由于宿主補(bǔ)體系統(tǒng)識(shí)別并攻擊BMSCs所致［4］。研究表明，補(bǔ)體系統(tǒng)的活化主要通過(guò)激活補(bǔ)體C3來(lái)實(shí)現(xiàn)，而膜補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白如CD46、CD35以及CD55對(duì)活化物質(zhì)C3b的分解起調(diào)節(jié)作用［5］。micorRNAs是一類由18～24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼RNA小分子，能夠通過(guò)與靶基因信使RNA互補(bǔ)序列結(jié)合抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控中起重要作用［6］。有研究顯示，抑制miR-616-3p表達(dá)能通過(guò)上調(diào)補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46促進(jìn)人慢性髓原白血病細(xì)胞K562抵抗補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒效應(yīng)［5］。因此，miR-616-3p可能通過(guò)調(diào)控CD46表達(dá)參與補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)BMSCs的攻擊作用，但目前尚無(wú)相關(guān)研究。本研究通過(guò)構(gòu)建miR-616-3p低表達(dá)的rBMSCs，探討在大鼠異體血清（allogeneic rat serum,ARS）干預(yù)后，miR-616-3p低表達(dá)對(duì)rBMSCs存活的影響，并闡明miR-616-3p對(duì)ARS攻擊rBMSCs作用產(chǎn)生影響的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 rBMSCs的分離及鑒定

SPF級(jí)健康雄性 Sprague Dawley（SD）大鼠 5只，鼠齡4-6周，體重（200.80±20.53）g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0010。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠，碘伏消毒后，從骨盆上離斷取下股骨。將股骨置于碘伏內(nèi)浸泡5 min后，剔除股骨周圍軟組織，剪斷股骨。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液從截?cái)嗵幘徛龥_洗骨髓腔，收集沖下的骨髓細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液通過(guò)100 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，1000×g離心5 min后，用PBS重懸細(xì)胞，800×g離心5 min，離心3次。將得到的rBMSCs細(xì)胞懸液于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。隨后每2 d換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3代rBMSCs細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測(cè)rBMSCs表面分子標(biāo)志物CD29、CD44、CD45、CD34、CD90的表達(dá)水平。采用成骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)第3代rBMSCs成骨分化21 d，再使用茜素紅和堿性磷酸酶染色觀察rBMSCs成骨分化情況。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將rBMSCs細(xì)胞以1×105個(gè)/ml的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將預(yù)先備好的Lipofectamine 2000與miR-616-3p抑制劑或陰性對(duì)照（含有一段無(wú)意義的對(duì)照序列）試劑混合液加入rBMSCs細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為rBMSCs空白對(duì)照組（blank），陰性對(duì)照組（NC，轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列）和miR-616-3p抑制劑組（抑制劑組，轉(zhuǎn)染miR-616-3p抑制劑）。然后在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 血清制備以及與rBMSCs共培養(yǎng)

取大鼠頸靜脈血5 ml，4℃靜置1 h后低溫1 000×g離心20 min，取上層血清保存至冷凍備用。按后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行分組：①對(duì)照組（Control），rBMSCs不經(jīng)任何處理；②ARS干預(yù)組（ARS），采用10%的ARS與rBMSCs共孵育；③NC+ARS組：采用10%的ARS與轉(zhuǎn)染NC后的rBMSCs共孵育；④抑制劑+ARS組：采用10%的ARS與轉(zhuǎn)染miR-616-3p抑制劑后的rBMSCs共孵育。共培養(yǎng)條件為37℃下共孵育2 h。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)miR-616-3p的表達(dá)水平

使用TRIzol試劑盒提取各組rBMSCs總RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用SYBR綠色熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，內(nèi)參基因?yàn)閁6。所用引物 miR-616-3p-F：5′-ACACTCCAGCTGGGAGTCATTGGAGGGTT T-3′；miR-616-3p-R：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′； U6-F： 5′-CTCGCTTCGGCA GCA CA-3′； U6-R： 5′-AACGCTT CACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)程序：95℃，5 min；95℃，15 s；60℃，10 s；72℃，20 s；40個(gè)循環(huán)；65℃，5 Sec；95℃，50 Sec。采用 2-ΔΔCT法計(jì)算 RNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western Blot檢測(cè)CD46和cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平

取收集各組rBMSCs細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后高溫變性。SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉室溫封閉處理1h后，加入一抗cleaved Caspse-3（1∶500）、CD46（1∶1 000）和GAPDH（1：1 000）低溫孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗goat anti rabbit IgG（1∶10 000）37℃孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，定影后進(jìn)行拍照。結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行灰度值的計(jì)算。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

收集各組rBMSCs細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度5×103/ml，每孔100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔板，37℃培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl MTT（0.5 mg/ml）試劑并置于37℃孵箱中孵育4 h。使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖活性。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和補(bǔ)體攻擊復(fù)合物（MAC）水平

收集各組rBMSCs細(xì)胞，加入0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，以2×104個(gè)/孔細(xì)胞接種于6孔板中。然后1000×g，4℃離心5min處理細(xì)胞后棄上清，加入1mL預(yù)冷的PBS洗滌2次后，加入200 μl Binding Buffer重懸細(xì)胞，然后分別加入10 μl Annexin VFITC和10 μl碘化丙啶（PI），混勻后4℃避光孵育30 min。立刻進(jìn)入流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。取重懸后的rBMSCs細(xì)胞后，加入FITC標(biāo)記的兔抗鼠C5b-9在37℃孵育30 min后，立刻進(jìn)入流式細(xì)胞儀檢測(cè)MAC沉積情況。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)靶向關(guān)系

利用Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將293T 細(xì)胞與 pGL3-CD46 3′-UTR WT/Mut質(zhì)粒、miR-161-3p mimics/陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染48 h。根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組以上組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rBMSCs的鑒定

如圖1顯示，第3代rBMSCs細(xì)胞表面CD29、CD44和CD90呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率分別為（90.74±3.18）% 、（91.82±2.91%） 和 （84.86±4.29）%；而CD34、CD45呈陰性表達(dá)，表達(dá)率僅為（3.12±1.12）%和（4.52±1.31）%。對(duì)第3代 rBMSCs細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)21 d后，茜素紅染色結(jié)果顯示rBMSCs出現(xiàn)大量橘紅色鈣結(jié)節(jié)，礦化能力增強(qiáng)；堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示rBMSCs細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量藍(lán)黑色沉淀，如圖2所示。表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為rBMSCs。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)rBMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)

圖2 rBMSCs成骨誘導(dǎo)分化21 d后染色觀察（×200） 2a:茜素紅染色 2b:堿性磷酸酶染色

2.2 ARS干預(yù)誘導(dǎo)rBMSCs中miR-616-3p表達(dá)

與空白和NC組比較，抑制劑組rBMSCs中miR-616-3p的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，ARS組和NC+ARS組rBMSCs中miR-616-3p的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與NC+ARS組比較，抑制劑+ARS組rBMSCs中miR-616-3p的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），如圖3所示。

2.3 抑制miR-616-3p表達(dá)對(duì)ARS干預(yù)的rBMSCs細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，ARS組和NC+ARS組rBMSCs中細(xì)胞增殖活性顯著降低（P＜0.05）；與NC+ARS組比較，抑制劑+ARS組rBMSCs中細(xì)胞增殖活性顯著升高（P＜0.05），如圖4所示。

圖3 各組rBMSCs中miR-616-3p的表達(dá)水平 1a:轉(zhuǎn)染后rBMSCs中miR-616-3p表達(dá)水平 1b:被ARS處理的轉(zhuǎn)染后rBMSCs中miR-616-3p表達(dá)水平 與對(duì)照組或空白組比較，*P＜0.05；與NC+ARS組比較，#P＜0.05

圖4 各組rBMSCs細(xì)胞的增殖活性比較 與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與NC+ARS組比較，#P＜0.05

2.4 抑制miR-616-3p表達(dá)對(duì)ARS干預(yù)的rBMSCs凋亡的影響

與對(duì)照組比較，ARS組和NC+ARS組rBMSCs凋亡率顯著提高（P＜0.05），凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表達(dá)水平明顯增加（P＜0.05）；與NC+ARS組比較，抑制劑+ARS組rBMSCs凋亡率顯著降低（P＜0.05），cleaved Caspase-3的表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），如圖5所示。

2.5 抑制miR-616-3p表達(dá)對(duì)ARS干預(yù)的rBMSCs MAC沉積的影響

與對(duì)照組比較，ARS組和NC+ARS組rBMSCs中MAC沉積顯著增高（P＜0.05）；與NC+ARS組比較，抑制劑+ARS組rBMSCs中MAC沉積則顯著降低（P＜0.05），如圖6所示。

2.6 抑制miR-616-3p促進(jìn)rBMSCs中CD46蛋白的表達(dá)

與空白組和NC組比較，抑制劑組rBMSCs中CD46蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與對(duì)照組比較，ARS組和NC+ARS組rBMSCs中CD46蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與NC+ARS組比較，抑制劑+ARS組rBMSCs中CD46蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），如圖7所示。

2.7 CD46是miR-616-3p靶基因

通過(guò)TargetScan7.1生物信息軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CD46 3’-UTR存在與miR-616-3p結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC mimics組比較，miR-616-3p mimics轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，pGL3-CD46 3′-UTR WT的報(bào)告基因活性明顯下降（P＜0.05），而 pGL3-CD46 3′-UTR Mut的報(bào)告基因活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），如圖8所示。

圖5 各組rBMSCs凋亡水平比較 5a:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡5b:Western blot檢測(cè)cleaved Caspase-3表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與NC+ARS組比較，#P＜0.05圖6 各組rBMSCs中MAC沉積水平比較 與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與NC+ARS組比較，#P＜0.05圖7 各組rBMSCs中CD46蛋白表達(dá)水平 7a:轉(zhuǎn)染后rBMSCs中CD46蛋白表達(dá)水平 7b:被ARS處理的轉(zhuǎn)染后rBMSCs中CD46蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組或空白組比較，*P＜0.05；與NC+ARS組比較，#P＜0.05

圖8 CD46與miR-616-3p靶向調(diào)控關(guān)系 與NC mimics組比較，*P＜0.05

3 討論

研究表明，BMSCs具有較強(qiáng)的增殖能力和較低的免疫特性，是組織工程種子細(xì)胞的最佳來(lái)源［7］。在特定條件下，BMSCs可以分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等［8］。BMSCs不僅能分泌多種神經(jīng)生長(zhǎng)因子，而且能促進(jìn)局部血管生成和血管重塑［9］。然而，補(bǔ)體系統(tǒng)、腫瘤等潛在因素會(huì)影響B(tài)MSCs的增殖和分化，如何緩解或避免這些潛在的因素，還需要更加深入的探索。

補(bǔ)體系統(tǒng)在自身免疫性疾病的病原發(fā)生中起著復(fù)雜的作用［10］。補(bǔ)體系統(tǒng)由三個(gè)不同的級(jí)聯(lián)組成：經(jīng)典的、替代的和凝集素補(bǔ)體途徑。所有這些級(jí)聯(lián)都集中在C3轉(zhuǎn)化酶的形成上傳播補(bǔ)體級(jí)聯(lián)。有報(bào)道稱，補(bǔ)體系統(tǒng)C3中心成分的缺失顯著降低了移植物抗宿主?。℅VHD）相關(guān)的死亡率和發(fā)病率，C3調(diào)節(jié)小鼠GVHD中Th1/Th17的極化率［11］，表明補(bǔ)體系統(tǒng)的缺失有助于抗GVHD相關(guān)的損傷。BMSCs與自體血清孵育后有細(xì)胞損傷，并且檢測(cè)到補(bǔ)體激活誘導(dǎo)的補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物（MAC）的形成［12］，提示補(bǔ)體可以識(shí)別自體BMSCs并攻擊它。本研究發(fā)現(xiàn)，異體血清能抑制rBMSCs細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和MAC沉積。說(shuō)明補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖凋亡有明顯作用，并且該作用與補(bǔ)體激活后產(chǎn)生的膜攻擊復(fù)合物MAC的沉積相關(guān)。

補(bǔ)體激活主要由補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白調(diào)控，膜補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白在不同細(xì)胞群中廣泛表達(dá)，是維持補(bǔ)體級(jí)聯(lián)穩(wěn)態(tài)的蛋白質(zhì)［13］。膜補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46通過(guò)充當(dāng)因子I（FI）介導(dǎo)的C3b裂解的輔因子蛋白來(lái)調(diào)節(jié)C3的活化。研究發(fā)現(xiàn)重組的免疫特性分子CD46能降低補(bǔ)體激活引起的血清溶血以及殺菌活性，提示CD46對(duì)補(bǔ)體激活具有負(fù)調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步觀察到重組的免疫特性I因子（FI）顯著降低了CD46對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的抑制作用，這很可能是由于血清中天然免疫特性FI的抗體阻斷所致。CD46能夠與FI直接相互作用，形成CD46-FI復(fù)合物，進(jìn)而調(diào)控補(bǔ)體活性［14］。CD46作為一種膜結(jié)合的輔因子，通過(guò)其控制補(bǔ)體激活的能力，在保護(hù)宿主細(xì)胞免受補(bǔ)體攻擊中發(fā)揮作用，但上游分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

miRNAs能通過(guò)抑制靶基因的翻譯參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平［15］。miRNAs參與了許多病理生理過(guò)程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、器官發(fā)生、侵襲、遷移和凋亡［16］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-616-3p靶向組織因子途徑抑制物2（tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI2）調(diào)控胎盤(pán)組織細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移［17］。而且，miR-616-3p還能通過(guò)調(diào)控CD46的表達(dá)影響人慢性髓原白血病細(xì)胞K562對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的抵抗［5］。說(shuō)明miR-616-3p參與了補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞的攻擊作用。本研究發(fā)現(xiàn)，異體血清能下調(diào)膜補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD46，并且上調(diào)miR-616-3p的表達(dá)，說(shuō)明miR-616-3p和CD46參與了異體血清對(duì)rBMSCs細(xì)胞攻擊作用。該結(jié)果驗(yàn)證了CD46對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的調(diào)控作用，而且還發(fā)現(xiàn)了CD46的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控因子miR-616-3p，進(jìn)一步探討miR-616-3p對(duì)CD46以及補(bǔ)體系統(tǒng)的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-616-3p能顯著上調(diào)CD46的表達(dá)水平，并且能明顯減弱異體血清對(duì)rBMSCs的攻擊作用。另外，雙熒光素酶結(jié)果顯示，miR-616-3p與CD46靶向結(jié)合。因此，miR-616-3p可能通過(guò)靶向調(diào)控CD46表達(dá)影響異體血清對(duì)rBMSCs細(xì)胞的攻擊作用。

綜上所述，抑制miR-616-3p表達(dá)可能通過(guò)靶向上調(diào)CD46表達(dá)，進(jìn)而抑制補(bǔ)體系統(tǒng)對(duì)BMSCs細(xì)胞的攻擊作用。